重組豬細小病毒vp2蛋白、表達該蛋白的重組多角體病毒及其在疫苗制備和病毒診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組豬細小病毒VP2蛋白、表達該蛋白的重組多角體病毒及其在疫苗制備和病毒診斷中的應用。通過對原始VP2蛋白進行改造，使得改造后的VP2蛋白HA效價由213提高到218，進一步的，本發明還獲得了表達該重組豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒，實驗證明，通過該病毒表達的重組VP2蛋白具有免疫原性好、效價高等優點。使用由本發明的VP2蛋白制備得到的豬細小病毒VP2亞單位疫苗免疫初產健康陰性母豬能夠預防由豬細小病毒引起的疾病，而且具有安全、產生抗體快、免疫期持久等優點。此外，本發明應用改造后的VP2蛋白作為抗原包被酶標板，建立了豬細小病毒抗體的間接ELISA方法，靈敏度高、特異性好，為豬細小病毒的診斷以及檢測提供了一種良好的技術手段。
【專利說明】重組豬細小病毒VP2蛋白、表達該蛋白的重組多角體病毒及其在疫苗制備和病毒診斷中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種重組豬細小病毒VP2蛋白、表達該蛋白的重組多角體病毒及其在疫苗制備和病毒診斷中的應用，特別涉及一株自行制備得到的表達VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac-VP2)，該病毒能夠實現在細胞中對VP2蛋白的高效表達，本發明還涉及重組豬細小病毒VP2蛋白在制備豬細小病毒VP2亞單位疫苗以及在制備診斷或檢測豬細小病毒感染的試劑中的應用。本發明屬于生物疫苗和豬細小病毒的檢測與診斷領域。
【背景技術】
[0002]豬細小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，PPV感染的主要對象是孕豬，特別是懷孕前的初產母豬，能夠引起懷孕母豬流產、產死胎、胎兒木乃伊化等，而母體通常缺乏臨診癥狀，此外也會引起其他癥狀。自1966年Mayr和Mahnel發現和證實PPV存在及其致病性以來，國內外學者對其進行了廣泛深入的研究。近年來，PPV感染呈擴大上升趨勢，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失。在我國，潘雪珠于1983年首次分離到了 PPV。此后，在各地陸續分離到了數株PPV，目前，人們發現豬細小病毒經常與其他一些病毒，例如豬圓環病毒2型和豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒等混合感染，導致斷奶仔豬多系統綜合征、皮炎、呼吸道綜合征等，給世界的養豬業造成很大的損失。雖然不同分離株均屬于同一血清型，但可以引起多種臨床癥狀，但都以造成繁殖障礙為主。目前，我國經產母豬及種公豬PPV陽性率高達80%以上。
[0003]由于PPV在細胞中增殖困難，效價不高，而其主要免疫原為VP2蛋白，因此本發明的發明人在2005年從黑龍江省某豬場分離到一株豬細小病毒，經實驗室鑒定為強毒株，馴化克隆后將該毒株命名為PPV BQ-C株。該病毒株已記載在申請號為“201210166453.2”，發明名稱為“豬細小病毒BQ-C株及其在制備豬細小病毒滅活疫苗中的應用”的專利申請中。將PPV BQ-C株的VP2基因，克隆到重組多角體病毒表達載體中，制備獲得了高效價的表達VP2的重組多角體病毒，并開展了豬細小病毒病VP2亞單位滅活疫苗的研制開發工作，篩選培育出免疫原性良好、效價穩定的表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac-VP2)，命名為重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac-VP2株)，并且選擇了最適合制備疫苗的滅活劑、佐劑及其他條件。對制品的生產工藝、安全性、保護率、免疫程序、最小劑量、抗體持續期和保存期等都進行了試驗測定，并獲得了大量的試驗數據，結果證明本疫苗安全有效。在此基礎上，進行了中試生產，經抽樣檢驗，全部符合擬定的質量標準，并對中試產品進行了安全試驗和效力試驗，其結果也證實本疫苗能有效地預防由豬細小病毒引起的母豬繁殖障礙，在實驗室試驗、中間試驗的基礎上，本發明研制出了豬細小病毒(BQ-C株)VP2亞單位滅活疫苗，其結果也證實本疫苗能有效地預防由豬細小病毒引起的母豬繁殖障礙性，進一步驗證了本疫苗的各項質量標準。同時，利用表達的VP2蛋白，制備了疫苗對應的ELISA檢測方法。該方法敏感性好、特異性高，陰陽性臨界值為:0.181+3X0.030=0.271，最后確定判定范圍0.25-0.3為可疑。當0D450nm > 0.3判為陽性；0D450nm < 0.25為陰性。與法國LSI試劑盒的比較符合率為96.7%。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是提供一種改造后的重組豬細小病毒VP2蛋白，該蛋白具有效價高，免疫原性好等優點；
