一種水溶性粒毛盤菌黑色素及其作為促排鉛藥物的用途
【專利摘要】本發明公開了一種水溶性粒毛盤菌黑色素及其在制備促排鉛藥物中的用途，特征是該水溶性粒毛盤菌黑色素是將菌種保藏編號為CCTCC?No:M2011054的粒毛盤菌所產胞內黑色素，經氯乙酸修飾后，得到的水溶性粒毛盤菌黑色素；通過對染鉛小鼠促排鉛的作用藥理實驗，表明該水溶性粒毛盤菌黑色素具有顯著的促排鉛功能，且無毒副作用，克服了現有西藥在排鉛的同時，會導致的體內一些必需元素如Zn，Cu，Fe等的損失及某些器官造成損壞的副作用缺點，確立水溶性粒毛盤菌黑色素的促排鉛作用。本發明方法簡單經濟，可將水溶性粒毛盤菌黑色素應用于制備片劑或膠囊劑型的促排鉛藥物服用。
【專利說明】一種水溶性粒毛盤菌黑色素及其作為促排鉛藥物的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于粒毛盤菌黑色素在制備藥物中的應用【技術領域】，具體涉及菌種保藏編號為CCTC CNo:M2011054的粒毛盤菌(Lachnum)的胞內黑色素采用氯乙酸修飾改性后的水溶性黑色素，及其作為制備促排鉛藥物的用途。
【背景技術】
[0002]鉛是威脅人類生命安全和健康的常見重金屬之一。隨著經濟的發展，鉛污染已經從職業環境向日常生活環境擴展。鉛對身體的各個器官系統具有毒性，會削弱機體的抵抗力，增加機體對細菌、病毒的易感性和腫瘤的發生率。目前排鉛通常采用西藥，往往都是在出現明顯中毒癥狀后服用，但不良反應大，不適于長期服用。因此，從天然產物中尋找促排鉛的藥物具有重要的意義。
[0003]黑色素是一類結構復雜多樣的酚類或吲哚類色素的總稱，來源于動物、植物及微生物，一般只溶于堿液，不溶(或微溶)于水及常見的有機溶劑。生物體內的黑色素常被視為一道天然有機屏障，其具有螯合金屬離子能力、抗輻射、抗氧化能力。
[0004]粒毛盤菌屬(Lachnum sp.)是廣泛分布于世界各地的一類腐生性真菌,近幾年，本課題組發現一些粒毛盤菌菌株在深層發酵條件下可產生大量的活性多糖、色素、多酚等。如中國《食品科學》(2009, 30:185-189)及荷蘭《國際生物大分子雜志》(Internat1nalJournal of B1logical Macromolecules, 2014, 63:170-176)介紹了粒毛盤菌一些菌株深層發酵后可產生大量黑色素，具有較強的抗氧化、抗輻射等活性。中國專利號ZL201110072469.2公開了本發明人課題組的一株保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌YM-292(本發明人課題組自定的編號代碼)液態發酵制備胞內黑色素的方法，所制備的胞內黑色素具有較強的光保護作用，且經過毒理性試驗證實其安全無毒，但其室溫下在水中溶解度僅為0.llg/100g。該粒毛盤菌黑色素難溶于水，限制了其在醫藥、食品等領域的應用。將非水溶性黑色素改性為水溶性黑色素，便于人體吸收利用，可充分發揮其保健功能，具有重大意義。目前，國內外對黑色素進行改性的研究較少。中國專利號ZL201210218401.5公開了本發明人課題組的一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，采用黑色素與精氨酸或組氨酸或賴氨酸和水，按質量比為1:0.5~1.5:4.5~50混合，震蕩至黑色素固體溶解后，將溶液冷凍干燥得到水溶性粒毛盤菌黑色素，在O~40°C水中的溶解度提高到了 3.85~4.65g/100g。目前國內外未見有公開文獻提及將粒毛盤菌黑色素采取羧甲基化修飾以改性為水溶性黑色素，以及將其作為制備促排鉛藥物的應用方面的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種采取羧甲基化修飾改性的菌種保藏編號為CCTCCNo:M2011054的粒毛盤菌水溶性黑色素及其在制備促排鉛藥物中的用途，確立菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌水溶性黑色素促排鉛的藥理作用。
