專利名稱：：鼠抗醋酸甲羥孕酮(mpa)的單克隆抗體的制作方法鼠抗醋酸甲羥孕酮(MPA)的單克隆抗體
技術領域：
-本發明屬于獸藥檢測和免疫學分析
技術領域：
，具體涉及一種鼠抗醋酸甲羥孕酮的單克隆抗體及其分泌抗體的雜交瘤細胞株。
背景技術：
：醋酸甲羥孕酮(MedroxyprogesteroneAcetate,MPA)是一種孕激素類婦科藥物，黃體酮衍生物，化學名為6a-甲基-17a-羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮醋酸酯，分子式為02483404，又稱甲羥孕酮、甲孕酮、安宮黃體酮，主要用于婦女絕經期綜合征疾病等激素替代療法。MPA和其他同化性激素藥物一樣具有安情助長作用，MPA對動物有增肥作用，多用在詞料中作為促生長劑和非發情期誘導發情、誘發超數排卵、同步發情等方面，以提高繁殖率和經濟效益(高彥生等，2002)，例如牛、羊、豬、雞、魚等的飼料。但MPA可對人造成廣泛副作用，體重增加、虛弱、疲乏和不可逆高血壓、脫發以及不規則出血、閉經、精神抑郁、失眠、惡心、乳脹等不良反應，甚至導致不孕不育癥，也有專家擔心這種生長激素還可能具有導致細胞快速增殖的危險。由于MPA作為飼料添加劑在動物體內不斷累積可導致動物性食品中該藥的殘留，從而嚴重威脅著人類健康。自2002年歐盟發生的MPA污染事件后，MPA的獸藥殘留問題引起世界的廣泛關注。歐盟(EU)已明令嚴禁使用MPA，規定在食源性動物產品中殘留最高限量(MRL)為"不得檢出"。但是仍存在非法使用的現象，并且在美國、澳大利亞等一些國家還未禁止MPA的使用，因此，加強動物詞料和食品中MPA檢測非常重要。目前用于MPA檢測的確證方法是氣相色譜一質譜(GC/MS)法(莊無忌，2003)，但該法儀器昂貴，檢測成本較高，檢測周期較長，技術也比較復雜。MPA免疫學分析方法敏感、特異、快速已成為國內外研究熱點，制備出特異性強、效價高的MPA抗體是進行MPA免疫學分析方法研究的首要條件。目前國外已有以多克隆抗體為基礎的商品化MPA檢測的酶免疫技術(EIA)試劑盒(如5131MPAlp[3]08.05)，國內有關于MPA人工抗原合成、多克隆抗體制備和ELISA檢測的報道(郭金花，2006;孫武勇，2007;楊澤曉，2008)，但是還沒有注冊商品號的相關MPA檢測試劑盒生產，也未見MPA單克隆抗體研究的報道。申請人只檢索到一篇主題相關的專利文獻，文獻號02125370.6，發明名稱為一種檢測醋酸甲羥孕酮含量的試劑盒及其檢測方法。多克隆抗體常受到人工抗原合成批次、免疫劑量、試驗動物、免疫時間、免疫血清儲存時間等多種因素的影響，很難提供標準化的相關試劑，而單克隆抗體特異性強、均質性好，效價高、穩定廉價，有望解決多克隆抗體不易標準化等缺點。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于利用免疫學技術得到抗MPA的單克隆抗體。本發明目的在于利用B淋巴細胞雜交瘤技術獲得一株能夠穩定分泌MPA特異性抗體的雜交瘤細胞株M68F9，并提供進行飼料和食品中MPA殘留量免疫學分析所需的單克隆抗體。該抗體為一株穩定的鼠源性雜交瘤細胞株所分泌的IgGl型免疫球蛋白，能夠與MPA發生特異性免疫反應。本發明的目的通過下述技術方案實現，即MPA單克隆抗體的制備方法(l)分別采用碳二亞胺法、混合酸酐法將MPA偶聯到牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清白蛋白(OVA)上制備免疫原(MPA-BSA)與包被原(MPA-OVA);(2)通過BALB/c小鼠免疫、細胞融合、間接ELISA和阻斷ELISA篩選、有限稀釋法克隆亞克隆獲得分泌MPA單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(3)通過F丄ISA方法對其抗體效價、特異件、敏感性、亞類及穩定性進行鑒定。圖1圖示的是人T.抗原MPA-BSA與MPA-OVA的紫外掃描鑒定結果。