小檗堿用于促進生成線粒體和改善線粒體功能的制作方法

小檗堿用于促進生成線粒體和改善線粒體功能的制作方法
【專利摘要】本發明涉及小檗堿在制藥方面應用，將小檗堿用于促進線粒體生成和改善線粒體功能。小檗堿可促進皮下白色脂肪棕色化，用于增加促進皮下白色脂肪組織、棕色脂肪組織、原代棕色脂肪細胞產熱相關基因的表達。
【專利說明】小檗堿用于促進生成線粒體和改善線粒體功能

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥和生理學領域，具體為小檗堿在制藥方面應用，將小檗堿用 于促進線粒體生成。

【背景技術】
[0002] 隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖及其相關性疾病如2型糖尿病（T2DM)、心腦 血管病等這些以前常見于西方發達國家的與能量代謝相關的疾病現在越來越成為威脅中 國人群健康的重要疾病。據統計，目前中國成年人中超重和肥胖的發病率分別為30. 6%和 12.0%。如此高的發病率以及各種嚴重的并發癥，使得對肥胖的防治已然成為一項全民性 問題。
[0003] 肥胖的發生是由于機體能量攝入超過能量消耗，基于這一能量代謝平衡原理，限 制能量攝入，或者增加能量消耗，或者兩者兼顧顯然是治療肥胖的三種基本策略。然而人們 往往會首選限食來減輕體重，考慮到限食對機體造成的不良影響，增加機體能量消耗無疑 是更為理想的治療方法。常規增加機體能量消耗的方法是通過運動、體育鍛煉增強骨骼肌 收縮、做功來實現。然而在現代高節奏的社會背景下很少有人能進行合理規律的體育鍛煉。 因此人們將治療肥胖的希望寄托于尋找能夠增強機體代謝的新型藥物上。
[0004] 在人和其他哺乳動物體內有兩種不同的脂肪組織，即白色脂肪組織和棕色脂肪組 織。雖然同為脂肪組織，但這兩種脂肪組織無論是體內的分布還是本身功能均完全不同。與 白色脂肪組織體內廣泛分布不同，棕色脂肪組織主要分布于動物的肩甲區、腹部大血管及 頸部血管周圍、腎周、胸部動脈和下腔靜脈周圍等局限的區域內。
[0005] 以往的觀點認為棕色脂肪只存在于新生或幼小的哺乳動物體內，并且會隨著年齡 的增長逐漸消失，但近年研究發現在成年哺乳動物體內也有棕色脂肪的存在，而且會隨著 外界環境改變而發生相應變化。白色脂肪組織的主要功能是為機體儲存能量，除此之外近 年研究發現白色脂肪組織還具有內分泌功能，能夠分泌許多具有代謝調節作用的脂肪因 子，如瘦素、脂聯素。棕色脂肪雖然早在1551年就已經被人們發現，但直到近幾十年人們才 逐漸弄清它的生理功能。1961年始有關于棕色脂肪具有產熱功能的報道，然而，將棕色脂肪 與能量代謝及肥胖聯系在一起只有20幾年時間。白色脂肪組織中的脂肪細胞被體積大小 不一的脂滴所充滿，而且這些脂滴會不斷的融合成更大的脂滴。而棕色脂肪組織中的脂肪 細胞體積較小，細胞中脂滴體積小且均一，細胞內含有大量線粒體，細胞周圍有豐富的毛細 血管，交感神經纖維直接到達棕色脂肪組織的細胞膜上。另外，在棕色脂肪組織細胞的線粒 體內膜上特異表達一種解偶聯蛋白，即解偶聯蛋白1 (UCP1)。脂肪酸經三羧酸循環在線粒體 內膜兩側形成的質子勢能會經過UCP1以熱能形式散發，進而促進了能量的消耗。
[0006] 骨骼肌在調控糖脂代謝過程中發揮著重要作用。研究證實在人體內大約80%以上 的葡萄糖要經過骨骼肌轉化代謝。這其中大部分直接經糖酵解途徑或三羧酸循環分解代謝 生成ATP為機體提供能量，其余以糖原的形式儲存在骨骼肌和肝臟中，以備在饑餓或應激 狀態下為機體提供血糖。當血液中葡糖糖突然升高時，骨骼肌細胞在胰島素的作用下可以 快速攝取葡萄糖進而維持血糖水平穩定。當機體處于饑餓狀態時，骨骼肌還可以直接利用 脂肪酸、酮體等能量物質，進而為大腦等以葡萄糖為單一能量底物的重要臟器節省葡萄糖。 由此可見，骨骼肌在機體葡萄糖和脂肪酸代謝過程中起著非常關鍵的作用。
