一種nir sers探針及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種NIR?SERS探針，包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP。還可以在所述導電聚合物CP表面上分布有穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP，該探針成本低廉、制備簡單、低毒、結構穩定、兼具成像和治療作用；本發明還公開了上述NIR?SERS探針的制備方法，該制備方法工藝簡潔，成本低廉，成功率高。本發明還進一步公開了上述NIR?SERS探針在SERS成像以及在制備具有光熱治療作用的藥物中的應用。
【專利說明】一種NIR SERS探針及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于NIR SERS【技術領域】，具體涉及一種NIR SERS探針及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]拉曼散射(Raman scattering):一種光子的非彈性散射現象。當光線從一個原子或分子散射出來時，絕大多數的光子，都是彈性散射的，這稱為瑞利散射。在瑞利散射下，散射出來的光子，跟射入時的光子，它的能量、頻率與波長是相同的。然而，有一小部份散射的光子(大約是一千萬個光子中會出現一個)，散射后的頻率會產生變化，通常是低于射入時的光子頻率，原因是入射光子和介質分子之間發生能量交換。這即是拉曼散射。根據拉曼散射效應可以得到物質拉曼光譜，每一種物質都具有自己獨特的拉曼光譜，即分子指紋圖譜。
[0003]表面增強拉曼散射(surface-enhancedRaman scattering, SERS):當一些分子吸附在某些粗糙的金屬(如金、銀和銅等)表面時，其拉曼信號會得到極大的增強，這一現象就叫SERS效應。SERS的增強因子可高達IO14~IO150
[0004]表面增 強拉曼散射(surface-enhancedRaman scattering, SERS)技術已經發展為一種極有價值的光學診斷及成像技術，它能夠提供強烈的吸附在貴金屬納米結構表面物質的分子振動信息，可為疾病的診斷和成像提供豐富的分子指紋光譜信息。與傳統的熒光技術相比，SERS不易受到樣品自發熒光的干擾且無光致褪色的現象出現，適合于樣品的長期觀測；另外，與超寬的熒光光譜相比，SERS光譜帶寬很窄，特別適合于腫瘤的多組分標記與成像。鑒于這些優點，SERS成像技術已經逐漸發展為一種熒光替代技術用于腫瘤的標記與成像。腫瘤的SERS成像方式可分為兩種:第一種是利用腫瘤組織本身的分子指紋特征進行成像。另一種成像方式是在金屬粒子表面連接一些拉曼標記(此類分子具有譜峰歸屬明確且SERS信號強的特點)，利用標記分子的SERS信號實現腫瘤細胞的快速、高靈敏成像。目前常用的SERS標記包括結晶紫、亞甲基藍和巰基苯甲酸等有機染料。但是這類標記毒性強，且往往受限于可見激發光源(組織穿透能力弱)，不適合深層組織的檢測與成像。
[0005]近紅外(near-1nfrared, NIR)光是指780_2526nm區域的電磁福射。構建靈敏度高、近紅外(NIR)光可激發的SERS標記是拉曼研究領域中的一大趨勢，因為NIR光可以穿透很厚的生物組織，實現深層組織區域的SERS成像。一些在NIR區有強烈吸收的有機染料可以被設計為NIR SERS探針，如Cy5、Rh6G、DTTC、Cy7和Cy7.5等。另外，若將SERS活性基底的表面等離子體共振(SPR)吸收峰調節至與激發光的波長匹配時，將會得到更強的SERS信號。在NIR區有吸收的活性基底主要有納米棒、空心納米結構、納米星和納米花等。其中，金納米棒(gold nanorods, GNRs)是一種呈棒狀的金納米結構。金納米棒(GNRs)由于具有制備簡單、且NIR吸收強且波長可調，已經成為制備NIR SERS探針的首選(von MaltzahnGj Centrone A,Park JHj Ramanathan R，Sailor MJ，Hatton TA，et al.SERS-Coded GoldNanorods as a Multifunctional Platform for Densely Multiplexed Near-1nfraredImaging and Photothermal Heating.Adv Mater.2009 ;21:3175-80，Jiang L，Qian J，CaiF，He S.Raman reporter-coated gold nanorods and their applications in multimodaloptical imaging of cancer cells.Anal Bioanal Chem.2011 ；400:2793-800.ZhangY，Qian Jj Wang Dj Wang Y，He S.Multifunctional gold nanorods with ultrahighstability and tunability for in vivo fluorescence imaging, SERS detection, andphotodynamic therapy.Angew Chem Int Ed Engl.2013 ;52:1148-51 等)。