本發明的優點本發明所提供的雜交瘤細胞株M68F9分泌MPA特異性抗體的性能穩定，所分泌的單克隆抗體特異性強，親和力良好，其間接競爭ELISA敏感度可達0.05-0.01ng/mL。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。本領域技術人員應理解，這些實施例僅用于說明本發明而絕不對本發明的范圍構成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。實施例實施例1人工抗原MPA-BSA與MPA-OVA的合成鑒定首先將MPA與鹽酸羥胺反應生成HON=MPA，再與琥珀酸酐反應制得MPA-HS，最后分別通過碳二亞胺法、混合酸酐法將MPA偶聯到牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清白蛋白(OVA)上制備免疫原(MPA-BSA)與包被原(MPA-OVA)。1.1MPA的肟化稱取85mg(約0.25mmol)MPA溶于20mL甲醇，與溶于10mL雙蒸水的鹽酸羥胺(21mg)混合，在冰浴條件下反應2.5h，其間滴入0.05mol/L的NaOH溶液約7mL。反應后滴入醋酸鹽緩沖液約5mL，并加入碎冰約25mg，出現白色沉淀，在4"下靜置ld，獲得肟化MPA(HON-MPA)。同時，按1:2取一定量GF254硅膠和0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液研磨均勻至糊狀，涂布于玻璃板上自然晾干，制備薄層色譜(ThinLayerChromatography,TLC)板，以氯仿為展開劑對反應產物和MPA進行TLC監測。1.2MPA的酰化將1.1中反應液3000Xg離心20min，棄上清液，取出A色沉淀用20mL二甲基甲酰胺溶解后，加入50mg琥珀酸酐，室溫反應2h，隨后加入三乙胺100ML，繼續反應1h，制備酰化產物(MPA-SH)同上以氯仿丙酮(10:1)為展開劑對反應產物和肟化MPA進行TLC分析。1.3MPA-BSA的合成稱取400mgBSA溶于10mL0.01mol/LPBS(pH8.0)溶液中，各加入100mgEDCI，然后逐滴滴加上述酰化產物，反應lh后，再加50mgEDCI，閉光攪拌反應過夜。收集反應液用雙蒸水透析2d，此過程換液3-5次，然后置于FTSEI585-Q冷凍T燥儀中冷凍干燥，一70'C保存備ffl。1.4MPA-OVA的合成稱取50mgOVA溶于10mL0.01mol/LPBS(pH8.0)溶液中，逐滴滴加上述反應產物，用1mol/L的NaHC03調節pH值為9.0，室溫攪拌1h后，置4。C攪拌反應過夜。同1.3進行透析、冷凍、干燥和保存。1.5MPA人工抗原的紫外線掃描法鑒定精確稱取一定量的MPA、BSA、OVA、MPA-BSA和MPA-OVA，溶解于超純水屮，使其濃度分別為20lag/mL、100lag/mL、100|ag/mL、100ng/mL和100|ig/mL的溶液'在ND-1000紫外分光光度計進行掃描，記錄結果，并按照相關文獻進行偶聯比估算。1.6MPA人工抗原的SDS-PAGE鑒定根據相關文獻方法進行如下操作。(1)配制12%的分離膠(5mL)，依次加入各成分充分混勻。(2)迅速在兩塊玻璃板之間隙注入丙烯酰胺溶液，留出積層膠所需的空間，小心覆蓋一層蒸餾水。(3)分離膠聚合30mim傾出覆蓋的水層，并用吸水紙吸干殘余的水。(4)配制5免的積層膠1mL。(5)在己聚合的分離膠上直接灌注積層膠，并立即插上一塊干凈的Teflon梳子并注意不要混入氣泡。(6)積層膠聚合后，小心拔出梳子，將凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸緩沖液。(7)稱取一定量BSA、OVA、MPA-BSA和MPA-OVA，均用超純水稀釋至濃度約200ng/mL，加入等體積的2XSDSLoadingBuffer混合，IOO'C煮沸5-10min的樣品10pL。(8)在80V電壓下電泳，當溴酚蘭前沿進入分離膠后，提高電壓至120V，直至溴酚蘭到達分離膠底部，關閉電源。