[0007] 研究證實2型糖尿病患者骨骼肌纖維萎縮、肌力下降、胰島素敏感性降低。另有研 究報道，骨骼肌細胞中線粒體功能障礙在2型糖尿病的發病中起著非常重要的作用。體育 鍛煉是目前預防和治療糖尿病和肥胖的一種非常有效的措施。通過體育鍛煉可以促進骨 骼肌細胞增殖，增強肌力，促進肌纖維類型的轉換，使酵解型快收縮肌纖維（I型骨骼肌纖 維）數量減少，而氧化型慢收縮肌纖維（II型骨骼肌纖維）增多，加強對葡萄糖、脂肪酸氧 化利用。
[0008] 小檗堿（Berberine，BBR)又名黃連素，是從我國傳統中藥黃連中提取出來的一種 季胺類生物堿。黃連用于治療消渴癥在我國醫藥典籍中早有記載。而BBR為黃連的主要成 分一直以其抗感染作用應用于臨床。研究證實BBR不但具有較廣的抗菌譜，而且對病毒和 真菌感染也有一定作用。上世紀80年代，我國臨床工作者在應用BBR治療胃腸道感染性疾 病過程中發現BBR具有降低血糖的作用。隨后幾年，同一研究團隊開展應用BBR治療T2DM 的研究并取得了較好的療效。近年研究發現，BBR具有調節機體代謝的作用。體內和體外 實驗均證實BBR能夠改善胰島素抵抗、高血脂等代謝紊亂狀態。
[0009] 本發明發現，小檗堿能夠增加脂肪細胞、骨骼肌細胞的線粒體，增強其代謝。


【發明內容】

[0010] 本發明旨在提供小檗堿在促進生成線粒體以及提高線粒體功能方面的應用。
[0011] 本發明提供了小檗堿的以下應用：小檗堿在制備促進線粒體生成的藥物方面的應 用。所述線粒體為骨骼肌細胞線粒體、棕色脂肪細胞線粒體、白色脂肪細胞的線粒體。
[0012] 小檗堿在制備提高棕色脂肪代謝活性的藥物方面的應用。
[0013] 小檗堿在制備改善和促進線粒體功能的藥物方面的應用。所述線粒體為骨骼肌細 胞線粒體、棕色脂肪細胞線粒體、白色脂肪細胞的線粒體。
[0014] 小檗堿在制備促進皮下白色脂肪棕色化藥物方面的應用。
[0015] 小檗堿用于增加促進皮下白色脂肪組織、棕色脂肪組織、原代棕色脂肪細胞產熱 相關基因的表達。
[0016] 小檗堿（BBR)可以促進與棕色脂肪細胞相關基因的表達，明顯增強db/db小鼠棕 色脂肪組織代謝活性。BBR在棕色脂肪組織和原代棕色脂肪細胞中可以升高產熱相關基因 如UCP1、PGC-1 a，C0X8b和CIDEA的表達。小檗堿可以增強棕色脂肪代謝活性，降低血糖、 血脂水平，改善糖耐量，增加胰島素敏感性。
[0017] 另外，BBR促進棕色脂肪、白色脂肪及骨骼肌細胞中線粒體生成和功能改善，使白 色脂肪細胞及細胞內脂滴體積明顯變小；BBR可促進皮下白色脂肪發生棕色化改變，表現 為細胞中棕色脂肪細胞特異性基因表達明顯增加，線粒體生成與功能顯著增強；并且直接 促進棕色脂肪細胞能量代謝相關基因表達、線粒體生成與功能改善，使UCP1表達明顯增 多。還通過激活AMPK/PGC-la通路增強脂肪細胞和骨骼肌細胞的代謝功能。促進PGC-la 及其他代謝相關因子表達。在C3H10和C2C12細胞中過表達失活型AMPKa亞基，阻斷內源 性ΑΜΡΚ作用后小檗堿不再促進PGC-la表達并且對線粒體生成和功能的作用也消失。另 夕卜，在C3H10細胞中BBR可以協同PGC-1 α增加 UCP1啟動子的活性，而且這一協同作用依 賴于PGC-1 α分子上的AMPK特異性磷酸化位點。ChIP實驗結果顯示，在C3H10細胞中小檗 堿能夠使UCP1啟動子區的PGC-1 α含量明顯增加。
[0018] 通過增加機體能量消耗的辦法來治療肥胖是當前研究的熱點。本發明證實BBR能 夠激活機體的產熱機制促進機體能量消耗進而達到減輕體重的效果。增強棕色脂肪組織的 產熱活性或使白色脂肪組織獲得棕色脂肪組織那樣的產熱活性是治療肥胖的一種新策略， 也可以作為目前治療肥胖的一種良好的補充方法。
[0019] 結果顯示，從皮下白色脂肪細胞中分離得到的原代脂肪細胞在體外誘導分化為成 熟的脂肪細胞后在BBR作用下可以表現出棕色脂肪樣表型。BBR可以促進皮下白色脂肪 組織及從其原代脂肪細胞的產熱相關基因表達，并使其展現出棕色脂肪樣表型。經BBR干 預的肥胖小鼠皮下白色脂肪組織中這種棕色化細胞明顯增多，這些細胞與經典棕色脂肪細 胞具有相似的表型，即胞內脂滴體積小且呈多房型分布，另外棕色脂肪細胞特異性基因如 UCP1，PGC-1 α，Cidea和DI02表達量明顯升高。在BBR干預組小鼠的脂肪組織中由脂肪氧 化在線粒體內膜形成的質子梯度會通過UCP1的介導直接以熱能的形式散發。用PET-CT證 明BBR可以增強肥胖小鼠棕色脂肪的代謝活性。