值得注意的是，現有的NIR拉曼標記絕大多數是有機染料，面臨著較大的生物安全性問題。另一方面，將有機染料牢固地附著在金屬粒子表面也不是一件容易的事情。
[0006]腫瘤NIR光熱治療是近年來快速發展起來的一種新型腫瘤治療手段，具有療效好、副作用低的特點。由于生物組織對NIR光吸收很少，因此造成的熱損傷很小。NIR光熱治療利用一些產熱試劑(如納米材料、有機染料等)在腫瘤部位富集的特性，將這些試劑吸收的電磁能轉化成熱能達到殺死腫瘤細胞而對周圍組織無損傷的目的。GNRs是目前在腫瘤NIR光熱治療中應用得最為廣泛且成功的納米粒子。因此，以GNRs為基件構建成的NIRSERS探針不僅可以作為有效的腫瘤成像試劑，還可以用于高效的腫瘤NIR光熱治療。然而，新鮮制備出的GNRs表面往往附著有殘余的CTAB分子，具有較強的細胞毒性；而且，GNRs的結構不夠穩定，其棒狀結構在大功率、長時間的NIR激光照射下容易發生熔解。
[0007]現有NIR SERS探針的制備技術主要是通過逐步組裝的方法將拉曼探針(Ramanreport)和高聚物穩定劑分步結合到SERS活性基底上，首先將GNRs與NIR拉曼探針水溶液混合數分鐘，然后加入巰基化的聚乙二醇(PEG-SH)，攪拌數小時使得PEG-SH充分附著在GNRs，最后殘余的拉曼探針分子通過透析(24h-48h)的方法去除，基于GNRs的NIR SERS探針制備過程如圖1中所示。但該技術還存在以下缺點:(I)成本高，現有的NIR有機染料大多是通過化學合成的，生產工藝較復雜，因而NIR拉曼探針大多比較昂貴；PEG-SH的價格也不菲，往往mg級別的PEG-SH就需要上千元，另外，因為巰基的存在，PEG-SH不易保存，極易被氧化；(2)細胞毒性較大，有機 染料的使用往往都具有很大的細胞毒性，即便修飾了 PEG后，其細胞毒性仍然不可忽視；(3)結構穩定性差，該技術中NIR染料僅僅是靠非共價的作用力吸附在GNRs表面，在復雜的生理環境中難免會發生脫落的現象；另一方面，GNRs本身的結構亦不夠穩定，其棒狀結構在大功率、長時間的NIR激光照射下容易發生熔解。
[0008]現有技術中還有以GNRs為核的NIR光熱納米材料制備技術，具體為:由于GNRs本身的結構不夠穩定，在運用于NIR光熱治療時往往需選用一些封裝材料將GNRs包裹住，以保證GNRs的棒狀結構在大功率、長時間的激光照射下的完整性。介孔二氧化硅(SiO2)是目前應用得最為廣泛的封裝材料。首先用氨水將GNRs調節至pHIO，然后將正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液緩慢逐滴地加入，混合液保持在40°C緩慢攪拌24h。合成的產物采用離心的方法回收，殘余的CTAB分子用離子交換法去除。為保證合成產物(GNRs-SiO2)在生理環境下的穩定性，可以先對包被層SiO2進行功能化修飾，然后選用對應功能化的PEG進行共價連接(如:APTES修飾的GNRs-SiO2可用NHS-PEG-MAL連接；用OTMS的話，采用DSPE-PEG連接；亦可直接用PEG-SH連接)。
[0009]NIR有機染料也可以與TEOS同時加入至GNRs溶液中，這樣可以在封裝的過程中也包裹進了 NIR拉曼探針，制備得到的NIR SERS標記結構更穩定，采用SiO2作為GNRs的封裝材料的NIR SERS探針制備過程如圖2中所示。但該技術也存在以下缺點:(I)合成工藝較難掌控，該方法對實驗者的技術要求較高，實驗條件較難控制，經常會出現封裝不均一，甚至空囊SiO2的情況。(2)制備成本也比較高，以SiO2為封裝材料制備NIRSERS標記依舊是避免不了使用NIR有機染料和功能化的PEG穩定試劑，制備成本很難降下來。
[0010]因此，需要開發出一種成本低廉、制備簡單、低毒、結構穩定、兼具成像和治療的NIR SERS 探針。
【發明內容】
[0011]本發明的第一個目的在于提供一種NIR SERS探針，該探針成本低廉、制備簡單、低
毒、結構穩定。
[0012]本發明的第二個目的在于提供上述NIR SERS探針的制備方法，該制備方法工藝簡潔，成本低廉，成功率高。
[0013]本發明的第三個目的在于提供上述NIR SERS探針在SERS成像以及在制備具有光熱治療作用的藥物中的應用。
