一株具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株從青藏高原傳統發酵牦牛酸奶中分離出的具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌，保藏號為CGMCC?No.9017，能夠顯著降低總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，能夠應用于發酵乳制品的制備以及保健食品和藥品的制備。
【專利說明】一株具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及功能性乳酸菌開發與應用領域，特別是指一株具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌。
【背景技術】
[0002]隨著社會發展人民生活水平不斷提高，日常飲食結構也在不斷變化。不合理的膳食結構所帶來的負面影響是冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發病率不斷提高。而血清中膽固醇的含量被認為是誘發心腦血管疾病的主要因素。
[0003]膽固醇是人體必不可少的營養成分。對人體而言，膽固醇可以合成多種激素；形成膽酸，促進脂肪的消化；構成細胞膜；并有助于血管壁的修復與保持完整功能。正常成年人血液中膽固醇含量在2.82~5.95mmol/L。膽固醇是非水溶性物質，在血液中常結合低密度脂蛋白和高密度脂蛋白進行轉運。低密度脂蛋白的功能是將肝臟中合成的膽固醇轉運到外圍組織，該指標超標意味著過多的膽固醇存在于血液循環之中，血脂升高，造成動脈粥樣硬化。流行病學證實，這是發生動脈硬化最主要的危險因素。高密度脂蛋白的主要功能是運載膽固醇離開細胞回到肝臟，然后經肝臟轉化為其它物質。高密度脂蛋白可防止膽固醇在血管壁的沉積，以維系血液中膽固醇的動態平衡，被認為是抗動脈硬化因子。
[0004]益生菌在自然界中分布廣泛，是一種可以通過改善腸道微生物的平衡，來對宿主產生有益影響的微生物。目前應用最為廣泛的益生菌是乳桿菌和雙歧桿菌等，它們是人體腸道內重要的生理菌，對機體有多種生理作用。益生菌可以調整腸道菌群平衡，提高蛋白質和維生素的代謝，產生抗菌素來抑制有害菌群生長，抗腫瘤，增強免疫力，降低血清膽固醇，抗氧化延緩衰老等。因此將益生菌應用于功能性食品開發具有重要意義。但是，現用的乳酸菌的降膽固醇能力較低，例如，尹軍霞等(2008)從發酵蔬菜汁中分離出一株降膽固醇能力較好的乳酸乳球菌，體外降膽固醇能力達到47.58%。陸曉娜等(2006)從新疆馬奶酒中分離出了 10株降膽固醇能力最強的乳酸菌，降解率最強的為61.7%。居華(2007)從酸奶中分離得到了一株植物乳桿菌，該菌株對化合物源的膽固醇清除率為48.1%，而對蛋黃源膽固醇的清除率為58.22%。此外還有從發酵肉、蔬菜等食品上分離的降膽固醇乳酸菌的報道，但是降解率都不高，在食品保健品及藥品上的應用價值不高。
[0005]因此，篩選出具有高降膽固醇能力的乳酸菌株，對于增強人體的免疫力、降低膽固醇以及維持人體的健康具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0006]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種高原植物乳桿菌，具有高降血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及肝臟脂肪沉積等的作用。
[0007]為實現上述目的，本發明從青藏高原傳統發酵牦牛酸奶中篩選乳酸菌，步驟如下:
[0008](I)從青藏高原傳統發酵牦牛酸奶中分離乳酸菌菌株，并純化，得到純分離的菌株，命名為菌株Lp5 ；
[0009](2)通過過氧化氫酶實驗、革蘭氏染色、菌體形態和16SrRNA序列分析，鑒定步驟(I)得到所述菌株Lp5為植物乳桿菌；
[0010](3)通過領苯二甲醛比色法測定步驟(2)鑒定出的所述菌株Lp5的降膽固醇特性。