[0020] 轉分化是指一種分化成熟的細胞在不經過去分化作用的情況下直接轉化為另外 一種表型和功能均不相同的細胞類型。BBR干預組小鼠皮下白色脂肪組織在發生棕色化改 變的同時伴隨棕色脂肪特異性基因的表達升高。直接作用于白色脂肪細胞使其向棕色脂肪 細胞轉分化是目前治療肥胖及其相關疾病的新探索。
[0021] 在實驗中我們發現，BBR干預組小鼠的內臟脂肪細胞雖然也出現體積縮小的現象， 但整體上并沒有發生棕色脂肪細胞樣的改變，然而內臟脂肪組織中與能量代謝相關的因子 的基因表明顯增高。雖然BBR可以使皮下脂肪組織和內臟脂肪組織中的UCP1的mRNA水平 明顯增高，但BBR對UCP1的蛋白水平的促進作用只見于皮下脂肪組織中。我們的實驗結果 顯示BBR對白色脂肪組織的棕色化作用主要發生在皮下白色脂肪組織中，這具體表現在促 進產熱基因及棕色脂肪樣分子的表達及向棕色脂肪樣細胞表型的轉變。
[0022] 我們發現BBR在棕色脂肪組織和原代棕色脂肪細胞中可以升高產熱相關基因如 UCP1、PGC-1 α，C0X8b和CIDEA的表達。同時，BBR對皮下白色脂肪組織中的產熱相關基因 也有明顯的促進作用。研究證實包括轉錄共激活因子PGC-la在內的多種轉錄復合體均可 以促進UCP1的表達。PGC-la在棕色脂肪產熱活性和增強線粒體生成過程中發揮著非常 重要的作用；PGC-la在棕色脂肪組織高表達而在白色脂肪組織低表達，在白色脂肪組織 中異位表達PGC-1 α可以使白色脂肪組織獲得棕色脂肪組織樣的特征，包括線粒體生成增 多，脂肪酸氧化和產熱相關基因表達增強等。
[0023] 通過原代脂肪細胞及經典脂肪細胞系在體外進行的相關實驗顯示，BBR對脂肪細 胞具有直接的作用，這一作用與體內的結果相似。這在很大程度上證實了 BBR對脂肪細胞 的直接作用。
[0024] 本發明證實，BBR可以激活或增強機體的產熱機制進而表現出有效的減輕體重的 作用。我們進一步的研究發現BBR通過激活ΑΜΡΚ和PGC-la這一調節機體能量代謝的通 路促進UCP1表達的分子機制。通過上述工作我們證實BBR具有增強棕色脂肪組織產熱和 促進白色脂肪棕色化的重要作用。這一發現為BBR用于肥胖的治療打下了良好理論基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠代謝活性
[0026] 圖2為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織所占體重比值
[0027] 圖3為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織HE染色結果
[0028] 圖4為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織的透射電鏡圖
[0029] 圖5為實施例1中為BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織線粒體DNA(mtDNA) 拷貝數
[0030] 圖6為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織線粒體生成相關轉錄因 子及棕色脂肪特異性因子的mRNA水平
[0031] 圖7為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織線粒體功能相關因子的 mRNA水平
[0032] 圖8為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織脂肪酸氧化代謝相關因 子的mRNA水平
[0033] 圖9為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠棕色脂肪組織內UCP1、PGC-1 α、 Ρ-ΑΜΡΚ的蛋白表達量