[0014]本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的:一種NIR SERS探針，包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP。 [0015]導電聚合物(conducting polymer, CP)是一種具導電性的高分子聚合物,又稱導電塑膠與導電塑料，最簡單的例子是聚乙炔。當高分子結構擁有延長共軛雙鍵，離域η鍵電子不受原子束縛，能在聚合鏈上自由移動，經過摻雜后，可移走電子生成空穴，或添加電子，使電子或空穴在分子鏈上自由移動，從而形成導電分子。常見的導電聚合物有、聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚對苯乙烯撐以及它們的衍生物等。
[0016]由于CP層具有豐富的共軛結構，為保證GNRs-CP核殼粒子在生理環境中的穩定性，選用生物相容性好且廉價的高分子一聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為穩定劑。PVP只需與GNRs-CP混合攪拌數小時即可與納米粒子穩定連接,多余的PVP可通過離心去除。
[0017]即作為本發明的一種改進，為了進一步增強NIR SERS探針的穩定性，本發明在所述導電聚合物CP表面上還可以分布有穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP。
[0018]本發明所述導電聚合物CP的厚度優選為5~IOnm,所述導電聚合物CP優選為聚吡咯、聚苯胺或聚噻吩。
[0019]本發明的第二個技術目的是通過以下技術方案來實現的:上述NIR SERS探針的制備方法，含以下步驟:
[0020](I)在水溶液中將金納米棒GNRs與CP單體材料混合，得混合液；
[0021](2)在混合液中加入厚度調節劑，攪拌0.5~Ih后，加入氧化劑，繼續常溫攪拌24~48h后，離心收集沉淀，即得到主要由金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP組成的NIR SERS探針。
[0022]作為本發明的一種改進，為了增強NIR SERS探針的穩定性，本發明步驟⑵中還能在沉淀中加入穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP，攪拌混勻后，即得到主要由金納米棒GNRs、包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP以及分布在所述導電聚合物CP表面上的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP組成的NIR SERS探針。
[0023]在上述制備方法中:
[0024]本發明步驟(1)中所述的金納米棒GNRs優選為金納米棒GNRs的2倍濃縮液，所述CP單體材料優選為吡咯、苯胺或噻吩，所述CP單體材料與金納米棒GNRs的2倍濃縮液的體積比優選為1:2000~2500，所述單體材料在混合液中的體積百分含量優選為0.02~0.03%。
[0025]本發明步驟(2)中所述的厚度調節劑優選為十二烷基硫酸鈉SDS，其終濃度優選為7~18mM。
[0026]本發明加入厚度調節劑十二烷基硫酸鈉SDS調節導電聚合物CP的厚度，得到分散性、均一性較好的GNRs-CP核殼納米材料；不加入厚度調節劑SDS的話，制備得到的產品形態則是大片大片的無規則CP聚合材料，真正以核殼結構存在的粒子很少，因此在制備NIRSERS探針的過程中，需要加入厚度調節劑十二烷基硫酸鈉SDS。
[0027]本發明步驟(2)中所述的氧化劑優選為氯化鐵FeCl3或過硫酸銨APS水溶液，其中氯化鐵FeCl3終濃度優選為0.5~0.7mM,過硫酸銨APS水溶液的終濃度優選為3~5mM。
[0028]本發明中PVP僅起到穩定劑的作用，因此對用量沒有太多的要求，只要保證其稍微過量就行，過量的PVP可通過離心去除。
[0029]作為本發明的一種優選的 實施方式，本發明所述的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP的終濃度優選為1.5~2.5mg/mL。
[0030]本發明中的終濃度是指在加入該物質后的最終混合液中該物質的最終濃度。
[0031]本發明的第三個技術目的是通過以下技術方案來實現的:上述NIR SERS探針在SERS成像以及在制備具有光熱治療作用的藥物中的應用。
[0032]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