[0011]本發明所述具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌Lp5(拉丁文命名為Lactobacillus pi ant arum)已于2014年4月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC N0.9017。
[0012]本發明提供上述具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌具有良好的人工胃液、腸液的耐受性和細胞疏水性，并對維持腸道微生物菌群平衡具有一定作用。能夠應用在制備發酵乳制品及保健食品和藥品中。
[0013]本發明提供上述具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌降解膽固醇的能力非常強，遠遠高于現有的菌株，而且具有良好的人工胃液，人工腸液耐受性和細胞疏水性，能夠廣泛應用在食品和保健品中，可以降低血清膽固醇，提高機體免疫力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例5中SD大鼠糞便中大腸桿菌數量變化對比圖；
[0015]圖2為本發明實施例5中SD大鼠糞便中乳桿菌數量變化對比圖；
[0016]圖3為本發明實施例5中SD大鼠糞便中雙歧桿菌數量變化對比圖；
[0017]圖4為本發明實施例5中SD大鼠第八周血清總膽固醇含量對比圖；
[0018]圖5為本發明實施例5中SD大鼠第八周甘油三酯含量對比圖；
[0019]圖6為本發明實施例5中SD大鼠第八周低密度脂蛋白含量對比圖；
[0020]圖7為本發明實施例5中SD大鼠第八周高密度脂蛋白含量對比圖；
[0021]圖8為本發明實施例5中空白對照組SD大鼠肝臟組織切片圖；
[0022]圖9為本發明實施例5中高膽固醇組SD大鼠肝臟組織切片圖；
[0023]圖10為本發明實施例5中高膽固醇+乳桿菌Lp5組SD大鼠肝臟組織切片圖。
【具體實施方式】
[0024]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明進一步詳細說明。
[0025]實施例1本發明所述具有高降膽固醇能力的植物乳酸桿菌Lp5的篩選和鑒定
[0026]一、樣品來源
[0027]來源于我國青海省果洛藏族自治州傳統發酵牦牛乳制品。
[0028]二、從傳統牦牛乳制品中分離篩選得到乳酸菌
[0029]取Iml發酵牦牛乳制品按1:10比例，用滅菌生理鹽水稀釋，此為KT1稀釋度。然后吸取Iml上述稀釋液，再10倍稀釋，為10_2稀釋度，以此類推。選取10_6稀釋度，吸取10ul稀釋液于SL培養基，37°C厭氧培養48小時，挑取特征菌落，并進一步純化，得到純分離的菌株，命名為Lp5。
[0030]三、對菌株進行鑒定
[0031](I)革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗
[0032]革蘭氏染色:挑取平板上的菌落進行涂片、固定、結晶紫初染、碘液媒染、酒精脫色、番紅復染、干燥、油鏡鏡檢。藍紫色為革蘭氏陽性菌，紅色為革蘭氏陰性菌。
[0033]過氧化氫酶實驗:將菌以劃線的方式接種到PYG斜面培養基上37°C條件下培養48h后，先將菌苔在空氣中暴露30min，滴加3%-15% (體積分數)過氧化氫，2_3分鐘后觀察有氣泡產生的為陽性，無為陰性。
[0034]該菌株革蘭氏染色為陽性，過氧化氫酶實驗為陰性，可初步視為乳酸菌。
[0035](2) 16SrRNA 鑒定
[0036]純化后的乳酸菌在MRS培養基中培養8h后，10000rpm/min離心3_5min收集菌體，按照試劑盒使用方法提取DNA。然后進行PCR擴增，在細菌的通用引物27F和1492R(Moniset al, 2005)的擴增下，進行 16SrRNA 的擴增。擴增條件:95°C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s,72°C lmin30s ;72°C 5min，30次循環。PCR產物送上海美吉生測序公司進行序列分析。將測得乳酸菌菌株 16S rRNA 基因序列用 BLAST (http://wwwncb1.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，與待測菌株同源性最高的已知分類地位的菌種初步確定待測菌株的種屬。利用16S rRNA基因序列同源性分析的方法進行鑒定，基因序列與植物乳桿菌比對，發現與植物乳桿菌的同源性為100%，結合生理生化特征，鑒定菌株Lp5為植物乳桿菌。