[0005]本發明的目的之二是提供一種穩定表達上述重組豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV ；
[0006]本發明的目的之三是提供所述改造后的重組豬細小病毒VP2蛋白在制備預防豬細小病藥物以及在制備檢測或診斷豬細小病毒抗體試劑，特別是ELISA檢測試劑中的應用。
[0007]本發明的目的之四是提供所述穩定表達重組豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV在制備預防豬細小病藥物中的應用。
[0008]為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段:
[0009]本發明的發明人在利用已有發明的專利毒株PPV BQ-C株基因組為模板的基礎上，對vp2基因序列用軟件進行分析后發現，vp2基因序列在sf9細胞中表達效率較低，分析原因可能是這個序列來源于病毒，由于種屬差異而無法在昆蟲細胞中很好表
[0010]達。因此，為了獲得能夠在細胞中聞表達的天然蛋白序列，同時提聞抗原有效含量，本發明發明人對VP2無效抗原區域進行了分析改造，通過軟件分析并結合具體實驗驗證，最終確定了改造后的vp2的基因序列(SEQ ID N0.2所示)及其編碼蛋白序列(SEQ IDN0.1所示)，將改造后的序列進行了重新合成，然后將改造后合成的vp2基因轉入重組多角體病毒轉移載體PFastBacI中，構建重組質粒pFastPVP2，再將該重組質粒轉入DHlOBac感受態細胞中，通過藍白斑篩選挑取白色菌斑并用PCR的方法鑒定陽性菌落，提取基因組，SP為重組多角體病毒基因-桿粒。使用轉染試劑Cellfectin(Invitrogen)將重組桿粒轉入sf9細胞中，從而得到重組多角體病毒。將得到的重組多角體病毒接種sf9細胞，96小時后收獲細胞，-20°C反復凍融后通過進行western blot、IPMA鑒定,發現VP2蛋白得到成功的表達，并且，通過以上改造，使得同樣條件下表達的改造后的VP2蛋白HA效價由改造前的213提高到218。表達該VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV，命名為pFastBac_VP2。
[0011]因此，本發明提出了一種改造后的重組豬細小病毒VP2蛋白，所述重組豬細小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。及
[0012]編碼所述的重組豬細小病毒VP2蛋白的核苷酸序列，優選的，所述的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0013]含有所述的核苷酸序列的表達載體以及含有所述表達載體的宿主細胞也在本發明的保護范圍之內。
[0014]進一步的，本發明還提出了所述的重組豬細小病毒VP2蛋白在制備豬細小病毒VP2亞單位疫苗以及在制備診斷或檢測豬細小病毒感染的試劑中的應用。
[0015]本發明一種豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗，其特征在于含有所述的重組豬細小病毒VP2蛋白。
[0016] 在本發明所述的豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗中，優選的，所述的豬細小病毒(BQ-C株)VP2亞蛋白采用以下方法進行滅活:[0017]所述的豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗是由0.2% (w/w)的二乙烯亞胺(BEI)在32°C條件下滅活96小時后，加入0.02% (w/w)硫代硫酸鈉終止滅活后，采用15% (v/v)的法國賽比克公司的商品化MontanideTM ISA11R佐劑經乳化后得到。