(9)將分離膠取出后放入適量考馬斯亮^染色液中，室溫條件下在搖床上染色過夜。(10)將凝膠浸入脫色液中，室溫條件下在搖床上脫色60min左右，再于水中浸泡，在凝膠成像系統中拍照保存并進行分析。1.7合成抗原的反應原性檢測分別稱取合成抗原MPA-BSA和MPA-OVA溶于超純水使其含量為120pg/mL，再依次倍比稀釋l:21、l:22、l:23、l:24、l:25禾tll:26。根據MedroxyprogesteroneAcetateEIAKit(5131MPAlp[3]08.05)說明書進行(競爭ELISA)操作如下取出試劑盒及相關試劑，平衡至室溫，進行試劑配制；Al、A2為空內對照(調零孔)，加入100iiL稀釋液；Bl、B2為陰性對照，加入50nL稀釋液；Cl、C2H1、H2陽性對照PC1PC6，MPA質量濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.2ng/mL，每孔加入5C^L;在選定的檢樣孔中加入50pL待檢樣品。除A1、A2孔外，其他孔各加25pLMPA-HRPO(連接液)；除Al、A2孔外，其他孔再各加25nL抗體溶液；封上板子，振搖幾分鐘，37'C避光孵育lh;倒去反應液，用300MLRinsingBuffer洗每孔3次，最后在吸水紙上拍干板子；每孔加入100pL底物溶液，20。C25。C避光孵育30min;每孔加入100|iL終止液，立即在450nm測定OD值，進行結果分析。試驗結果將合成的抗原進行紫外線全波長掃描和SDS-PAGE法分析鑒定，結果見圖1和圖2。由圖l可知MPA、BSA和OVA的最大特征吸收峰波長分別為240，279和2S0nm，人工抗原MPA-BSA和MPA-OVA最大特征吸收峰波長分別為259和260nm，與MPA、BSA最大特征吸收峰相比，發生了偏移，表明MPA被成功偶聯到載體蛋白上；根據公式偶聯比=(e偶聯物-e載體)/e半抗原可以估算出MPA與BSA、OVA的偶聯比分別為12:1、8:1;由圖2可以看出MPA-BSA和MPA-OVA的遷移率分別比偶連載體BSA、OVA遷移率小，表明MPA已經偶聯到載體蛋白上，根據分子量大小估算出的偶聯比與紫外線全波長掃描法估算的結果相符。MPA-EIA(阻斷ELISA)檢測結果(見表1):山表1可知，陰性對照與不同濃度校準陽性對照均成立，檢樣孔的OD450nm值與其對應稀釋倍數成反比。因此表明，所檢測樣品中均含有MPA反應原性決定簇，人工抗原MPA-BSA和MPA-OVA合成過程中沒有破壞MPA抗原活性的宮能團。表1人工抗原的ELISA檢測結果(r)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注NC為陰性對照，PC1~PC6為MPA不同含量的陽性對照。實施例2動物免疫取6-7周齡的雌性BALB/c小鼠5只，用完全佐劑乳化MPA-BSA按0.5mg/mL，0.2mL/只的劑量背部皮下多點注射進行首次免疫，以后每隔20d用不完全佐劑乳化MPA-BSA，加倍劑量進行再次免疫，第四次免疫后7d尾靜脈采血，以MPA-OVA為包被原用間接ELISA法和阻斷ELISA法檢測抗體效價與血清抗體抑制濃度(IC50)。間接ELISA法步驟包被用合成的OVA-DES包被板子，4'C冰箱過夜；洗滌用PBST(0.01PBS+0.05呢Tween20)洗滌4次后，拍干；封閉用封閉液(0.01PBS+1呢OVA)進行封閉，每孔200pL含1X0VA的PBS封閉液，37。C溫箱中孵育lh，同上洗滌4次，拍干；抗體檢測在每孔加上不同稀釋度的血清樣品，各100nL，置37。C溫箱孵育45min，同上洗滌拍干；然后加入1:2000稀釋的山羊抗鼠酶標二抗100nL/孔'3^C溫箱孵育45min,同上洗滌拍干；顯色加入TMB底物100pL/孔，37。C溫箱孵育15min;終止每孔加入50(iL終止液；讀判在酶標儀上測定各孔OD450nm值。以OD450nm大于陰性對照2倍以上的為陽性。