[0034] 圖10為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠的原代棕色脂肪細胞代謝相關因子 mRNA水平
[0035] 圖11為實施例1中BBR處理組和對照組小鼠的原代棕色脂肪細胞代謝相關因子 的蛋白表達量
[0036] 圖12為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的皮下白色脂肪細胞形態（HE染色）
[0037] 圖13為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的皮下白色脂肪細胞的透射電鏡圖
[0038] 圖14為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的皮下白色脂肪細胞的線粒體 DNA(mtDNA)拷貝數
[0039] 圖15為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的皮下白色脂肪細胞的棕色脂肪特 異性因子及PGC-la表達量（mRNA)
[0040] 圖16為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的皮下白色脂肪細胞的棕色脂肪特 異性因子的蛋白表達量
[0041] 圖17為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的原代皮下白色脂肪細胞能量代謝 相關因子mRNA水平
[0042] 圖18為實施例2中BBR處理組和對照組小鼠的原代皮下白色脂肪細胞能量代謝 相關因子的蛋白表達量
[0043] 圖19為實施例2中不同濃度BBR對C3H10T1/2細胞mtDNA拷貝數的影響
[0044] 圖20為實施例2中不同濃度BBR下細胞檸檬酸合成酶（CS)活性（體現線粒體功 能）
[0045] 圖21為實施例2中不同濃度BBR對C3H10T1/2脂肪細胞中UCPUPGC-1 a、P-AMPK 等代謝相關因子蛋白表達水平的影響
[0046] 圖22為實施例3中BBR處理組和對照組小鼠的內臟白色脂肪組織細胞形態（HE 染色）
[0047] 圖23為實施例3中BBR處理組和對照組小鼠的內臟白色脂肪組織細胞能量代謝 相關因子的蛋白水平
[0048] 圖24為實施例3中BBR處理組和對照組小鼠的內臟白色脂肪組織細胞能量代謝 相關因子的mRNA水平
[0049] 圖25為實施例4中BBR處理組和對照組小鼠的骨骼肌組織中甘油三酯含量
[0050] 圖26為實施例4中BBR處理組和對照組小鼠的骨骼肌組織電鏡圖片
[0051] 圖27為實施例4中BBR處理組和對照組小鼠的骨骼肌組織中線粒體DNA拷貝數
[0052] 圖28為實施例4中BBR處理組和對照組小鼠的骨骼肌組織中檸檬酸合成酶（CS) 活性（體現線粒體功能）
[0053] 圖29為實施例4中BBR對C2C12骨骼肌細胞線粒體拷貝數的影響
[0054] 圖30為實施例4中BBR對C2C12骨骼肌細胞中檸檬酸合成酶（CS)活性的影響 (體現線粒體功能）
[0055] 圖31為實施例4BBR對C2C12骨骼肌細胞中能量代謝相關因子的影響。

【具體實施方式】
[0056] 所使用的小鼠為：8周齡雄性、健康SPF級C57bl/Ksj_db/+m L印rdb(db/db)小鼠， 購于南京大學模式動物研究所。db/db小鼠飼養條件：環境溫度為22±0. 5°C，12小時/12 小時明暗交替。
[0057] 普通飼料由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，基本組成：魚粉、小麥、玉米、 豆柏、植物油、奶粉、苜蓿草粉、各種維生素、礦物質、必需氨基酸等。普通飼料熱量組成為碳 水化合物占65 %、蛋白質22 %、脂肪5 %、纖維和其它成份8 %。每1克飼料含熱量3. 3Kcal。
[0058] 實施例1 BBR增強db/db小鼠棕色脂肪組織代謝活性
[0059] db/db小鼠經普通飼料適應性飼養一周后，隨機分成溶劑對照組（Vehicle)和小 檗堿干預組（BBR)兩組，并按體重、空腹血糖校準。分組后開始給予藥物干預，小檗堿干預 組給予Smg+kg-Scf 1小檗堿溶液腹腔注射，空白溶劑對照組給予腹腔注射對照溶劑。