[0018]在本發明中，乳化工藝是采用法國賽比克公司的商品化MontanideTM ISAllR佐劑，除菌后可直接用于疫苗乳化制備；乳化前將滅活的同批病毒液解凍混合，在無菌室內用勻漿機以200r/min攪拌均勻，然后按照水相抗原與油相佐劑按照體積比8.5:1.5配比混合；乳化程序為先將水相放入乳化器中進行攪拌，然后緩緩加入油相佐劑，以800r/min連續攪拌30分鐘；生產得到的疫苗屬水包油劑型，為了穩定界面和消除氣泡，獲得最佳乳化效果，需要靜止30分鐘后分裝。
[0019]本發明一種用于診斷或檢測豬細小病毒感染的ELISA診斷試劑盒，其特征在于含有所述的重組豬細小病毒VP2蛋白。
[0020]本發明利用表達的VP2蛋白，制備了對應的ELISA檢測方法。該方法敏感、特異，陰陽性臨界值為:0.181+3X0.030=0.271，最后確定判定范圍0.25-0.3為可疑。當0D450nm> 0.3判為陽性；0D450nm < 0.25為陰性。與法國LSI試劑盒的比較符合率為96.7%。
[0021]更進一步的，本發明提出了一種表達豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV，本發明的重組多角體病毒AcMNPV，為在sf9細胞上傳代后的第10代病毒株，該病毒株命名為pFastBac-VP2，分類命名為表達豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.9004，保藏日期為2014年3月26日。其中，由該病毒株表達的豬細小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0022]本發明還提供了所 述的病毒在Sf9細胞中高效表達VP2的關鍵參數。通過改變病毒的高效感染復數(Μ0Ι)、血清濃度，進而改變了病毒復制的生長動力學曲線，使得病毒的后代的質量、細胞外環境，重組蛋白產量都有所改變。VP2的HA效價由213提高到218。
[0023]本發明的一種利用所述重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2)表達豬細小病毒VP2蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0024](I)懸浮培養Sf9細胞，待細胞密度達到5-10 X IO5個細胞/毫升時，停止培養，準
備接毒；
[0025](2)保持搖床轉速在120rpm的條件下，將所述的重組多角體病毒AcMNPV(pFastBac-VP2)以感染復數MOI為10PFU/細胞接入經步驟(1)培養得到的Sf9細胞，120rpm培養24-48小時后收獲病毒；
[0026](3)純化VP2蛋白，即得。
[0027]再進一步的，本發明還提供了所述的病毒在制備豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗中的應用。
[0028]再進一步的，本發明還提供了所述的VP2亞單位滅活疫苗在制備預防由豬細小病毒引起的疾病的生物制品中的用途。特別地，所述的疾病為初產健康陰性母豬發生的母豬
繁殖障礙。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為抗原區改造前后有效和無效抗原區對比圖；其中圖1A為改造前；圖1B為改造后;
[0030]圖2為表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)在sf細胞上培養后的IPMA檢測結果；
[0031]圖2A為接種未表達VP2的野生型重組多角體病毒在sf細胞上培養后的IPMA檢測結果；圖2B為接種表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)在sf細胞上培養后的IPMA檢測結果；
[0032]圖3為VP2蛋白檢測及純化結果。
[0033]圖3A為蛋白初步純化結果；圖3B為第一批蛋白樣品經Ni2+填料親和層析后的電泳結果蛋白純度在20%，總蛋白量很高；圖3C為第二批蛋白樣品經Ni2+填料親和層析后的電泳結果；圖3D為經Ni2+填料親和層析后的蛋白再經30kD超濾離心后的蛋白電泳結果，蛋白純度在30%，總蛋白量很高。
【具體實施方式】[0034]下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
[0035]實施例1:VP2[Porcine parvovirus]GenBank:ACF39501.1 表達基因的改造
[0036]為了提高抗原有效含量，本發明根據基因軟件分析，對VP2無效抗原區域進行了分析改造，提高了抗原有效區域。具體分析改造過程如下:
[0037]I)改造前蛋白序列:
[0038]GenBank 登錄號=ACF395Ol.1
[0039]2)改造前有效抗原區(線軸上面區域)和無效抗原區(線軸下面區域)分析結果如附圖1A所示，改造前I以及改造前2分別為改造前序列的部位I和部位2的分析結果。
[0040]3)本發明針對無效區域進行改造，改造后有效抗原區(線軸上面區域)和無效抗原區(線軸下面區域)結果如附圖1B所示，改造后I以及改造后2分別為改造后序列的部位I和部位2。從圖1結果可以看出改造后的有效抗原區域擴大了 2倍以上。
[0041]4)需要優化和改造的序列:根據以上分析結果，我們確定需要改造和優化的區域序列是:GVSTGSFNNQTEFQXEINLVSFEQXSATSPPTKIYNNDLTXETLGFYPWLPTKPTQ YRYYLSCTRXETLGFYPWLPTKPTQYRYYLSCTRXVGYNTPYMNFXYQHGQLTT SSQELERYTFXMNTLNTYGPLTALNNTAPVFPNGQIffDKELDTDLKPRLHVTAPF VCKNNPPGQLFVKIAXFNADSPQQPRIITYSNFWWKXAENIGNYIPTNIGGIKMFPEYSQLIPRKLY，其中X代表可以在不同載體中進一步優化的序列。
[0042]5 )序列的優化及合成
[0043]通過軟件分析并結合具體實驗驗證，最終確定了改造后的vp2基因序列(SEQ IDN0.2所示)及其編碼蛋白序列(SEQ ID N0.1所示)。
[0044]通過以上改造，同樣條件下表達的VP2蛋白HA效價由213提高到218，由此可見改造后的VP2蛋白HA效價得到明顯提高。
[0045]實施例2:表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)的制備及鑒定
[0046]I毒種來源及標準
[0047]根據新生物制品申報要求，結合本發明獲得的大量的試驗數據，參照《中國獸藥典》(2005年版)，對制苗用毒種進行了鑒定，現將試行規程(草案)中毒種標準進行以下說明。
[0048]1.1毒種來源及培養方法
[0049]本發明所述的毒種為表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)，是本發明人利用PPV BQ-C株基因組為模板，將VP2基因進行改造以后，將VP2基因(SEQID N0.2所示)轉入重組多角體病毒轉移載體pFastBacI中構建重組的質粒pFastPVP2，再將該重組質粒轉入DHlOBac感受態細胞中，通過藍白斑篩選挑取白色菌斑并用PCR的方法鑒定陽性菌落，提取基因組，即為重組多角體病毒基因-桿粒。使用轉染試劑Cellfectin(Invitrogen)將重組桿粒轉入sf9細胞中，從而得到重組多角體病毒。將得到的重組多角體病毒接種sf9細胞，96h后收獲細胞，-20°C反復凍融后通過進行westernblot、IPMA鑒定，發現VP2蛋白得到成功的表達，表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV(pFastBac-VP2)在sf細胞上培養后的IPMA檢測結果如圖2所示。該表達VP2的重組多角體病毒，為在sf細胞上傳代后的第10代病毒株,命名為pFastBac-VP2,分類命名為表達豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為:CGMCC N0.9004，保藏日期為2014年3月26日。其中，由該病毒株表達的豬細小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0050]培養:sf細胞密度為5-10X105個細胞/毫升，感染的MOI為10PFU/細胞，并確保在250mL搖瓶同步感染(轉速120RPM)。42小時以后收獲病毒，此時細胞感染量為90%以上，VP2的HA效價為218，比一般文獻報道的213高32倍。
[0051]1.2 毒種(pFastBac_VP2 株)標準
[0052]1.2.1紅細胞凝集價
[0053]取96孔U型微量反應板，每孔加入25 μ I PBS (0.01mol/L，pH值7.0~7.4)，第一列各孔中加入25 μ I抗原，然后將抗原進行2倍系列稀釋，直至第11孔棄去25 μ I。每孔加入25 μ I PBS,再加入0.6%豚鼠紅細胞懸液25 μ 1，用微量振蕩器混合均勻，置室溫下作用I小時。判定結果時，以50%紅細胞凝集的抗原最高稀釋倍數作為判定終點。
[0054]結果:毒種對豚鼠紅細胞凝集價應不低于1:512。
[0055]1.2.2病毒含量