[0006]本發明的可作為制備促排鉛藥物用途的水溶性粒毛盤菌黑色素，其特征在于:是將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發酵后提取純化制備得到的胞內黑色素，再對該胞內黑色素采用氯乙酸進行修飾改性后得到的水溶性粒毛盤菌黑色素；即，按:將300mg粒毛盤菌胞內黑色素溶于由5mL濃度為2.0moI/L的NaOH和12mL異丙醇的混合溶液，冰浴中攪拌3h，在攪拌狀態下再緩慢加入3g氯乙酸和由5mL濃度為2.0mol/L的NaOH和12mL異丙醇的混合液，室溫下反應3h，在60°C繼續加反應2h后，溶液冷卻至室溫，加入冰醋酸調節PH至中性，將該溶液于截留分子量為200Da的透析袋中先用自來水透析3d再用蒸餾水透析ld，收集、濃縮溶液，冷凍干燥后，所得到的水溶性粒毛盤菌黑色素。
[0007]本發明的水溶性粒毛盤菌黑色素在制備促排鉛藥物中的用途，其特征在于:是將采用氯乙酸對菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發酵后提取純化制備得到的胞內黑色素再進行氯乙酸修飾改性后得到的水溶性粒毛盤菌黑色素，通過對染鉛小鼠促排鉛的作用藥理實驗，確立水溶性粒毛盤菌黑色素的促排鉛作用；從而按藥劑學的常規制備方法，將有效量的該水溶性粒毛盤菌黑色素與藥用輔料混合加工制備成口服片劑或膠囊服用。
[0008]由于本發明采用的水溶性粒毛盤菌黑色素，是通過將菌種保藏編號為CCTCCNo:M2011054的粒毛盤菌的胞內黑色素，按300mg溶于由5mL濃度為2.0mol/L的NaOH和12mL異丙醇的混合溶液，冰浴中攪拌3h，在攪拌狀態下再緩慢加入3g氯乙酸與由5mL濃度為2.0mol/L的NaOH和12mL異丙醇的混合液，室溫下反應3h，在60°C繼續加反應2h后，溶液冷卻至室溫，加入冰醋酸調節PH至中性，將該溶液于截留分子量為200Da的透析袋中先用自來水透析3d再用蒸餾水透析ld，收集、濃縮溶液，冷凍干燥后，所得到的水溶性粒毛盤菌黑色素。這樣將改性前原來室溫下在水中溶解度僅為0.llg/100g的難溶的粒毛盤菌黑色素，通過采用氯乙酸修飾改性后提高到了溶解度為3.75g/100g的水溶性粒毛盤菌黑色素，解決了原保藏號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌(Lachnum singerianum)胞內黑色素由于難溶于水而不適合用于醫療、食品等領域的問題，對于擴展黑色素的應用領域和適用范圍具有積極意義。實驗表明，該水溶性粒毛盤菌黑色素具有顯著的促排鉛功能，且無毒副作用，克服了現有西藥在排鉛的同時，會導致的體內一些必需元素如Zn，Cu, Fe等的損失及某些器官造成損壞的副作用缺點。本發明方法簡單經濟，可將該水溶性粒毛盤菌黑色素應用于制備片劑或膠囊劑型的促排鉛藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為非水溶性原粒毛盤菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞內黑色素的紅外光譜圖；
[0010]圖2為本發明的采用氯乙酸對粒毛盤菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞內黑色素進行修飾改性后的水溶性黑色素的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0011]下面通過實施例并結合附圖對本發明作進一步具體詳細的說明。
[0012]實施例1:
[0013]一、粒毛盤菌胞內黑色素(LIM)的制備:
[0014]將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌接種于100L發酵罐，培養基配方為:酪氨酸濃度為1.0mmol/L,銅離子濃度為1.lmmol/L,鹿糖質量為25.5g/L,酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH8.0，裝料系數體積比為0.7，接種量為5% (v/v)，培養溫度為27°C，通氣量為l.0L/min，攪拌轉速為180r/min，發酵時間為12d ;將發酵液抽濾，收集菌絲體，60°C烘干，按菌絲體的質量(g)與濃度為lmol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:100混勻，30°C靜置12h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入lmol/LHCl調節pH為I~2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經去離子水洗滌至PH為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入7mol/LHCl后于100°C酸解2h，除去與黑色素結合的蛋白質及碳水化合物。酸解后，抽濾得沉淀，沉淀經雙蒸水洗滌至上清液PH值為7時重新溶于Imol/LNH3.H2O溶液，旋轉蒸發儀蒸去NH3至溶液pH為中性后，依次經乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，以除去脂類物質，萃取后旋轉蒸發除去有機相，水相調PH值為2，以5000r/min離心1min,分離得到的沉淀經去離子水反復洗滌至上清液Cl _定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，即得到菌種保藏編號為CCTCCNo:M2011054的粒毛盤菌胞內黑色素(UM)。
[0015]二、水溶性粒毛盤菌黑色素(CM-UM)的制備
[0016]將上述制備得到的LIM取300mg,溶于由5mL濃度為2mol/L的Na0H、12mL異丙醇的混合溶液，制備該相同的混合溶液7份，冰浴中攪拌3h后，攪拌條件下分別加入1.50、
2.00,2.50,3.00,3.50,4.00和4.50g的氯乙酸溶液，然后再分別加入由5mL濃度為2mol/L的NaOH和12 L異丙醇的混合溶液，繼續在室溫條件下反應3h，然后在60°C反應此后，冷卻至室溫，分別加入冰醋酸調節PH至中性，室溫下振蕩溶解，再進行離心分離，分別取上清液稀釋20倍后測定溶液的吸光度值，以溶液的最大吸光度值來確定氯乙酸的添加量，其中氯乙酸的添加量為3g時，溶液的吸光度值達到最大(0.347±0.012)，當黑色素與氯乙酸質量比小于0.1時，溶液的吸光度值基本保持在0.347-0.359范圍內。可此可知1:10為氯乙酸與黑色素的最佳質量比。溶液于截留分子量為200Da的透析袋中，先用自來水透析3d、再用蒸餾水透析ld，進行濃縮冷凍干燥后，得到水溶性黑色素(CM-LIM)。對其進行復溶實驗，結果表明該羧甲基-黑色素(CM-LIM)復溶效果較好，在30°C條件下蒸餾水中的溶解度為 3.75g/100g。
[0017]三、水溶性粒毛盤菌黑色素(CM-UM)的結構驗證
[0018]分別取上述改性前的粒毛盤菌胞內黑色素、采用氯乙酸修飾改性制備的水溶性粒毛盤菌黑色素5mg，分別與400mg的KBr研磨后壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀(NexuS670)進行IR光譜分析，掃描范圍是4000-400(^'圖1為改性前的粒毛盤菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞內黑色素的紅外光譜圖；圖2為本發明的采用氯乙酸對粒毛盤菌(Lachnum)CCTCC No:M2011054胞內黑色素進行修飾改性后的水溶性黑色素羧甲基-黑色素(CM-UM)的紅外光譜圖。對比分析這兩個紅外光譜圖的結果表明，改性前后的粒毛盤菌CCTCC No:M209193胞內黑色素均具有真菌黑色素的特征吸收峰，在1370CHT1處具有黑色素與羧甲基基相連的亞甲基的特征吸收峰，在3280(^^240(3!^1處吸收峰明顯減弱，在1630CHT1處羧基吸收峰明顯增強，說明LIM分子中的活潑氫被羧甲基取代，分子中羧基濃度增加。該結果表明氯乙酸對粒毛盤菌胞內黑色素改性成功。
