一種鼠源單克隆抗體cd1519b及其應用的制作方法

一種鼠源單克隆抗體cd151 9b及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種鼠源單克隆抗體CD151?9B及其應用。所述的鼠源單克隆抗體CD151?9B，其特征在于，由保藏號為CGMCC?No.9156的雜交瘤細胞產生。本發明通過廣泛而深入的研究，成功獲得了靶向針對人CD151-整合素α6β1復合物結合域高特異性的鼠源單克隆抗體CD151?9B。本發明的鼠源單克隆抗體CD151?9B具有高親和性，能較好表達肝癌細胞中CD151表達和定位。本發明的鼠源單克隆抗體CD151?9B可以競爭肝癌細胞CD151-整合素α6β1結合位點，抑制肝癌細胞移動、侵襲。因此，本發明的高親和力、高特異性的鼠源單克隆抗體具有較好的實驗和臨床應用前景。
【專利說明】-種鼠源單克隆抗體CD151 9B及其應用 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及針對人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1復合體結合域的單克隆抗體 ⑶1519Β及其應用。 【背景技術】
[0002] 肝癌屬基因性疾病，一些關鍵基因在肝癌的侵襲和轉移中起了重要作用。四跨膜 蛋白⑶151(Tetraspanin24，TM4SF24)是四跨膜蛋白家族最重要的成員之一，⑶151基因定 位于人類染色體11ρ15. 5,其編碼蛋白質形成四次跨膜分子。CD151在人體細胞中分布廣 泛，包括上皮細胞、內皮細胞和血小板等，參與細胞多種重要生理功能，如信號轉導、細胞黏 附、細胞移動與形態改變等。
[0003] 多種惡性腫瘤組織包括肝癌中CD151過表達，其表達強度與患者預后密切相關。 CD151通過與整合素、生長因子結合或自身相互結合形成功能復合體，影響腫瘤細胞遷移、 病理血管形成和上皮間質樣轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)等多個方 面，參與腫瘤轉移。研究證實，⑶151通過與整合素 α6β1等結合形成功能復合體，募集細 胞內憐脂醜肌醇 _3_ 激酶（Phosphatidylinositide3kinases，ΡΙ3Κ)、蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)、細胞分裂控制蛋白 42 (Cell division control protein42，Cdc42)、Ras 等 信號分子，促進細胞的代謝、生長、增殖和細胞內肌動蛋白聚合，參與腫瘤細胞遷移、病理血 管形成和形態改變等過程促進腫瘤轉移。⑶151可增強整合素 α6β1與其配體層粘連蛋 白-1之間的結合，加快細胞在層粘連蛋白-1基膜上的移動而促進腫瘤細胞遷徙。
[0004] 前期系列研究發現，CD151是影響肝癌轉移復發的關鍵蛋白。我們發現，（1)肝 癌細胞中⑶151表達程度與其侵襲、轉移能力密切相關，⑶151表達改變可顯著影響肝 癌細胞的侵襲和轉移能力；(2)⑶151通過激活ΡΙ3Κ/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激 酶 _3 β (Glycogen synthase kinase_3i3 , GSK_3i3)/Snail 信號通路促進基質金屬蛋白酶 9(1&11：1^11116七311(^6口1:丨(^869，麗?9)分泌和表達，促進肝癌新生血管形成 ；（3)0)151與整 合素 α 6 β 1在肝癌細胞表面形成復合物，過表達⑶151可選擇性擴大整合素 α 6 β 1-PI3K 信號導致核轉錄因子Snail (鋅指轉錄因子Snail作為EMT過程中的關鍵調控因子在腫瘤 的侵襲轉移中起重要作用）的核聚集與激活，從而促進肝癌EMT發生；(4)基于免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, coIP)結合液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS)技術，肝癌細胞株HCCLM3細胞中CD151可與整合素 α 6、β 1等 分子伴侶結合形成功能復合。因此，四跨膜蛋白⑶151與整合素 α 6 β 1等結合所形成的功 能復合體是抗腫瘤復發/轉移的潛在靶點。
[0005] 目前已有幾種抗人CD151單克隆抗體用于腫瘤治療的實驗研究，并顯示出一定的 療效。但這些抗體制備時未考慮⑶151功能發揮依賴于功能復合體存在這一特征，因此這 些單克隆抗體在抑制腫瘤的侵襲同時也影響其的多種重要生理功能，如信號轉導、細胞黏 附、細胞移動與形態改變。
[0006] 因此，本領域迫切需要研制具有針對⑶151-整合素α6β 1復合體結合域的靶向 單克隆抗體，為臨床治療開發治療效果更佳、副作用更小的藥物。