[0056]以培養液將毒種作連續10倍系列稀釋，每個稀釋度取100 μ I加入96孔細胞培養板中，每個稀釋度作8個重復，隨后加入消化分散的sf9細胞懸浮，每孔100 μ I (細胞含量以3父105/1^)，并設正常細胞培養對照，置221:、含5%的CO2培養箱中培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，細胞固縮，聚集，顆粒增多，有的細胞融合、脫落、出現較多空隙則判為CPE。觀察7日，記錄細胞病變的孔數，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID5(I。
[0057]結果:每毫升病毒液不低于106_°TCID5。。
[0058]1.2.3免疫原性
[0059] 將毒種接種sf9細胞進行增殖，收獲病毒液，純化獲取VP2蛋白，用BEI滅活后，加MontanideTMISA15AVG佐劑混合乳化制成水包油型滅活疫苗，用健康易感初產母豬(PPVHI抗體效價不高于1:8) 5頭，配種前肌肉注射上述制備得到的滅活疫苗2ml，在妊娠后35~40日，連同條件相同的對照豬5頭，滴鼻并經肌肉注射豬細小病毒BQ-C株各2ml(106_°TCID5Q)，攻毒后40日剖殺所有豬。對照組應至少4頭出現死胎、木乃伊胎或胎兒重吸收等繁殖障礙癥狀，免疫組應至少4頭保護。
[0060]1.2.4純凈檢驗
[0061]對建立的表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)的原始種子批第10~11代、基礎種子批第12~21代和生產種子批第22~25代進行了細菌、霉菌、支原體檢驗，并對第11、12和24代次毒種進行了外源病毒的檢驗，結果表明，本發明建立的原始種子批、基礎種子批、生產種子批均無細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染，均純凈。 [0062]1.2.5毒種使用代次
[0063]將原始得到的表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)，在sf9細胞上連續傳40代(即在菌種保藏編號為XX的菌株基礎上連續傳代30代)，測定了每一代病毒的TCID5tl,選擇第15、20、25、30、35、40代病毒表達的VP2用BEI滅活后，分別加Montanide?ISA15AVG佐劑混合乳化制成水包油型滅活疫苗，接種5月齡后備豬，妊娠35天時進行攻毒。
[0064]結果表明，病毒在sf9細胞上傳代，第10代以后(包括第10代病毒，即菌種保藏編號為CGMCC N0.9004的病毒株)各代次病毒含量穩定，均不低于106_ciTCID5tl，且表達蛋白HA效價均在29以上，已經達到了做疫苗的標準。
[0065]攻毒試驗表明，第10、15、20、25、30代病毒制備的疫苗免疫豬在對BQ-C株攻擊的保護性無顯著差異，胎兒均健康存活。根據以上結果，為保證生產毒種良好的免疫原性和安全性，本發明確定了病毒的傳代最高次數在30代，原始毒種為10~13代，基礎毒種為第14~25代，生產用毒種最高傳代次數限制在3代(第25~27代)以內。
[0066]1.2.6毒種保存期的確定
[0067]將表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)株濕毒保存在_20°C和_70°C下，于保存后不同時間取樣進行HA效價和TCID5tl測定，結果顯示濕毒于-20°C凍存18個月、于-70°C保存30個月時毒價開始明顯下降；凍干毒保存在-20°C和_70°C下，于保存后每年取樣進行HA效價和TCID5tl測定。結果在-20°C下保存36個月的病毒的效價略有下降，保存48個月病毒的HA效價和TCID5tl值明顯下降，而在-70 V下保存48個月病毒的HA效價和TCID5tl沒有明顯的變化，保存60個月下降明顯。考慮到在病毒保存時存在的其他不利因素，保證病毒保存期可靠性，所以將表達VP2的重組多角體病毒AcMNPV(pFaStBac-VP2株)濕毒在_20°C的保存期定為12個月，在-70°C的保存期定為24個月。
[0068]2表達重組豬細小病毒VP2蛋白
[0069]利用所述重組多角體病毒AcMNPV (pFastBac_VP2株)表達豬細小病毒VP2蛋白的方法，包括以下步驟:
[0070](I)懸浮培養Sf9細胞，待細胞密度達到5-10 X IO5個細胞/毫升時，停止培養，準
備接毒；