[0033](I)本發明選用的高分子導電聚合物既可作為保證SERS活性基底結構穩定性的封裝材料，其本身又具有極好的拉曼特征可作為新穎的NIR SERS標記，CP材料的這種雙重性質大大簡化了 SERS探針的設計；
[0034](2)本發明NIR SERS探針成本低廉、制備容易，制備CP封裝層的原材料如苯胺和吡咯、反應中使用的氧化劑、厚度調節劑十二烷基硫酸鈉SDS以及最后選用的穩定試劑PVP等的價格都非常低廉，同時實驗條件僅需在室溫下攪拌即可完成反應，操作非常簡單、成功率極高；
[0035](3)本發明制備的NIR SERS探針功能多樣，GNRs-CP是一個新穎的高性能兼具成像與治療的納米試劑，GNRs-CP不僅可以作為新穎的NIR SERS探針用于生物成像，它還具有相較于GNRs更為高效的光熱轉換效率以及更為穩定的空間結構，極為適合用于腫瘤NIR光熱治療；
[0036](4)本發明制備的NIR SERS探針具有低毒性，相比于GNRs，GNRs-CP的細胞毒性很小，具有良好的生物相容性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1是本發明【背景技術】中提供的基于GNRs的NIR SERS探針制備過程示意圖；
[0038]圖2是本發明【背景技術】中提供的采用SiO2作為GNRs的封裝材料的NIR SERS探針制備過程示意圖；
[0039]圖3是本發明實施例3和4中提供的NIR SERS探針(GNRs-CP)的制備過程示意圖；
[0040]圖4是本發明實施例3和4中制備獲得的NIR SERS探針(GNRs-CP)的TEM圖像，其中a.GNRs, b.聚吡咯包裹的GNRs (GNRs-PPy)，c.聚苯胺包裹的GNRs (GNRs-PANI)；
[0041]圖5是本發明實施例3和實施例4中制備獲得的NIR SERS探針(GNRs-CP)的拉曼表征圖譜，其中左圖為聚吡咯包裹的GNRs(GNRs-PPy)的拉曼表征圖譜，右圖為聚苯胺包裹的GNRs (GNRs-PANI)的拉曼表征圖譜；
[0042]圖6是實施例5中GNRs-CP對人肺腺癌A549細胞的毒性；
[0043]圖7是實施例6中GNRs-CP作為NIR SERS探針應用于A549細胞體外成像，其中a-c:GNRs-PANI探針(a:A549顯微圖像；b:SERS圖像(選取IHOcnT1峰作圖);c:a和b重疊圖);e-g = GNRs-PPy探針(e:A549顯微圖像；f:SERS圖像(選取945(^1峰作圖)；g:e和f重疊圖)；d:從所標識的細胞區域獲取的SERS譜線；h-k:A549細胞的雙色SERS成像(1:GNRs-PANI ;j:GNRs_PPy ;k:h, i 和 j 的重疊圖像)；
[0044]圖8是實施例6中GNRs-CP作為NIR SERS探針應用于Balb/c小鼠腫瘤成像，其中a:在體拉曼掃描示意圖；b:分別從腫瘤區域和正常背部(control)區域獲取的拉曼譜線；cl，c2:以GNRs-PANI為探針的SERS成像(上:腫瘤區域；下:正常背部區域);c3，c4:以GNRs-PPy為探針的SERS成像(上:腫瘤區域；下:正常背部區域)；
[0045]圖9是實施例7中NIR激光照射下納米粒子溶液的溫度變化曲線；
[0046]圖1OA是實施例7中GNRs-CP作為NIR光熱治療試劑應用于體外的腫瘤剝離實驗結果圖； [0047]圖1OB是實施例7中GNRs-CP作為NIR光熱治療試劑應用于體內的腫瘤剝離實驗
結果圖。
【具體實施方式】
[0048]實施例1
[0049]本實施例采用成本低廉的導電聚合物(Conducting polymer, CP)對GNRs進行封裝，導電聚合物不僅可以作為GNRs的保護材料，其本身還可以作為一種新型的NIR拉曼標記。本實施例提供的NIR SERS探針，包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP，其中導電聚合物CP選用聚吡咯。
[0050]NIR SERS探針具體的制備過程如下:
[0051](I)制備金納米棒GNRs,具體制備方法參閱文獻Ali MR, Snyder B, El-SayedMA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedlessgrowth technique.Langmuir.2012 ;28:9807-15，將制備得到的金納米棒GNRs反應液釆用離心(lOOOOrpm, 30min)的方法進行純化,最后往沉淀中加入相當于0.5倍反應液體積(該反應液體積指未離心前金納米棒GNRs反應液體積)的超純水，可獲得金納米棒GNRs的2倍濃縮液；