【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種靶向針對人⑶151-整合素 α 6β 1復合物結合域的鼠源 單克隆抗體（CD1519B)及其應用，新研制的抗體能定位、表達細胞、組織（如肝細胞癌）內 ⑶151蛋白，一方面不影響⑶151正常的生理功能，另一方面又能競爭性抑制⑶151過表達 引起的肝癌侵襲和轉移。
[0008] 為了達到上述目的，本發明提供了一種靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β1 復合體結合域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β，其特征在于，由保藏號為CGMCC No. 9156的雜交 瘤細胞產生。
[0009] 優選地，所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復合體結合域的鼠源單 克隆抗體⑶1519Β包含可與人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復合體結合的功能域，該 功能域包含至少一個輕鏈可變區和至少一個重鏈可變區。
[0010] 更優選地，所述的功能域選自單克隆抗體，完整抗體，單鏈抗體（scFV)，Fab片段， Fd片段，Fv片段，F (ab'）2片段及其功能性衍生物。
[〇〇11] 更優選地，所述的功能域是抗體可變區，其包含一個輕鏈可變區和一個重鏈可變 區，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID N0 :1，編碼重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0012] 更優選地，所述的功能域是抗體可變區，其包含一個輕鏈可變區和一個重鏈可變 區，所述的輕鏈可變區具有氨基酸序列SEQ ID N0 :3,所述的重鏈可變區具有氨基酸序列 SEQ ID N0 :4。
[0013] 本發明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復合體結合域的 鼠源單克隆抗體CD1519B在與其他藥物或標記物連接中的應用。
[0014] 本發明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復合體結合域的 鼠源單克隆抗體CD1519B在制備治療、預防或緩解腫瘤的藥物中的應用。
[0015] 本發明還提供了上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α6β 1復合體結合域的 鼠源單克隆抗體⑶1519Β在制備檢測細胞、組織中⑶151表達和定位試劑中的應用。
[0016] 本發明還提供了一種藥物組合物，其包含上述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合 素 α 6 β 1復合體結合域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β和藥學可接受的載體。
[0017] 本發明還提供了一種雜交瘤細胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細胞株為保藏號 為CGMCC No. 9156的雜交瘤細胞株。
[0018] 本發明的原理是：四跨膜蛋白⑶151形成四次跨膜的分子結構。⑶151在人體細 胞中分布廣泛，包括上皮細胞、內皮細胞和血小板等，參與細胞多種重要生理功能，如信號 轉導、細胞黏附、細胞移動與形態改變等。CD151是影響肝癌轉移復發的關鍵蛋白。CD151 通過與整合素 α 6 β 1形成復合物，參與肝癌細胞的侵襲、新生血管形成、上皮間質樣轉化。 既往抗人CD151單克隆抗體未考慮CD151功能發揮依賴于功能復合體存在這一特征，因此 這些單克隆抗體在抑制腫瘤的侵襲同時也影響其多種重要生理功能。⑶151的細胞外區域 QRD194496對于維持與整合素 α 6 β 1復合體至關重要，在肝癌細胞株HCCLM3細胞中⑶151可 與整合素 α 6、β 1等分子伴侶結合形成功能復合物，⑶151與整合素 α 6 β 1形成復合物，參 與肝癌進展。本發明新研制的小鼠抗人CD151-整合素 α6β1復合物結合域的單克隆抗體 (⑶1519Β)能競爭性抑制⑶151高表達細胞（包括肝細胞癌）移動和侵襲，但不影響⑶151 正常的生理功能；能特異性定位、表達細胞、組織（如肝細胞癌）內⑶151蛋白。
[0019] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0020] 本發明通過廣泛而深入的研究，成功獲得了靶向針對人⑶151-整合素 α6β 1復 合物結合域高特異性的鼠源單克隆抗體CD1519B。本發明的鼠源單克隆抗體CD1519B具有 高親和性，能較好表達肝癌細胞中⑶151表達和定位。本發明的鼠源單克隆抗體⑶1519Β 可以競爭肝癌細胞⑶151-整合素 α6β1結合位點，抑制肝癌細胞移動、侵襲。因此，本發 明的高親和力、高特異性的鼠源單克隆抗體具有較好的實驗和臨床應用前景。