[0071](2)保持搖床轉速在120rpm的條件下，將所述的重組多角體病毒AcMNPV以感染復數MOI為10PFU/細胞接入經步驟(1)培養得到的Sf9細胞，120rpm培養42小時后收獲病毒，此時細胞感染量為90%以上，VP2的HA效價為218，比一般文獻報道的213高32倍；
[0072](3)純化VP2蛋白，采用His標簽蛋白純化試劑盒(北京天恩澤(http://www.tiandz.com)—站式His標記蛋白質微量純化套裝)制備蛋白，具體方法參考說明書。純化后進行蛋白濃度測定。即得。[0073]實施例3VP2亞單位滅活疫苗的制備
[0074]豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗的制備工藝流程是按照目前已經成熟的商品化疫苗制備工藝制備。從實驗室制備的3批疫苗和中間試制的5批疫苗質檢結果來看，用該工藝流程制備的疫苗產品質量穩定，效檢結果完全符合所制定的質量標準。
[0075]1VP2亞單位液的制備
[0076]取制備好的重組多角體病毒AcMNPV第10代病毒pFastBac_VP2株(菌種保藏編號為:CGMCC N0.9004)，按照感染復數為10PFU/細胞接種Sf9無蛋白培養基，加3%小牛血清，細胞密度為10X IO5個細胞/毫升，培養42h收毒，此時細胞感染量為90%以上。采用His標簽蛋白純化試劑盒(北京天恩澤(http://www.tiandz.com) 一站式His標記蛋白質微量純化套裝)制備蛋白，具體方法參考說明書。純化后進行蛋白濃度測定。
[0077]2滅活工藝
[0078]選擇終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液或終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、
0.4%的二乙烯亞胺(BEI)對VP2亞單位液分別進行滅活比較試驗，試驗結果表明，0.2% (w/w)的BEI在32°C條件下96小時后可將VP2及其他殘余微生物完全滅活，而且，試驗結果表明BEI對細胞的損傷較小；抗原加入0.3%的甲醛溶液，經37°C滅活48小時亦可達到完全滅活病毒的目的；但甲醛具有強刺激性，如果疫苗中殘留游離的甲醛進入動物機體，會產生不良反應。因而最終確定用0.2% (w/w)的BEI在32°C條件下滅活96小時后，加入0.02%(w/w)硫代硫酸鈉終止滅活。
[0079]3乳化工藝
[0080]采用法國賽比克公司的商品化Montanide? ISAllR佐劑，除菌后可直接用于疫苗乳化制備；乳化前將滅活的同批VP2亞單位液液解凍混合，在無菌室內用勻漿機以200r/min攪拌均勻，然后按照水相抗原與油相佐劑按照體積比8.5:1.5的配比混合；乳化程序為先將水相放入乳化器中進行攪拌，然后緩緩加入油相佐劑，以800r/min連續攪拌30分鐘；生產得到的疫苗屬水包油劑型，為了穩定界面和消除氣泡，獲得最佳乳化效果，需要靜止30分鐘后分裝。
[0081]4半成品檢驗質量標準
[0082]4.1無菌檢驗
[0083]按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。
[0084]4.2VP2含量測定
[0085]采用HA測定法。每毫升VP2液不低于29HA。
[0086]4.3滅活檢驗
[0087]取滅活后的病毒液，按病毒液與生長液1: 10的比例接種于sf9細胞3瓶(細胞含量以2X106/ml)，22°C培養觀察5日，對無病變者再盲傳3代，同時設病毒對照。結果無細胞病變，即為滅活完全。實驗室生產的3批半成品均合格，即豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗 1201,1202 和 1203。
[0088]5關于成品檢驗質量標準
[0089]5.1安全檢驗標準
[0090] 為了保證疫苗的安全性，本發明對實驗室制備的5批疫苗先后進行了 “對小白鼠的安全性試驗”、“對仔豬單劑量接種、單劑量重復接種、一次性超劑量(2倍劑量)接種的安全性試驗”、“對后備母豬單劑量接種、單劑量重復接種、一次性超劑量(2倍劑量)接種的安全性試驗”。試驗結果表明:各免疫動物單劑量接種、單劑量重復接種、一次性大劑量接種后，豬只狀態均良好，采食飲水正常，無異常反應；疫苗接種后對妊娠母豬的繁殖功能也無明顯影響。以上試驗均證明疫苗是安全的。通過試驗觀察本發明總結出只要接種疫苗后21日內不出現局部紅腫、潰瘍、糜爛以及神經萎縮、采食減少等現象，以后就不會出現因為疫苗接種而引起的不良反應，就可以證明疫苗的安全性。因此，在試行規程(草案)中規定:用10~20kg健康易感仔豬(HI抗體效價不高1:8) 2頭，各深部肌肉注射疫苗4ml，另取條件相同的2頭豬不接種作為對照，連續觀察21日。在觀察期內應不出現由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反應。