間接阻斷ELISA法步驟將MPA標準品儲存液稀釋成500|ig/mL、100|ig/mL、50|ig/mL、10(ig/mL、1|jg/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL、0.01ng/mL、0.005ng/mL、0.001ng/mL和MPA零對照孔，每個濃度分別取20(^L與200nL工作濃度的血清抗體在37'C孵育反應1h，在加入到包被封閉好的ELISA板孔內，200pL/孔，37'C孵育反應lh，以下歩驟同間接ELISA方法。選擇效價高且ICso低的小鼠融合前3d腹腔注射0.2mL1.0mg/mL的MPA-BSA(不加佐劑)進行加強免疫。實施例3雜交瘤細胞株的建立3.1細胞融合根據PEG1500(Roche10783641001)使用說明，按試驗室常規操作進行飼養細胞的制備和細胞融合，逐日觀察，6d后更換新鮮配置的HAT培養基。待融合細胞生長至孔底約1/101/5，吸出上清液，采用間接ELISA法檢測細胞上清抗體，進行陽性雜交瘤的篩選。3.2雜交瘤篩選、克隆與亞克隆選擇抗體陽性孔進行24孔板分孔擴增培養，再次陽性篩選，將強陽性孔融合細胞按l:3:5的有限稀釋法進行克隆和亞克隆，建立單克隆抗體陽性的雜交瘤。3.3腹水制備取6周齡雌性BALB/c小鼠，按常規操作制備腹水，分裝后保存于-7(TC冰箱保存備用。試驗結果取MPA-BSA5次免疫后的BALB/c小鼠脾細胞與SP2細胞進行融合，融合率95.8%(16/384)，采用間接ELISA篩選，陽性率27.2%(100/368)，經過3次亞克隆后獲得1株穩定分泌抗MPA抗體的雜交瘤細胞株，命名為M68F9。實施例4單克隆抗體特性的鑒定4.1單抗腹水效價的測定用稀釋液將腹水從1:10000開始倍比稀釋，采用間接ELISA法檢測抗體效價。4.2單抗敏感性測定按照實施例2中間接阻斷ELISA方法進行，將工作濃度稀釋的腹水抗體與不同濃度MPA標準品37'C結合反應1-2h后，進行間接ELISA，測定腹水抗體MPA的IC50。4.3單抗特異性測定根據相關參考文獻，按照4.2步驟，測定甲地孕酮、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和己烯雌酚的阻斷濃度(IC50)，計算其交叉反應率CR%=IC5o_MPA/IC5QX100%(式中ICm5，為檢測藥物的ICso)。4.4親和力檢測改組MedroxyprogesteroneAcetateEIAKit(5131MPAlp[3]08.05)，根據競爭ELISA原理，按下列操作進行抗體親和力的鑒定(每個檢樣做兩孔，結果取平均值)(1)Al、A2為空白對照(調零孔)，加入100)JL稀釋液；Bl、B2為陰性對照，加入50)iL稀釋液；在選定的檢樣孔屮加入50iaL單克隆抗體細胞培養上清和不同稀釋濃度的腹水抗體。(2)除A1、A2夕卜，其他孔再各加25^L抗體溶液；除Al、A2夕卜，其他孔各加25|iLMPA-HRPO(連接液)。(3)封上板子，振搖幾分鐘，37。C避光孵育lh。(4)棄去反應液，用300nLRimingBuffer洗每孔3次，最后在吸水紙上拍干板子。(5)孔加入100nL底物溶液，2(TC25'C避光孵育30min。(6)每孔加入100pL終止液，立即在450nm測定OD值。4.5單克隆抗體免疫球蛋白亞類的鑒定根據單克隆抗體分型試劑使用說明書，采用抗原介導ELISA進行抗體亞型鑒定，具休步驟如下(l)包被用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋MPA-OVA進行包被'O.lmU孔，4。C過夜；(2)洗滌用PBST(0.01PBS+0.05%Tween20)洗滌4次后，拍干；(3)封閉用封閉液(0.01PBS+19fcOVA)進行封閉，每孔200^L含1M0VA的PBS封閉液，37。C溫箱中孵育1h，同上洗滌4次，拍干；(4)抗體檢測加入陽性融合細胞的細胞上清液，每個亞型作一個重復，共12個孔每種克隆細胞上清，各100pL/孔，置37。