[0021] 本發明的雜交瘤細胞株（保藏日期2014年4月24日、保藏單位全稱：中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心和保藏編號CGMCC No. 9156)。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為小鼠抗人⑶1519B單克隆抗體變性蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 圖2為單克隆抗體免疫分型結果圖；
[0024] 圖3為Western blot實驗結果圖；
[0025] 圖4為細胞免疫熒光實驗結果圖；
[0026] 圖5為免疫組織化學染色結果圖；
[0027] 圖6為co-IP實驗結果圖；
[0028] 圖7為細胞劃痕實驗結果圖；
[0029] 圖8為Transwell實驗結果圖。 【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不 用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗手冊（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press， 1989)中所建議的條件，或按照試劑公司所建議的條件。
[0031] 實施例1.抗原的制備
[0032] 根據 Kazarov AR，Yang X, Stipp CS，Sehgal B，Hemler ME :An extracellular site on tetraspanin CD151determines alpha3and alpha6integrin-dependent cellular morphology. J CellBiol2002 ; 158 (7) :1299-309,設計需合成的肽段序列為 GQRDHASNIYKVEGGC，按以下步驟合成肽段。
[0033] 1. 1稱取η當量樹脂（Sigma)放入反應器（上海強耀生物科技有限公司），加入 二氯甲烷（DCM，Sigma)溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入一定量配好的六氫吡啶（Sigma)去 Fmoc保護基。清洗，檢測；
[0034] 1. 2稱取多肽C端的第一個氨基酸〃Fmoc-Cys (Tbu) -0H〃、HBTU、DIEA各三倍當量 加入反應器，隊鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮（Sigma)檢測，用吡啶、乙酸酐（Sigma)， 封端。然后洗凈，加入適當量的脫帽液去除Fmoc保護基，去好后洗凈，茚三酮檢測；
[0035] 1. 3稱取多肽C端的第二個氨基酸，HBTU、DIEA (Sigma)各三倍當量加入反應器， N2鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，無色則加入適當量的脫帽液去除Fmoc保護基， 洗凈，檢測；
[0036] 1. 4稱取多肽C端的第三個氨基酸，HBTU、DIEA各三倍當量加入反應器，N2鼓泡反 應半小時，洗掉反應液，茚三酮檢測，無色則加入適當量的脫帽液去除Fmoc保護基，洗凈， 檢測；
[0037] 1. 5依次類推，從C端向N端接氨基酸，接到最后一個氨基酸后；
[0038] 1. 6接完后將樹脂拉干，從反應柱中取下，樹脂倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定 量的切割液（上海強耀生物科技有限公司），震蕩2小時（目的是將多肽從樹脂載體上裂解 下來和去除各個保護基團）；
[0039] 1. 7濾掉樹脂，得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚（上海強耀生物科技有限公 司），粗產物會析出，然后離心，清洗即可得到，GQRDHASNIYKVEGGC這個序列的粗產物；
[0040] 1. 8提純：用高效液相色譜（上海強耀生物科技有限公司）將粗品提純至要求純 度 99. 99% ;
[0041] 1. 9純化好的液體放入凍干機（上海強耀生物科技有限公司）中進行濃縮，凍干成 白色粉末；
[0042] 1. 10 稱量 KLH(Sigma)和 BSA(Sigma)分別溶于少量 PBS 中；
[0043] 1. 11將多肽溶于少量MDF (Sigma)中邊攪拌邊加入"1. 10"中的溶液中；
[0044] 1. 12邊攪拌邊加入適量EDC、NHS (上海強耀生物科技有限公司）；
[0045] 1. 13室溫反應2小時；
[0046] 1. 14邊攪拌邊加入適量EDC(上海強耀生物科技有限公司）；
[0047] 1. 15室溫反應20小時；
[0048] 1. 15 用 0· 01mol/L 的 PBS(PH7. 2)于 4°C充分透析；
[0049] 1. 16 凍干，得到 GQRDHASNIYKVEGGC-KLH 偶聯物和 GQRDHASNIYKVEGGC-BSA 偶聯物。 [〇〇5〇] 實施例2.抗原免疫及雜交瘤篩選