[0060] 給藥滿4周時開始動物取材。動物禁食16小時后，摘眼球留取血標本，用斷頸法 處死小鼠，腹面朝上固定四肢，酒精棉球消毒腹部皮膚，迅速從腹部正中線剪開腹腔，快速 剪取肩胛間區棕色脂肪組織、附睪周脂肪、腹股溝區脂肪、股四頭肌、腓腸肌等組織，其中部 分組織放入4%多聚甲醛固定液中固定12-24小時后，做HE染色，部分組織放入2%戊二醛 固定液中固定，行電鏡觀察。其余組織迅速放入液氮中，后轉入負80°C冰箱凍存備用。
[0061] 1、BBR增強db/db小鼠棕色脂肪組織代謝活性
[0062] 研究報道，以2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖（18F-FDG)為示蹤劑的PET-CT可以檢測 成年哺乳動物體內棕色脂肪組織的代謝活性。因此我們應用此技術對實驗小鼠的棕色脂肪 組織進行檢測。結果顯示，BBR處理組小鼠肩胛間區等棕色脂肪聚集的區域PET-CT信號較 對照組小鼠明顯增強。經系統軟件分析，BBR處理組小鼠在上述區域示蹤劑的標準攝取值 (SUV)明顯高于對照組小鼠（vehicle)(圖1)。這說明BBR可以增強棕色脂肪的代謝活性。
[0063] 2、BBR對棕色脂肪細胞形態和結構的影響
[0064] 棕色脂肪組織HE染色結果顯示，BBR處理組小鼠棕色脂肪細胞體積變小，胞內脂 滴減少（圖3)。與此相符，BBR處理組小鼠棕色脂肪組織所占體重的比值低于對照組小鼠 (如圖2)。這說明BBR雖然增強了棕色脂肪代謝活性，但并沒有使棕色脂肪的總量增加。進 一步，我們應用透射電鏡技術對棕色脂肪的亞細胞結構進行了觀察。結果顯示，BBR處理組 小鼠棕色脂肪細胞內線粒體數量明顯增多（圖4)。通過檢測線粒體DNA拷貝數（mtDNA)的 方法同樣證實BBR使棕色脂肪細胞線粒體數量增多的作用（圖5,棕色脂肪組織mtDNA拷貝 數的相對水平）。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干預組小鼠與空白溶劑對照組小鼠 對比，**p < 〇· 01η = 5。
[0065] 3、BBR促進棕色脂肪組織能量代謝相關因子表達
[0066] 為了進一步探討BBR上述作用的機制，我們檢測了棕色脂肪組織中與能量代謝密 切相關的一些因子的表達情況。A-C實時定量PCR(Real-time PCR)分析顯示BBR明顯升 高棕色脂肪組織代謝相關因子mRNA水平，包括線粒體生成相關轉錄因子及棕色脂肪特異 性因子（圖6)，線粒體功能相關因子（圖7)，脂肪酸氧化代謝相關因子（圖8)。結果顯 示，在BBR處理組小鼠棕色脂肪組織內產熱相關基因 UCP1及其他棕色脂肪特異性分子如 CIDEA，C0X8b，lsdp5等表達量明顯升高。與線粒體生成密切相關的轉錄因子，如PGC-1 α、 ERR a、NRF-1在BBR處理組小鼠棕色脂肪組織內的表達水平明顯升高。另外，蛋白免疫印 跡（Western-blot)結果顯示反映線粒體功能及脂肪酸氧化代謝的相關因子基因的表達 水平也有了顯著升高。蛋白免疫印跡結果顯示，在BBR干預組小鼠棕色脂肪組織內UCP1、 PGC-1 α、P-AMPK蛋白表達量也明顯增多（圖9)。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干 預組小鼠與空白溶劑對照組小鼠對比，*Ρ〈〇. 05, #ρ < 0. 01，< 0. 001，η = 5。
[0067] 4、BBR對棕色脂肪細胞的直接作用
[0068] 以上實驗結果顯示BBR可以通過促進能量代謝相關因子表達、線粒體生成進而增 高棕色脂肪組織代謝活性。然而，BBR這種作用是對脂肪細胞的直接作用，還是整體作用 后的間接影響呢？為了證實這一點，我們從棕色脂肪組織分離得到其前體原代細胞，并在 體外進行培養并誘導分化，給予BBR(2. 5 μ M)作用24小時后對上述各類代謝相關因子表 達情況進行檢測。mRNA水平（圖10)和蛋白免疫印跡檢測（Western-blot)蛋白表達水平 (圖11)結果顯示，當BBR直接作用于這種原代棕色脂肪細胞時，上述代謝相關因子在轉錄 和翻譯水平均明顯增加。BBR處理組細胞與對照組細胞對比，*P〈0. 05, #p < 0. 01，***p < 0· 001。