[0037]實施例2降膽固醇能力的測定和對比
[0038]調整植物乳桿菌Lp5菌的數量至1.0X 109cfu/mL,按照I %的接種量接種于1ml含有膽固醇50mg/ml的MRS液體培養基里，37°C靜置培養。搖勻后立即取樣lmL，4000rpm/min離心5min，吸取上清液0.5mL，用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量。接種后發酵液于37°C靜置培養48h后用同樣的方法測定上清液中膽固醇含量。采用如下公式計算膽固醇的降解率:
[0039]膽固醇降解率=(Oh上清液中膽固醇含量一 48h上清液中膽固醇含量)/Oh上清液中膽固醇含量X 100%
[0040]表1植物乳桿菌Lp5降膽固醇率
[0041]
Oh上清液膽固醇含量 48h上清液膽固醇含量膽固醇降解率
mg/mlmg/ml(%)
0.050 ±0.0010.014 + 0.00272.59 ±2.43
[0042]本發明所篩選的植物乳桿菌Lp5對膽固醇的降解率為72.59%，高于現有文獻報道的植物乳桿菌或其他乳酸菌菌種對膽固醇的降解程度。
[0043]實施例3:消化道模擬試驗
[0044]將挑選的植物乳桿菌Lp5進行人工胃液，人工腸液耐受性實驗。
[0045]對人工胃液耐受性測定:菌體活化2代后種子液5000r/min離心10min，滅菌生理鹽水洗滌3次后懸浮。取菌懸液I mL于過濾除菌的人工胃液中(含pH3.0人工胃液9mL)，混勻后37°C恒溫靜置培養。在實驗一開始和3h后分別取樣，滅菌生理鹽水10倍稀釋。選取適當稀釋度，取0.1 mL菌懸液于MRS平板中涂布，設2個重復。37°C厭氧恒溫培養48h后計數。試驗結果見表2。
[0046]對人工腸液耐受性測定:取ImL處理3h的含菌人工胃液，接種于9mL除菌的人工腸液中，人工腸液PH8.0。37°C恒溫靜止培養，在試驗開始0h、3h、6h分別取樣，滅菌生理鹽水適當稀釋，選取適當稀釋度涂布，方法同上。37°C厭氧恒溫培養48h后計數。用平板計數法測定活菌數，計算其存活率(％)。試驗結果見表3。
[0047]存活率) = lgN/lgNQX 100% (N——消化一定時間后消化液中活菌數；NQ——消化Oh的活菌數。)
[0048]實驗結果表明植物乳桿菌Lp5具有良好的耐胃液腸液的能力。
[0049]表2.植物乳桿菌Lp5在pH3人工胃液中消化3h存活率
[0050]
【權利要求】
1.一種具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌，保藏編號為CGMCC N0.9017。
2.—種權利要求1所述的植物乳桿菌的篩選鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從青藏高原傳統發酵牦牛酸奶中分離乳酸菌菌株，并純化，得到純分離的菌株； (2)通過過氧化氫酶實驗、革蘭氏染色、菌體形態和16SrRNA序列分析，鑒定步驟(1)得到所述菌株為植物乳桿菌； (3)通過領苯二甲醛比色法測定步驟(2)鑒定出的所述植物乳桿菌的降膽固醇特性。
3.權利要求1所述的具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌在制備發酵乳制品中的應用。
4.權利要求1所述的具有降低膽固醇能力的植物乳桿菌在制備保健食品和藥品中的 應用。
【文檔編號】A61K35/74GK104073455SQ201410272956
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】郭旭生, 丁武蓉, 石超, 柯文燦, 保安安, 陳明 申請人:蘭州大學