[0051] 2.1重組蛋白免疫：
[0052] 準備六周齡健康雄性BALB/c小鼠，進行初次免疫，稱取一定量的⑶151-整合 素 α 6 β 1-KLH 復合體蛋白（GQRDHASNIYKVEGGC-KLH)，內含 CD151-整合素 α6β1 抗原 量100 μ g/小鼠。溶解后與等量完全弗氏佐劑（Sigma)混合充分乳化，每只小鼠腹腔注射 0. 5ml抗原佐劑混合物。2周后進行第一次加強免疫，抗原量同前與不完全弗氏佐劑混合乳 化腹腔注射。間隔2周再行第二次加強免疫，條件同前。二次加強免疫后2周進行沖擊免 疫，抗原量是加強免疫的2倍。沖擊免疫后3天處死小鼠，進行融合。
[0053] 2. 2抗⑶151-整合素 α 6 β 1雜交瘤細胞株建立
[0054] (1)細胞融合
[0055] 融合前24小時制備飼養層細胞，取免疫同系小鼠腹腔巨噬細胞鋪成96孔培養板2 塊備用。準備對數生長期小鼠骨髓瘤NS-1細胞系（中國科學院典型培養物保藏委員會細 胞庫）融合。沖擊免疫3天處死小鼠，在處死前先眼球取血，以后作陽性對照。在無菌條件 下取脾，分離得到脾細胞，細胞活率>95%。分別將NS-1細胞和脾細胞洗2次，以10 : 1 比例將脾細胞和NS-1細胞混合，離心棄上清，細胞混勻。將試管直立，取0. 8ml預熱的5% PEG MN1500 (Roche)，用1分鐘時間慢滴慢搖的加入混合細胞內，然后靜止10分鐘。加入lml 無血清培養液于混合細胞內終止反應，持續1分鐘，在2分鐘內加完15ml無血清培養液， 500rpm離心3分鐘，室溫，棄上清，加25ml含10% FBS的HAT (選擇性培養基Sigma)，將細 胞滴加在已含飼養細胞的96孔培養板上培養。
[〇〇56] (2)雜交瘤的細胞篩選
[0057] 每天觀察雜交細胞生長情況，第4天已有大小不等克隆形成。克隆細胞生長至> 50%時，收集上清，篩選陽性克隆。HAT完全培養液培養3周后換成DMEM培養液（Gibco)。 陽性克隆篩選采用酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法， CD151-整合素 α 6β l-BSA(GQRDHASNIYKVEGGC-BSA)連接的抗原 10ug/ml，每孔 lOOul 包 被。檢測到陽性克隆時用有限稀釋法進行再克隆化（2塊96孔）。第二天挑選一個細胞克 隆重點觀察進行檢測，反復3次。挑選到3個穩定克隆，其中一個克隆命名為CD151/9B細 胞株，進行培養，該細胞株保藏在（保藏日期2014年4月24日、保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號CGMCC No. 9156。）
[0058] 實施例3.單克隆抗體免疫分型檢測
[0059] 收集抗CD151/9B雜交瘤細胞株（CD151/9B細胞株）培養上清，用mouse monoclonal antibody/isotyping kit(Roche)進行免疫分型鑒定，結果為 IgGl，如圖 1 所 示。以下實驗選用CD151/9B雜交瘤細胞進行。
[0060] 實施例4.腹水制備和純化
[0061] 4. 1擴增CD151/9B雜交瘤細胞
[0062] 制備腹水前向BALB/C小鼠腹腔注射液體無菌石蠟油0. 5ml，7天后小鼠腹腔注 射0. 5ml實施例2獲得的含抗CD151/9B雜交瘤細胞株（CD151/9B細胞株）的培養液，抗 CD151/9B雜交瘤細胞數為8 X 105。接種細胞后每天觀察小鼠腹腔增大情況，15天后收集腹 水。收集的腹水以4000rpml0分鐘4°C離心，保留上清，分裝，_20°C貯存備用。根據需要進 行純化。
[0063] 4. 2純化靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素 α 6β 1復合體結合域的鼠源單克隆抗 體⑶1519Β (小鼠抗人⑶1519Β單克隆抗體）
[0064] 采用protein G親和層析柱（GE Healthcare)。室溫解凍⑶151/9Β腹水，用結合緩 沖液（20mM sodium phosphate PH7. 0)稀釋 1 倍，0· 45um 濾器過濾備用。將 protein G 柱室 溫復溫，用10個柱體積的結合緩沖液平衡和洗柱子，加 CD151/9B腹水，8個柱體積的結合緩 沖液洗直到無液體流出，加5個柱體積的PH2. 7,0. 1M甘氨酸鹽酸洗脫液洗脫。每個收集管 內預加100ullMTris-HCL(PH9. 0)起中和作用，每管收集流出液lml進行蛋白濃度測定，將 有效的流出液透析0. 1M PBS PH7. 0，透析24小時，其間換兩次。將透析液濃縮，測蛋白濃度 (Nanovue plus GE)，得到小鼠抗人OH519B單克隆抗體。然后0· 22um滅菌過濾，分裝-80°C 保存。
[0065] 4. 3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
[〇〇66] (1)樣品制備：采用步驟4.1中制備的腹水，將腹水樣品與5X樣品緩沖液 (20ul+5ul)在一個Eppendorf管中混合。放入10(TC加熱10分鐘，取上清點樣；