[0069] 實施例2 BBR對皮下白色脂肪細胞形態和結構的影響
[0070] 1、BBR對皮下白色脂肪細胞形態和結構的影響
[0071 ] 為了驗證BBR對白色脂肪組織能量代謝的作用，我們首先觀察了 BBR對皮下白色 脂肪細胞形態和結構的影響。如圖12,腹股溝區白色脂肪組織HE染色結果所示，BBR處理組 小鼠皮下白色脂肪組織（IWAT)中脂肪細胞本身及胞內脂滴體積較對照組小鼠明顯縮小， 進一步透射電鏡結果顯示IWAT細胞內線粒體數目明顯增多（圖13,放大倍數分別為3400 倍和7400倍，箭頭所示為線粒體位置）。mtDNA拷貝數檢測同樣證實在BBR干預組小鼠 IWAT 細胞內線粒體DNA拷貝數明顯增加，線粒體數量比對照組小鼠明顯增多（圖14)。實驗數據 用均數土標準誤表示，BBR干預組小鼠與對照組小鼠對比，*P〈0. 05, η = 5。
[0072] 2、BBR促進皮下白色脂肪組織中棕色脂肪特異性因子表達
[0073] 我們接著檢測了 BBR對皮下白色脂肪組織（IWAT)中代謝相關因子表達的影響。 Real-time PCR檢測發現BBR處理組小鼠白色脂肪組織中UCP1等棕色脂肪特異性因子及 PGC-1 α表達量明顯升高（圖15)。Westenr-blot結果同樣證實UCP1、DI02等棕色脂肪特 異性因子在BBR處理小鼠 IWAT中表達明顯升高，另外PGC-1 α、P-AMPK等重要的代謝相關 因子以及反映線粒體功能的CytoC，脂肪酸氧化代謝相關的CPT II等的蛋白表達水平在BBR 處理組小鼠的IWAT內均明顯升高（圖16)。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干預組小 鼠與對照組小鼠對比，*Ρ〈〇· 05, #p < 0· 01，< 0· 001，η = 5。
[0074] 3、BBR對IWAT細胞的直接作用。
[0075] 為了驗證BBR對白色脂肪細胞的直接作用，應用體外誘導分化的原代皮下白色脂 肪細胞檢測BBR對棕色脂肪特異性因子表達的影響，BBR明顯促進原代IWAT細胞能量代謝 相關因子mRNA(圖17)及蛋白（圖18)的表達。結果顯示BBR在轉錄和翻譯水平均可以促 進這些因子的表達。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR處理組細胞與對照組細胞對比， *Ρ〈0· 05, **p < 0· 01BBR, ***p < 0· 001。
[0076] 4、BBR促進C3H10T1/2脂肪細胞線粒體生成和UCP1表達。
[0077] C3H10T1/2是一種小鼠胚胎來源的間充質干細胞，具有多向分化潛能，可以在體外 不同誘導條件下分化為脂肪、骨骼肌、骨、軟骨以及內皮細胞。在本實驗中，我們將其體外誘 導分化為脂肪細胞，并以此作為研究BBR影響脂肪組織作用機制的細胞模型。
[0078] 應用免疫熒光染色的方法驗證BBR對C3H10T1/2脂肪細胞線粒體生成和UCP1表 達的影響。結果顯示，BBR干預組細胞中反映線粒體數量的Mito-tracker紅色突光及反映 UCP1表達量的綠色熒光明顯增強。另外，BBR可以明顯增加 C3H10T1/2細胞中mtDNA拷貝 數（圖19,不同濃度BBR對C3H10T1/2細胞mtDNA拷貝數的影響）。為了驗證BBR作用下細 胞內增多的線粒體的功能，我們檢測了不同濃度BBR下細胞檸檬酸合成酶（CS)活性，以此 來反映線粒體功能。結果顯示BBR干預組細胞CS活性明顯升高（圖20)。進一步，我們通 過蛋白免疫印跡實驗證實BBR能夠明顯增加 C3H10T1/2脂肪細胞中UCP1、PGC-1 α、P-AMPK 等代謝相關因子蛋白水平（圖21)。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干預組小鼠與對 照組小鼠對比，*Ρ〈〇· 05, **p < 0· 01，***p < 0· 001，η = 5。