[0091]5.2效力檢驗標準的制定
[0092]5.2.1抗體效價與免疫攻毒保護相關性試驗
[0093]將安全性試驗合格的I批豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗1201，按照不同劑量0.5ml/頭份、lml/頭份、2ml/頭份、4ml/頭份分別免疫3~5月齡的健康后備母豬(PPVHI抗體不高于8)，并以106_°TCID5Q/ml PPV BQ-C株第10代強毒4ml攻擊，以確定HI抗體滴度與免疫攻毒保護的相關性。試驗結果表明，當血清HI抗體效價在不低于1:64時，母豬產仔成活率達97.5%，其中一組中有一頭豬仔流產，但PCR檢測仔豬病毒分離率為0，也無其他引起母豬流產的病原感染。以上結果表明在試驗條件下，當血清HI抗體效價在不低于1:64時，能有效阻止病毒經母體垂直傳給胎兒。因而確定疫苗效力檢驗時，檢驗標準為免疫28日后，其血清HI抗體效價不低于1:64。
[0094]5.2.2最小免疫劑量試驗
[0095]將安全性試驗合格的3批豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗1201、1202和1203，按照不同劑量0.5ml/頭份、lml/頭份、1.5ml/頭份、2ml/頭份分別免疫3~5月齡的健康后備母豬(PPV HI抗體不高于8)，于免疫后28日采血進行HI抗體檢測。結果顯示，以lml/頭份劑量免疫豬28日后HI抗體效價平均值不低于1:64，而1.5ml/頭份以上劑量免疫豬28日后HI抗體效價均不低于1:64。根據HI抗體效價與攻毒保護相關性試驗結果，確定在免疫后28天豬細小病毒HI抗體效價達到1:64以上時，可以完全保護懷孕母豬抵抗豬細小病毒強毒的攻擊。本發明將豬細小病毒VP2亞單位液滅活疫苗的最小免疫劑量確定為1.5ml/頭份。
[0096]6抗體消長規律與免疫持續期試驗
[0097]將安全性試驗合格的3批豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗1201、1202和1203分別免疫健康后備母豬、經產豬和公豬。為進一步掌握免疫效力及免疫持續期，制定合理的免疫程序，保證免疫豬群保持高而持久的抗體水平，對免疫豬不同時間進行抗體檢測，以掌握其抗體消長規律。
[0098]試驗結果表明，3~5月齡初產母豬免疫1.5ml/頭份，2~3周后加強免疫一次，經產母豬于配種前一個月免疫1.5ml/頭份，28日后其血清HI抗體不低于1:64，免疫后抗體高峰在2~6個月內，其后抗體水平逐漸下降，至9個月仍達1:64，為保證疫苗的免疫保護效果，確定其免疫持續期為7個月。
[0099]7免疫程序的確定
[0100]根據仔豬母源抗體的持續時間，初次免疫應在5~6月齡，因為這時母源抗體已下降到較低水平(HI抗體效價低于1:64)。而且后備母豬配種時間一般為6月齡，這樣在5~6月齡時免疫也正好可以避免母豬在妊娠時遭受強毒攻擊。對于經產母豬由于其體內抗體的持續存在，豬細小病毒對其往往不構成威脅，所以在以前一般不進行免疫，但近幾年由于臨床發病的復雜性，如豬細小病毒往往會加重豬圓環病毒的感染等，所以本發明主張對經產母豬在妊娠前進行免疫，這樣可以保護妊娠母豬在整個妊娠期避免豬細小病毒強毒的攻擊。
[0101]根據后備母豬的配種時間、后備母豬免疫后的抗體消長規律、免疫期，同時結合臨床上豬細小病毒感染的實際情況，本發明確定了豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗的免疫程序為:初產母豬5~6月齡免疫I次，2~4周后加強免疫I次；經產母豬于配種前3~4周免疫I次；公豬每年免疫兩次。每次免疫均為1.5ml/頭。
[0102]8疫苗的保存期
[0103]本發明對實驗室制備的3批VP2亞單位滅活疫苗1201、1202和1203保存期進行了試驗研究，將3批疫苗在2~8°C條件下保存9、12、15、18個月，在各個時間段分別取樣對其性狀、安全性及免疫效力檢測。結果顯示，3批疫苗在2~8°C條件下保存18個月性狀不發生明顯變化，無菌檢驗和安全性都符合質量標準的要求。效力檢驗中1201批疫苗保存18個月樣品免疫豚鼠后有一只豚鼠HI抗體效價為1:32 ；1201和1202批疫苗保存18個月樣品免疫豬后均有一頭豬HI抗體效價為1:32，但免疫豬平均HI抗體水平為1:64，考慮到疫苗在運輸和使用過程中造成的效價損耗，本發明將疫苗的保存期定為2~8°C條件下保存15個月。