[0052](2)在水溶液中將金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料吡咯混合，金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料吡咯二者的體積比為2500:1，同時加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至其終濃度為18mM用以調節CP包被層的厚度，聚吡咯PPy層的厚度約為9nm，攪拌Ih后加入摩爾濃度為0.1M的氧化劑氯化鐵至氧化鐵的終濃度約為0.6mM,繼續常溫緩慢攪拌48h，以保證吡咯在氧化劑氯化鐵的作用下在金納米棒表面聚合形成聚吡咯，最后離心(lOOOOrpm, 20min)收集沉淀，即制備獲得主要由金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP(聚吡咯)組成的NIR SERS探針。
[0053]實施例2
[0054]本實施例采用成本低廉的導電聚合物(Conducting polymer, CP)對GNRs進行封裝，導電聚合物不僅可以作為GNRs的保護材料，其本身還可以作為一種新型的NIR拉曼標記。本實施例提供的NIR SERS探針，包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP，其中導電聚合物CP選用聚苯胺。
[0055]該NIR SERS探針的具體制備過程過程如下:
[0056](I)制備金納米棒GNRs,具體制備方法參閱文獻Ali MR, Snyder B, El-SayedMA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedlessgrowth technique.Langmuir.2012 ;28:9807-15，將制備得到的金納米棒GNRs反應液釆用離心(lOOOOrpm, 30min)的方法進行純化,最后往沉淀中加入相當于0.5倍反應液體積(該反應液體積指未離心前金納米棒反應液體積)的超純水，可獲得金納米棒GNRs的2倍濃縮液；
[0057](2)在水溶液中將金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料苯胺混合，金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料苯胺二者的體積比為2500:1，同時加入十二烷基硫酸鈉SDS至其終濃度為7mM，用以調節CP包被層的厚度，聚苯胺PANI層的厚度約為8nm，攪拌Ih后加入摩爾濃度為IM的氧化劑過硫酸銨至其終濃度約為4mM，繼續常溫緩慢攪拌48h，以保證苯胺在氧化 劑的作用下在金納米棒表面聚合形成聚苯胺，最后離心(lOOOOrpm, 20min)收集沉淀，即制備獲得主要由金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP (聚苯胺)組成的NIR SERS探針。
[0058]實施例3
[0059]本實施例采用成本低廉的導電聚合物(Conducting polymer, CP)對GNRs進行封裝，導電聚合物不僅可以作為GNRs的保護材料，其本身還可以作為一種新型的NIR拉曼標記。該NIR SERS探針包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP，在所述導電聚合物CP表面上還分布有穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP，其中導電聚合物CP選用聚吡咯。
[0060]該NIR SERS探針的具體制備過程如下:
[0061](I)制備金納米棒GNRs,具體制備方法參閱文獻Ali MR, Snyder B, El-SayedMA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedlessgrowth technique.Langmuir.2012 ;28:9807-15，將制備得到的金納米棒GNRs反應液釆用離心(lOOOOrpm, 30min)的方法進行純化,最后往沉淀中加入相當于0.5倍反應液體積(該反應液體積指未離心前金納米棒GNRs反應液體積)的超純水，可獲得金納米棒GNRs的2倍濃縮液；
[0062](2)在水溶液中將金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料吡咯混合，金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料吡咯二者的體積比為2000:1，同時加入十二烷基硫酸鈉SDS至其終濃度為15mM，用以調節CP包被層的厚度，聚吡咯PPy層的厚度約為8nm，攪拌