[0067] (2)分離膠及濃縮膠的制備：將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用 ddH20(碧云天）沖洗數次，再用乙醇擦拭，晾干；將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按 照Bio-Rad Mini II/III說明書提示裝好玻璃板；按如下體積配制12%分離膠10. 0ml，混 勻；
[0068] ddH203. 3ml
[0069] 1. 5mol/L Tris-HCl (pH = 8· 8) 2. 5ml
[0070] 30% Acr-Bis4ml
[0071] 10% SDSlOOy 1
[0072] 10% ΑΡΙΟΟμ 1
[0073] TEMED4 μ 1
[0074] 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20分鐘后膠即可聚合；按如下 體積配制5 %濃縮膠3. 0ml，混勻；
[0075] ddH202. 1ml
[0076] 1. Omol/LTris-HCl (pH = 6. 8) 380ul
[0077] 30% Acr-Bis500y 1
[0078] 10% SDS30y 1
[0079] 10% ΑΡ30μ 1
[0080] TEMED3 μ 1
[0081] 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
[0082] (3)裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣20μ 1 ;穩壓200V，溴酚藍剛跑出分離膠 時，停止電泳，約需45分鐘-1小時；
[0083] (4)卸下膠板，剝離膠放入考馬斯亮藍G250染色液中，室溫染色2小時；加入脫色 液，置于80rpm脫色搖床上，每20分鐘更換一次脫色液（10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸餾 水）至完全脫凈，攝片，結果如圖2所示。
[0084] 實施例5.抗⑶151-整合素 α 6 β 1復合體結構域單克隆抗體可變區測序
[0085] 提取實施例2獲得的ΟΗ51/9Β細胞株的總RNA(Invitrogen)、逆轉錄（Promega)。 利用5'-race技術（TAKARA)擴增抗體重鏈和輕鏈可變區。然后將抗體重鏈及輕鏈可變區 克隆到T載體（TAKARA)，測序。PubmedBlast IgBlast數據庫對比序列，找出雜交瘤單克隆 細胞株重鏈輕鏈可變區（附序列）。確定CD151/9B重鏈及輕鏈可變區至恒定區的序列：具 體方法按照5'-RACE試劑盒（TAKARACode :D315)說明書進行實驗。具體方法如下：
[0086] 5. 1抗⑶151/9B雜交瘤細胞總RNA的提取：
[0087] 抗⑶151/9B雜交瘤細胞于5% C02 , 37°C培養箱中培養。將抗⑶151/9B雜交瘤細 胞收集于離心管中，室溫，l，〇〇〇rpm離心5分鐘，棄上清。PBS (Corning)洗漆細胞2次。每 1〇6細胞加 lml Trizol (Invitrogen)，充分裂解細胞；按每毫升Trizol加0· 2ml的比例加入 氯仿（國藥集團化學試劑有限公司），劇烈振蕩15秒，室溫靜置孵育5分鐘；4°C，12, OOOrpm 離心15分鐘；將無色上清液移入RNAasefree EP管中，按每毫升Trizol加0. 5ml異丙醇（國 藥集團化學試劑有限公司），室溫靜置10分鐘，12, 000rpm，4°C離心10分鐘；棄上清，70% RNAase free乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）洗漆，4°C，12, OOOrpm離心5分鐘；室溫 干燥RNA10分鐘。隨后用DEPC處理后的RNAase free H20(生物工程上海有限公司）溶解。 分光光度計法定量RNA濃度。
[0088] 以下 5. 2-5. 7 為 5' -RACE 實驗步驟（試劑盒，TAKARA Code :D315)
[0089] 5· 2去磷酸化處理
[0090] 使用Alkaline Phosphatase (CIAP)對總RNA裸露的Y磷酸基團進行去磷酸反 應。按下列組份配制去磷酸反應液：
[0091] Total RNA(1 μ g/ μ 1) 1 μ 1
[0092] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 1 μ 1
[0093] 10XAlkaline Phosphatase Buffer(MgC12Free) 5μ 1
[0094] Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (16U/ μ 1) 0. 6 μ 1
[0095] 加 RNase Free 去離子水至 5〇 μ 1。