C溫箱孵育45min'同上洗滌拍干；然后加入1:1000稀釋的單克隆抗體(IgA、IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3)亞型分型抗體100^L/孔，37°C，30min，同上洗滌拍干；加入1:1000酶標(HRP)兔抗山羊三抗，37°C，30min，同上洗滌拍干；(5)顯色加入現用現配TMB底物100nL/孔，37。C溫箱孵育15min;(6)終止用2mol/LH2SO4，50HL/孔，450nm下測定各孔的OD值。(7)判讀根據不同亞類二抗的顯色結果，判定該細胞株分泌的單克隆抗體所屬亞類。4.6雜交瘤細胞株穩定性取連續培養5個月的雜交瘤細胞上清和隔周凍存復蘇的細胞株的培養上清，采用間接ELISA法進行培養上清抗體的檢測。試驗結果采用間接ELISA法對單抗腹水效價進行測定，結果見表2，由表2可知，單克隆抗體腹水效價不低于l:1.6xl()S;所制備的單抗的具有良好的敏感性和特異性如表3所示單抗MPA的IC50為3.0ng/mL，靈敏度可達0.01ng/mL;表4可知，除與甲地孕酮交叉反應率為12.5%夕卜、與鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和己烯雌酚交叉反應率均<0.01%，表明制備的單抗是針對MPA的；由表5可知，所制備的單克隆抗體不僅具有特異性，且具有良好的親和力；此外由根據表6可以判斷出單克隆抗體免疫球蛋白亞類為IgGl亞型；經過5個月連續傳代與反復凍存復蘇，單克隆細胞株分泌抗體的性能穩定。表2單克隆抗體效價ELISA測定結果吸光度對照與腹水抗體稀釋度ThedilutionofMcAbagainstMPAandControlsAbsorbance陰性對照陽性對照l:lx104l:xl04l:4xl04l:8xl04l:1.6xl05l:3.2xl05OD45()nm(義)0.09511.44431.98521.48321.08740.58450.26720.1714表3單克隆抗體阻斷ELISA測定結果吸光度對照與MPA標準物濃度(ng/mL)ThedilutionofstandardMPAandControlsAbsorbance陰性對照陽性對照40201042OD450nm(X)0.08161.10650.26420.30650.37260.46650.5272吸光度對照與MPA標準物濃度(ng/mL)ThedilutionofstandardMPAandControlsAbsorbance10.50.10.050.010.00500.59870.68120.74440.85420.92110.98921.1130表4單克隆抗體特異性測定結果常見獸藥Veterinarydrugs交叉反應率Thecross-reactionrate/%甲地孕酮12.5鹽酸克倫特羅<0.01萊克多巴胺<0.01己烯雌酚<0.01表5單克隆抗體競爭ELISA測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6單克隆抗體亞類鑒定ELISA測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它是特異性的結合醋酸甲羥孕酮(MPA)的單克隆抗體。2.如權利要求l所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白來自鼠，屬于IgGl亞類。全文摘要本發明提供了一種鼠抗醋酸甲羥孕酮(MPA)的特異性單克隆抗體M68F9。該抗體由鼠源性雜交瘤細胞系M68F9產生，屬于IgG1亞類免疫球蛋白，具有與MPA結合特異性強，靈敏度高，親和力大的特點。文檔編號G01N33/577GK101240025SQ20081008465公開日2008年8月13日申請日期2008年3月14日優先權日2008年3月14日發明者侯義宏,建劉,吳紹強,楊澤曉,林祥梅,琳梅,賈廣樂,韓雪清申請人:中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫研究所