0.5h后加入摩爾濃度為0.1M的氧化劑氯化鐵至其終濃度約為0.6mM,繼續常溫緩慢攪拌24h,以保證吡咯在氧化劑的作用下在金納米棒表面聚合,最后離心，lOOOOrpm, 20min,收集沉淀；[0063](3)由于CP層具有豐富的共軛結構，為保證GNRs-CP核殼粒子在生理環境中的穩定性，選用生物相容性好且廉價的高分子一聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為穩定劑，在步驟(2)的沉淀中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP至其終濃度為2mg/mL，PVP只需與GNRs-CP混合攪拌數小時即可與納米粒子穩定連接，多余的PVP可通過離心去除，即可得到主要由金納米棒GNRs、包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP以及分布在所述導電聚合物CP表面上的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP組成的NIR SERS探針。
[0064]本實施例制備獲得的聚吡咯包裹的GNRs (GNRs-PPy) TEM圖以及GNRs的TEM圖見圖4。
[0065]實施例4
[0066]本實施例采用成本低廉的導電聚合物(Conducting polymer, CP)對GNRs進行封裝，導電聚合物不僅可以作為GNRs的保護材料，其本身還可以作為一種新型的NIR拉曼標記。該NIR SERS探針包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP，在所述導電聚合物CP表面上還分布有穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP，其中導電聚合物CP
選用聚苯胺。
[0067]該NIR SERS探針的具體制備過程如下:
[0068](I)制備金納米棒GNRs,具體制備方法參閱文獻Ali MR, Snyder B, El-SayedMA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedlessgrowth technique.Langmuir.2012 ;28:9807-15，將制備得到的金納米棒GNRs反應液釆用離心(lOOOOrpm, 30min)的方法進行純化,最后往沉淀中加入相當于0.5倍反應液體積(該反應液體積指未離心前 金納米棒GNRs反應液體積)的超純水，可獲得金納米棒GNRs的2倍濃縮液；
[0069](2)在水溶液中將金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料苯胺混合，金納米棒GNRs的2倍濃縮液與CP單體材料苯胺二者的體積比為2000:1，同時加入厚度調節劑十二烷基硫酸鈉SDS至其終濃度為10mM，用以調節CP包被層的厚度，至PANI層的厚度約為9nm，攪拌0.5h后加入摩爾濃度為IM的氧化劑過硫酸銨至其終濃度約為3.5mM，繼續常溫緩慢攪拌24h,以保證苯胺在氧化劑的作用下在金納米棒表面聚合,最后離心，lOOOOrpm, 20min,收集沉淀；
[0070](3)由于CP層具有豐富的共軛結構，為保證GNRs-CP核殼粒子在生理環境中的穩定性，選用生物相容性好且廉價的高分子一聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為穩定劑，在步驟(2)的沉淀中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP至其終濃度為1.5mg/mL, PVP只需與GNRs-CP混合攪拌數小時即可與納米粒子穩定連接，多余的PVP可通過離心去除，即可得到主要由金納米棒GNRs、包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP以及分布在所述導電聚合物CP表面上的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP組成的NIR SERS探針。
[0071]本實施例制備獲得的聚吡咯包裹的聚苯胺包裹的GNRs (GNRs-PANI) TEM圖見圖4。
[0072]圖4顯示的是GNRs及其修飾產物(GNRs-CP)的透射電鏡(TEM)圖像，可以很明顯的看到棒狀結構。圖4b和圖4c分別顯示的是聚吡咯(PPy)和聚苯胺(PANI)修飾后的核殼納米結構，可以很明顯地看到外層的導電聚合物存在。從圖5的拉曼表征圖譜中可以看到，GNRs-CP對CP本身的拉曼信號有極大的增強。而且這一增強效應是跟激發光波長直接相關的，采用514nm激光激發時，幾乎沒有SERS信號出現；但是，當激發光換成近紅外光(785nm)時，則有極強的SERS信號出現。這一現象表明，CP材料不僅可以用來封裝GNRs粒子，還有望作為一種極好的NIR拉曼標記運用在SERS成像領域。這也就免去了外加有毒的NIR有機染料的麻煩。