[0104]9與全病毒滅活商品苗的免疫效力比較
[0105]將實驗室試制的VP2亞單位滅活疫苗1201、1202和1203與全病毒滅活商品苗，分別免疫350g~400g健康豚鼠及5~6月齡健康后備豬，28日后其血清HI抗體效價均不小于1:64，達到攻毒保護要求，實驗室制備的疫苗HI抗體平均值均略高于市售全病毒滅活商品苗。
[0106]實施例4rVP2_ELISA試劑盒的制備
[0107]1、利用純化后的重組VP2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)作為包被抗原，初步建立了檢測PPV抗體的間接ELISA方法，VP2蛋白檢測及純化結果如圖3所示，同時對反應條件進行了優化:包被液和封閉液分別為2mM pH8.0TrisHcl和5%脫脂乳，抗原的最佳包被濃度為2ug/mL ;血清最佳的稀釋倍數為1:200，酶標二抗的工作濃度為1:6000，一抗、二抗工作時間均為60min,顯色時間為15min。
[0108]試驗結果表明:所建立的ELISA方法的陰陽性臨界值為:0.181+3X0.030=0.271，最后確定當0D450nm > 0.3判為陽性；0D450nm < 0.25為陰性，判定范圍在0.25-0.3時為可疑。
[0109]應用該檢測方法對黑龍江、山東、天津等地區的596份臨床血清進行檢測，陽性檢出率為83.5%~91.1%，平均陽性檢出率為87.03%，選取92份臨床樣品與法國LSI試劑盒比對，兩者符合率是96.7%。
[0110]2、結論
[0111] 以上實驗結果表明本發明所建立的檢測PPV抗體的間接ELISA方法特異性、敏感性和可重復性均比較理想。[0112]因此，本發明建立的一種檢測PPV抗體的間接ELISA方法，為PPV抗體檢測提供了有效的方法，為豬細小病毒檢測試劑盒的研制提供了物質基礎。 [0113]以上所述僅為本發明的優選實例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種重組豬細小病毒VP2蛋白，其特征在于所述重組豬細小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.編碼權利要求1所述的重組豬細小病毒VP2蛋白的核苷酸序列，優選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種表達載體，其特征在于含有權利要求2所述的核苷酸序列。
4.一種宿主細胞。其特征在于含有權利要求3所述的表達載體。
5.權利要求1所述的重組豬細小病毒VP2蛋白在制備豬細小病毒VP2亞單位疫苗以及在制備診斷或檢測豬細小病毒感染的試劑中的應用。
6.一種豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗，其特征在于含有權利要求1所述的重組豬細小病毒VP2蛋白。
7.一種用于診 斷或檢測豬細小病毒感染的ELISA診斷試劑盒，其特征在于含有權利要求I所述的重組豬細小病毒VP2蛋白。
8.一種表達豬細小病毒VP2蛋白的重組多角體病毒AcMNPV，命名為pFastBac-VP2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCCN0.9004，由該病毒株表達的豬細小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
9.權利要求8所述的重組多角體病毒AcMNPV在制備豬細小病毒VP2亞單位滅活疫苗中的應用。
10.一種表達豬細小病毒VP2蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)懸浮培養Sf9細胞，待細胞密度達到5-10X IO5個細胞/毫升時，停止培養，準備接毒； (2)保持搖床轉速在120rpm的條件下，將權利要求8所述的重組多角體病毒AcMNPV以感染復數MOI為10PFU/細胞接入經步驟(1)培養得到的Sf9細胞，120rpm培養24-48小時后收獲病毒； (3)純化VP2蛋白，即得。
【文檔編號】A61K39/23GK103936839SQ201410142613
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】崔尚金 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司