[0019]四、粒毛盤菌胞內黑色素及其水溶性粒毛盤菌黑色素(CM-LIM)的促排鉛作用藥理實驗:
[0020](I)粒毛盤菌胞內黑色素及其水溶性黑色素生理鹽水溶液的制備:將上述粒毛盤菌胞內黑色素及其通過采用氯乙酸對粒毛盤菌胞內黑色素進行修飾改性后的水溶性黑色素粉末，用質量百分濃度為0.9%的生理鹽水分別配制成50mg/mL和200mg/mL的水溶液，采取的給藥體積為0.2mL/只，I次/d，連續3周。
[0021 ] (2)動物:昆明小鼠60只，雄性，體重25 ± 2g，SPF級，隨機分為6組。
[0022](3)試劑盒:超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，為南京建成生物工程研究所生產的產品。
[0023](4)方法:昆明小鼠，稱重后隨機分為正常組、染鉛模型組、UM低劑量組(50mg.kg-1)、LIM 高劑量組(200mg.kg—1)、CM-LIM 低劑量組(50mg.kg’、CM-LIM 高劑量組(200mg.kg—1)，正常組每日飲用蒸餾水，其它各組均自由飲用含Pb2+濃度為400mg/L醋酸鉛[Pb(CH3COO)2.3H20]的蒸餾水溶液，各組均自由進食標準飼料。
[0024]對UM(低、高)劑量組在染鉛的組每日分別灌胃50mg/kg、200mg/kg劑量的UM，CM-UM(低、高)劑量組在染鉛的同時每日分別灌胃50mg/kg、200mg/kg劑量CM-UM ;各組小鼠每天定時灌胃，灌胃體積為0.2mL/只，I次/d，連續3周，灌胃期間，每日觀察小鼠的一般活動、皮毛、反應能力等情況，測定小鼠體重，每天仔細收集小鼠的糞便，分別凍存備用；于末次灌胃后禁食不禁水12h，稱體重后，摘眼球取血于經抗凝處理的離心管中備用；脫頸椎處死小鼠，取出小鼠肝臟、腎臟并仔細剝離小鼠的腦漿和股骨，凍存備用。
[0025](4)相關指標測定:
[0026]小鼠血清、腦、肝臟、腎臟、股骨、糞便中鉛含量的測定
[0027]小鼠血清、腦、肝臟、腎臟的SOD酶活力、GSH-PX酶活、MDA酶活的測定:小鼠眼球取血,5000r/min離心3min,取血清放于_20°C備用。臨用前恢復至室溫，按照試劑盒說明書步驟進行操作，測定SOD酶活力、GSH-PX酶活力、MDA酶活力。
[0028](5)藥理實驗結果:
[0029]表1給出了上述粒毛盤菌胞內黑色素及其水溶性黑色素對染鉛小鼠體重的影響。
[0030]表1粒毛盤菌胞內黑色素及其水溶性黑色素對染鉛小鼠攝食量、體重的影響
[0031]
【權利要求】
1.一種可作為制備促排鉛藥物用途的水溶性粒毛盤菌黑色素，其特征在于:是將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發酵后提取純化制備得到的胞內黑色素，再對其采用氯乙酸進行修飾改性后得到的水溶性粒毛盤菌黑色素；即，按:將300mg粒毛盤菌胞內黑色素溶于由5mL濃度為2.0moI/L的NaOH和12mL異丙醇的混合溶液，冰浴中攪拌3h，在攪拌狀態下再緩慢加入3g氯乙酸與由5mL濃度為2.0moI/L的NaOH和12mL異丙醇的混合液，室溫下反應3h，在60°C繼續加反應2h后，溶液冷卻至室溫，加入冰醋酸調節pH至中性，將該溶液于截留分子量為200Da的透析袋中先用自來水透析3d再用蒸餾水透析ld，收集、濃縮溶液，冷凍干燥后，所得到的水溶性粒毛盤菌黑色素。
2.權利要求1所述水溶性粒毛盤菌黑色素在制備促排鉛藥物中的用途。
3.如權利要求2所述水溶性粒毛盤菌黑色素在制備促排鉛藥物中的用途，特征在于:按藥劑學的常規制備方法將有效量的水溶性粒毛盤菌黑色素與藥用輔料混合加工制備成片劑或膠 囊。
【文檔編號】A61P39/02GK104069133SQ201410306301
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】葉明 , 李蘭, 宋升 , 琺娜 申請人:合肥工業大學