[0096] 上述反應體系于50°C反應1小時。隨后向上述反應液中加入20 μ 1濃度為3mol 0130)0似(?!15.2)和13(^18似86?代6去離子水，充分混勻。加入20(^1苯酚/氯仿/異戊 醇（25 : 24 : 1)，充分混勻，13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉移至新的離心管中。 加入200 μ 1氯仿，充分混勻，13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉移至新Microtube 中。加入2 μ 1 ΝΑ Carrier后均勻混合。加入200 μ 1異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分 鐘。13, 000rpm4°C離心20分鐘，棄上清。加入500 μ 170%冷乙醇（RNase Free去離子水配 制）漂洗，13, 000rpm4°C離心5分鐘，棄上清后干燥。加入7 μ 1 RNase Free去離子水溶解 沉淀，得到 CIAP-treated RNA。
[0097] 5.3"去帽子"反應：
[0098] 使用 Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子結構，保留一個 磷酸基團。按下列組份配制"去帽子"反應液：
[0099] CIAP-treated RNA 7 μ 1
[0100] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0101] 1 OX TAP Reaction Buffer 1 μ 1
[0102] Tobacco Acid Pyrophosphatase (0. 5 U/ μ 1) 1 μ 1
[0103] 總體積10μ 1。37°C反應1小時。得到的反應液為CIAP/TAP-treated RNA。取 5μ 1用于Y -RACE Adaptor連接反應，剩余的5μ 1保存于-80°C備用。
[0104] 5. 4 5 ' RACE Adaptor 的連接。
[0105] 首先配制下列溶液：
[0106] CIAP/TAP-treated RNA 5 μ 1
[0107] 5' RACEAdaptor(15yM) 1μ 1
[0108] RNase Free dH20 4 μ 1
[0109] 于65°C孵育5分鐘后冰上放置2分鐘，然后加入下列試劑：
[0110] RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0111] 5 XRNA Ligation Buffer 8μ1
[0112] 40%PEG#6000 20 μ 1
[0113] T4 RNALigase (40 U/ μ 1) 1 μ 1
[0114] 反應體系于16°C孵育1小時。向上述反應液中加入20 μ 1的3 mol的CH3C00Na(PH 5. 2)和140 μ 1 RNase Free去離子水后，充分混勻。加入200 μ 1苯酚/氯仿/異戊醇 (25 : 24 : 1)，充分混勻后于13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉移至新的離心管 中。加入200 μ 1氯仿，充分混勻后于13, OOOrpm室溫離心5分鐘，將上層水相轉移至新的 離心管中。加入2 μ 1 NA Carrier后均勻混合。加入200 μ 1異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻 10分鐘。13,000rpm4°C離心20分鐘，棄上清。加入500μ1預冷的70%乙醇（RNaseFree 去離子水配制）漂洗，13, OOOrpm 4°C離心5分鐘，棄上清后干燥。加入6 μ 1 RNase Free去 離子水溶解沉淀，得到Ligated RNA。
[0115] 5.5反轉錄反應。
[0116] 按下列組份配制反轉錄反應液：
[0117] LigatedRNA 6 μ 1
[0118] Random9mers (50 μ Μ) 0. 5 μ 1
[0119] 5XM-MLV Buffer 2 μ 1
[0120] dNTP (10mM each) 1 μ 1
[0121] RNase Inhibitor (40U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0122] Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200U/ μ 1) 0. 25 μ 1
[0123] 加 RNase Free去離子水至10 μ 1。反轉錄反應條件如下：30°C 10分鐘，42°C 1小 時，70°C 15分鐘。反應結束后可以進行下一步實驗，或將反應液保存于_20°C。
[0124] 5. 60uterPCR 反應
[0125] PCR反應使用TaKaRa LA Taq? (TaKaRa)，按下列組份配制Outer PCR反應液：
[0126] 上述的反轉錄反應液2 μ 1