[0079] 5、BBR協同PGC-1 α增強UCP1啟動子活性
[0080] PGC-1 α是一種非常重要的轉錄共激活因子，它可以通過多種途徑調節機體能量 代謝，如控制線粒體生成，促進脂肪酸、葡萄糖氧化代謝，調控骨骼肌纖維類型轉化等。研究 報道，PGC-la可以作為UCP1的上游調控因子促進其表達。在本部分實驗中我們發現，BBR 在體內棕色脂肪組織和白色脂肪組織，體外原代脂肪細胞及C3H10T1/2脂肪細胞中均可以 明顯增加 UCP1和PGC-1 α在轉錄和翻譯水平的表達。那么在BBR促進脂肪細胞UCP1表 達的過程中是不是也需要PGC-la的參與呢？為了證實這一點我們構建了帶有UCP1啟動 子的報告基因質粒，用脂質體轉染的方法將其導入HEK293細胞，然后分別觀察BBR、過表達 的PGC-la及兩者聯合對UCP1啟動子活性的影響。結果顯示，BBR單獨作用并不能使UCP1 啟動子活性增強（雖然與對照組相比有略微升高的趨勢，但并無統計學意義），而過表達的 PGC-1 α可以明顯增強UCP1啟動子活性（約為對照組基礎值的2倍），當BBR與過表達的 PGC-la聯合作用時UCP1啟動子活性在過表達PGC-la作用的基礎上有了進一步的增強 (約為對照組基礎值的3. 5倍）。這說明BBR可以協同PGC-1 α作用于UCP1啟動子。
[0081] 實施例3 BBR對內臟白色脂肪（EWAT)組織的影響
[0082] 機體內的白色脂肪組織根據分布部位的不同又可分成皮下白色脂肪組織和內臟 白色脂肪組織。近年的研究證實在胰島素抵抗及2型糖尿病的發生過程中內臟白色脂肪發 揮著更為重要的作用。因此我們在實驗中同時觀察了 BBR對內臟白色脂肪的影響。首先， 組織HE染色結果顯示，BBR干預組小鼠體內的附睪周圍的白色脂肪組織細胞體積明顯縮小 (圖22)。這說明BBR促進了白色脂肪細胞對其胞內脂肪的消耗。接著我們對能量代謝相 關因子的表達情況進行了檢測。結果顯示BBR可以明顯增加這些因子的mRNA和蛋白的水 平（圖23和圖24的A、B、C)。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干預組小鼠與對照組 小鼠對比，*Ρ〈〇· 05, **p < 0· 01，***p < 0· 001，η = 5。
[0083] 值得注意的是，雖然在內臟白色脂肪組織中BBR可以明顯增加棕色脂肪特異性分 子UCP1的mRNA水平，但我們在內臟白色脂肪組織中并未能檢測到UCP1蛋白水平。然而我 們的結果卻顯示，在內臟白色脂肪組織中另外一種解偶聯蛋白即UCP2的蛋白水平在BBR干 預組有了明顯升高。這說明BBR雖然可以激活內臟白色脂肪組織的代謝活性，但并不能有 效促進其棕色化。
[0084] 實施例4 BBR對db/db小鼠骨骼肌組織及體外骨骼肌細胞的影響
[0085] 1、C2C12骨骼肌細胞體外培養及誘導
[0086] 將C2C12成纖維細胞接種于培養皿或細胞培養板中，用含10% FBS和100u/ml青 霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養液（生長培養液）與37°C、5% C02細胞培養箱中進行培養， 當細胞密度達到70-80%左右時即進行傳代、鋪板，當培養板中細胞密度達90%后，換用含 2%馬血清，100u/ml青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養液（誘導分化培養液），每2天換液 一次，4 一 6天后90%以上的細胞融合成為多核的肌管細胞，此時可用于實驗操作。取8? 12代細胞用于實驗。
[0087] 2、BBR降低db/db小鼠骨骼肌組織中甘油三酯含量