[0073]實施例5GNRS-CP的細胞毒性
[0074]選用人肺腺癌(A549)細胞為模型，采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力。將不同濃度的納米材料與細胞一同孵育，24h后加入MTT，繼續孵育4h后，用酶標儀檢測490nm吸收值，圖6顯示了實施例3和實施例4中兩種GNRs-CP核殼納米粒子對A549細胞的毒性。可以看到，通過MTT細胞活力檢測法檢測得到，未經過修飾的GNRs表現出了非常明顯的細胞毒性，在100 μ M的濃度(一般Au納米粒子的應用濃度)下，Α549細胞僅有約40%的細胞存活。與之對應的是，GNRs-CP對Α549細胞的毒性很小，特別是GNRs-PPy，即便處理濃度達到200 μ Μ，Α549細胞仍然保持著超高的細胞活力。這表明，GNRs-CP具有很好的生物相容性。
[0075]實施例6GNRS-CP 的 NIR SERS 活性
[0076]1、體外 NIR SERS 成像
[0077]將GNRs-CP作為NIR SERS探針應用于Α549細胞成像，結果如圖7中所示，在圖7中，a-c:GNRs-PANI探針 (a:A549顯微圖像；b: SERS圖像(選取IHOcnT1峰作圖)；c:a和b重疊圖);e-g = GNRs-PPy探針(e:A549顯微圖像；f:SERS圖像(選取945CHT1峰作圖)；g:e和f重疊圖)；d:從所標識的細胞區域獲取的SERS譜線；h-k:A549細胞的雙色SERS成像(1:GNRs-PANI ;j:GNRs_PPy ;k:h, i 和 j 的重疊圖像)。
[0078]將GNRs-CP作為超靈敏的NIR SERS探針，可實現A549細胞的快速SERS成像。首先，將細胞接種至拉曼襯底上，培養至70%融合后，加入GNRs-CP(實施例3和4中的)與細胞共孵育4h后，取出拉曼襯底，PBS清洗3遍，中性甲醛固定lOmin，清洗干凈后置于顯微拉曼光譜儀下掃描(785nm激發光)。結果如圖7，GNRs-PANI和GNRs-PPy均可實現細胞的超快成像(掃描一個50X50像素圖像僅需2-3min)。選取SERS譜中信號最明顯的峰(GNRs-PANI:1170cm_1 ；GNRs-PPy:945cm_1)進行圖像描繪，得到了清晰的細胞SERS圖像。同時可以發現，納米粒子主要分布于細胞質內，而不能進入細胞核。由于拉曼的窄譜特性，使得多種拉曼標記可以同時使用，實現細胞的多色成像。將GNRs-PANI和GNRs-PPy以一定的比例同時加入細胞培養液中，實現了 A549細胞的雙色成像(圖7j)。
[0079]2、體內 NIR SERS 成像
[0080]將GNRs-CP作為NIR SERS探針應用于Balb/c小鼠腫瘤成像，具體如圖8中所示，在圖8中，a:在體拉曼掃描示意圖；b:分別從腫瘤區域和正常背部(control)區域獲取的拉曼譜線；cl，c2:以GNRs-PANI (實施例4)為探針的SERS成像(上:腫瘤區域；下:正常背部區域)；c3，c4:以GNRs-PPy (實施例3)為探針的SERS成像(上:腫瘤區域；下:正常背部區域)。
[0081]以乳腺癌荷瘤Balb/c小鼠為體內實驗模型，將濃縮的GNRs-CP PBS溶液通過瘤內注射進入腫瘤內，24h后將小鼠麻醉，置于顯微拉曼光譜儀下進行NIR拉曼掃描(圖8a)。比較分別從腫瘤區域及正常背部區域獲取的拉曼譜可以發現，腫瘤的拉曼譜線中出現了明顯的可歸屬于 GNRs-CP 的拉曼峰，如 1170CHT1 (GNRs-PANI)和 945CHT1 (GNRs-PPy)(圖 8b)。將此特征用于二維拉曼掃描，可實現腫瘤的在體NIR SERS成像(圖Sc)。[0082]實施例7GNRS-CP的NIR光熱治療活性
[0083]在NIR區強烈的光吸收特性使得GNRs-CP在腫瘤的光熱治療領域有著巨大的潛力。將納米粒子溶液稀釋至100μΜ，置于808nm(2.5ff/cm2)激光下，用熱電偶溫度計監測不同時間點的液體溫度。繪制成的溫度變化曲線如圖9，可以發現在相同濃度下GNRs-CP(實施例3和實施例4)溶液的溫度上升趨勢明顯高于GNRs。激光照射了 5min后，GNRs-CP溶液的溫度可高達約90°C，比GNRs溶液高出20°C，這表明CP的修飾能夠顯著增強金納米結構的NIR光熱轉換效率，更有利于腫瘤的NIR光熱治療。有報道表明，CP包裹能夠顯著增強金納米粒子在激光照射下的結構穩定性。GNRs-CP也表現出了良好的結構穩定性，將納米粒子置于808nm(2.5ff/cm2)激光下照射Ih后發現，原本呈棕紅色的GNRs溶液顏色明顯變淡，并有沉淀發生，說明未修飾的GNRs結構發生了崩解；而GNRS-CP溶液的顏色則未發生變化，也無沉淀產生。