[0127] 1 X cDNA Dilution Buffer II 8 μ 1
[0128] 10 X LA PCR Buffer 11 (Mg2+Free) 4 μ 1
[0129] MgCl2 (25mM) 3 μ 1
[0130] TaKaRa LA Taq (5U/ μ 1) 0· 25 μ 1
[0131] mlgGfOUter Primer (10 μ Μ) 2 μ 1
[0132] 5' RACE Outer Primer (10 μ Μ) 2μ1
[0133] 加滅菌去離子水至50 μ 1。PCR反應條件：94°C 3分鐘；[94°C 30秒，55°C 30秒， 72°C 1分]X20個循環；72°C 10分鐘。
[0134] 5. 7InnerPCR 反應
[0135] 按下列組份配制Inner PCR反應液：
[0136] OuterPCR 反應液 1 μ 1
[0137] 10 X LAPCR BufferII (Mg2+Free) 5 μ 1
[0138] MgCl2 (25mM) 5 μ 1
[0139] dNTP Mixture (2. 5mM each) 8 μ 1
[0140] TaKaRa LATaq (5U/ μ 1) 0· 5 μ 1
[0141] mlgGfinner (10 μ Μ) 2 μ 1
[0142] 5' RACE Inner Primer (10 μ M) 2 μ 1
[0143] 加滅菌去離子水至50μ 1。PCR反應條件如下：94°C 3分鐘，[94°C 30秒，55°C 30 秒，72°C lmin] X25 個循環；72°C 10 分鐘。
[0144] 5. 8瓊脂糖凝膠電泳
[0145] 反應結束后，取5 μ 1 PCR反應液進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產物。 然后將PCR擴增得到的抗體重鏈及輕鏈可變區分別鏈接到pGEM?-T載體（PromegaCode : A3610)，連接反應體系如下：
【權利要求】
1. 一種靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β1復合體結合域的鼠源單克隆抗體 ⑶1519Β，其特征在于，由保藏號為CGMCC No. 9156的雜交瘤細胞產生。
2. 如權利要求1所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1復合體結合域的鼠源 單克隆抗體⑶1519Β，其特征在于，包含可與人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復合體結 合的功能域，該功能域包含至少一個輕鏈可變區和至少一個重鏈可變區。
3. 如權利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α6β1復合體結合域的鼠源 單克隆抗體CD 1519Β，其特征在于，所述的功能域是抗體可變區，其包含一個輕鏈可變區和 一個重鏈可變區，編碼輕鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，編碼重鏈可變區的核苷酸 序列為 SEQ IDN0 :3。
4. 如權利要求2所述的靶向人四跨膜蛋白CD151-整合素α 6 β 1復合體結合域的鼠源 單克隆抗體CD1519B，其特征在于，所述的功能域是抗體可變區，其包含一個輕鏈可變區和 一個重鏈可變區，所述的輕鏈可變區具有氨基酸序列SEQ ID NO :2,所述的重鏈可變區具有 氨基酸序列SEQ IDN0 :4。
5. 權利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復合體結合 域的鼠源單克隆抗體CD1519B在與其他藥物或標記物連接中的應用。
6. 權利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復合體結合 域的鼠源單克隆抗體CD1519B在制備治療、預防或緩解腫瘤的藥物中的應用。
7. 權利要求1-4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151-整合素α6β 1復合體結合 域的鼠源單克隆抗體⑶1519Β在制備檢測細胞、組織中⑶151表達和定位試劑中的應用。
8. -種藥物組合物，其包含權利要求1 _4中任一項所述的靶向人四跨膜蛋白⑶151 -整 合素α 6β 1復合體結合域的鼠源單克隆抗體CD1519B和藥學可接受的載體。
9. 一種雜交瘤細胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細胞株為保藏號為CGMCCNo. 9156的 雜交瘤細胞株。
【文檔編號】A61K39/395GK104059145SQ201410204122
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】樊嘉, 施國明, 柯愛武, 周儉, 胡美玉, 張鵬飛, 蔡加彬, 董兆如, 張馳 申請人:復旦大學附屬中山醫院