[0088] 骨骼肌組織中甘油三酯沉積既是引起骨骼肌胰島素抵抗的原因，又可以視為胰島 素抵抗在骨骼肌的結果。運動可以改善糖尿病患者的胰島素抵抗狀態，同時可以減少骨骼 肌組織中甘油三酯沉積，增強骨骼肌對胰島素的敏感性。在我們實驗中發現，經BBR干預的 db/db小鼠骨骼肌組織中甘油三酯含量明顯低于對照組小鼠（圖25)。實驗數據用均數土 標準誤表示，BBR干預組小鼠與對照組小鼠對比，*P〈0. 05, < 0. 01，< 0. 001，η = 5〇
[0089] 3、BBR促進db/db小鼠骨骼肌線粒體生成和功能改善
[0090] 研究證實骨骼肌細胞線粒體功能與胰島素抵抗及2型糖尿病的發生具有密切關 系。在前面的實驗中我們發現，BBR能夠降低糖尿病小鼠血糖，改善糖耐量及胰島素抵抗， 而且可以促進脂肪細胞線粒體生成。那么BBR對骨骼肌細胞中線粒體會有怎樣的影響呢？ 首先，我們的骨骼肌電鏡結果顯示，BBR干預組糖尿病小鼠骨骼肌組織中的線粒體數量明顯 增多（圖26)。接著我們應用檢測線粒體DNA拷貝數的方法從另一個角度觀察BBR對骨骼 肌線粒體生成的影響。結果顯示，在BBR干預組小鼠骨骼肌中線粒體DNA拷貝數比對照組 小鼠顯著增多（圖27)。我們通過檢測骨骼肌中檸檬酸合成酶（CS)活性，對骨骼肌線粒體 的功能進行測定。結果發現BBR處理組小鼠檸檬酸合成酶活性較對照組小鼠明顯增強（圖 28)。實驗數據用均數土標準誤表示，BBR干預組小鼠與對照組小鼠對比，*P〈0.05, ***p < 0· 001, η = 5。
[0091] 4、BBR對C2C12骨骼肌細胞線粒體生成和功能的影響
[0092] 我們在體外應用C2C12這種骨骼肌細胞模型對BBR促進骨骼肌細胞線粒體生成 和功能的作用進行了驗證。白藜蘆醇（RSV)和AMPK特異性激動劑AICAR是以被證實的兩 種具有促進線粒體生成的藥物，因此在本實驗中我們用來作為陽性對照。采用不同濃度的 88尺(1、5、1(^]\〇及1?￥(5(^]\〇、4扣41?(50(^]\〇對02(：12細胞線粒體0嫩拷貝數及檸檬酸 合成酶活性的影響如圖29和30,實驗結果顯示，在C2C12細胞中BBR可以明顯升高線粒體 DNA拷貝數和CS活性。
[0093] 5、BBR促進C2C12骨骼肌細胞能量代謝相關因子表達
[0094] 我們進一步在體外C2C12細胞中檢測BBR對線粒體生成和功能相關的基因以及其 他與能量代謝相關基因表達的影響。結果發現在C2C12細胞中BBR能夠明顯升高PGC-1 α 這一與線粒體生成和功能密切相關的轉錄共激活因子蛋白表達水平。如圖31，BBR(1、5、 10 μ M)、RSV(50 μ M)、AICAR50 ( μ Μ)明顯升高C2C12細胞能量代謝相關因子蛋白表達水平。
[0095] Western-blot結果還顯示，BBR可以使ΑΜΡΚ的磷酸化水平明顯升高，這說明BBR 在C2C12骨骼肌細胞中能夠激活AMPK這一能量代謝調節因子。與此同時AMPK下游的乙酰 輔酶A羧化酶（ACC)磷酸化水（P-ACC)平明顯升高，這說明BBR在C2C12可以通過激活AMPK 進而調節糖脂代謝。另外我們的結果還顯示，BBR可以使UCP3蛋白表達水平明顯升高，這 說明BBR在骨骼肌細胞中可以通過促進解偶聯蛋白的表達進而增加細胞的能量消耗。
【權利要求】
1. 小檗堿在制備促進線粒體生成的藥物方面的應用。
2. 權利要求1所述的應用，其特征在于，所述線粒體為骨骼肌細胞線粒體、棕色脂肪細 胞線粒體、白色脂肪細胞的線粒體。
3. 小檗堿在制備提高棕色脂肪代謝活性的藥物方面的應用。
4. 小檗堿在制備改善和促進線粒體功能的藥物方面的應用。
5. 權利要求4所述的應用，其特征在于，所述線粒體為骨骼肌細胞線粒體、棕色脂肪細 胞線粒體、白色脂肪細胞的線粒體。
6. 小檗堿在制備促進皮下白色脂肪棕色化藥物方面的應用。
7. 小檗堿用于增加促進皮下白色脂肪組織、棕色脂肪組織、原代棕色脂肪細胞產熱相 關基因的表達。
【文檔編號】A61P3/10GK104116737SQ201410286441
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】寧光, 張會志, 王衛慶, 張志國 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院