[0084]選用A549細胞作為體外光熱實驗細胞模型。首先將細胞提前接種于96孔板內，生長至80%融合后，加入不同濃度的納米粒子與細胞共孵育4h，然后進行NIR激光處理(808nm, 2.5ff/cm2, lmin)。照射完換上新鮮培養液，繼續孵育24h后用MTT法檢測細胞活力。結果可見圖10A，在50 μ M的濃度下，GNRs處理的腫瘤細胞未發現明顯的死亡(細胞活力> 95%)，而GNRs-CP處理組的細胞活力則發生了顯著下降。當劑量增加一倍時，可以發現絕大多數腫瘤細胞都被殺死。體內實驗采用乳腺癌荷瘤Balb/c小鼠模型:體外培養的4T1細胞積累到足夠量(2X107個/mL)后皮下注射入Balb/c小鼠側腹，生長I周。然后將納米粒子通過瘤內注射進入腫瘤，24h后激光照射(808nm，2.5ff/cm2, 5min)，觀察激光照射后腫瘤變化情況。圖1OB顯示了兩種GNRs-CP的體內腫瘤剝離效果，可以看到激光照射后小鼠腫瘤部位立刻就變成青紫色，甚至有激光燒灼導致的血痂出現。10天后，腫瘤區域僅留下疤痕并結痂，這表明GNRs-CP具有很好的腫瘤光熱剝離效果。
[0085]上述實施例為 本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種NIR SERS探針，其特征是:包括金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP。
2.根據權利要求1所述的NIRSERS探針，其特征是:在所述導電聚合物CP表面上還分布有穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP。
3.根據權利要求1或2所述的NIRSERS探針，其特征是:所述導電聚合物CP的厚度為5~10nm，所述導電聚合物CP為聚吡咯、聚苯胺或聚噻吩。
4.權利要求1所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是含以下步驟: (1)在水溶液中將金納米棒GNRs與CP單體材料混合，得混合液； (2)在混合液中加入厚度調節劑，攪拌0.5~Ih后，加入氧化劑，繼續常溫攪拌24~48h后，離心收集沉淀，即得到主要由金納米棒GNRs以及包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP組成的NIR SERS探針。
5.根據權利要求4所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是:步驟(2)中還能在沉淀中加入穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP，攪拌混勻后，即得到主要由金納米棒GNRs、包裹在金納米棒GNRs表面上的導電聚合物CP以及分布在所述導電聚合物CP表面上的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP組成的NIR SERS探針。
6.根據權利要求4或5所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是:步驟(1)中所述的金納米棒GNRs為金納米棒GNRs的2倍濃縮液，所述CP單體材料為吡咯、苯胺或噻吩，所述CP單體材料與金納米棒GNRs的2倍濃縮液的體積比為1:2000~2500，所述單體材料在混合液中的體積百分含量為0.02~0.03%。
7.根據權利要求4或5所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是:步驟(2)中所述的厚度調節劑為十二烷基硫酸鈉SDS，其終濃度為7~18mM。
8.根據權利要求4或5所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是:步驟(2)中所述的氧化劑為氯化鐵FeCl3或過硫酸銨APS水溶液，其中氯化鐵FeCl3的終濃度為0.5~0.7mM,過硫酸銨APS水溶液的終濃度為3~5mM。
9.根據權利要求5所述的NIRSERS探針的制備方法，其特征是:所述的穩定劑聚乙烯吡咯烷酮PVP的終濃度為1.5~2.5mg/mL。
10.權利要求1-3任一項所述的NIRSERS探針在SERS成像以及在制備具有光熱治療作用的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K49/00GK103977426SQ201410178898
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】劉智明, 郭周義 申請人:華南師范大學