一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，與普通紫杉醇注射液和普通白蛋白結合型紫杉醇納米粒相比，可提高紫杉醇的腫瘤靶向性，增強藥效，降低毒副作用。本發明還提供了白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑的制備方法。
【專利說明】一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，具體涉及一種具有腫瘤靶向性且具有長循環效應的白蛋白 結合型紫杉醇納米粒凍干制劑。
【背景技術】
[0002] 紫杉醇是紅豆杉屬植物中提取的一種的具有抗腫瘤活性的次生代謝產物，為白 色、無味的結晶或粉末，難溶于水，易溶于丙酮、氯仿、乙醚等有機溶劑。紫杉醇是一個復 雜的二萜類化合物，具有含氧四環的紫杉烷環及酯側鏈，化學名為：5 β，20-環氧-1，2 α， 4, 7 β，1 β，13 α -六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 [ (2R， 3S)]-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯，分子式為C47H51N0 14，分子量：853.906。它于1963年 在美國癌癥研究所被發現，Monroe E.Wall和Mansukh C.Wani從太平洋紅豆杉（Taxus brevifolia)樹皮中分離到了這種物質，并命名為紫杉醇。紫杉醇抗腫瘤機制是促進微管聚 合和穩定已聚合微管，使快速分裂的的腫瘤細胞在有絲分裂階段被牢牢固定，微管不再分 開，可將細胞阻斷在G2與Μ期，使腫瘤細胞復制受阻而死亡。臨床研究表明紫杉醇主要適 用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也有一定療效。紫 杉醇是低毒、高效、廣譜的抗癌藥，是治療難治性卵巢癌最有效的藥物之一，在治療乳腺癌 疾病中占據重要地位，也是目前市場需求量最大和銷售額最大的抗癌藥物。
[0003] 目前臨床上最為常用的紫杉醇制劑是Bristol-Myers Squibb公司的紫杉醇注射 液Taxol?，采用聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇作為混合溶媒制成。處方中的聚氧乙烯蓖麻油 會引起體內組胺釋放，導致全身過敏性反應，發生率為39%，其中嚴重的過敏反應發生率為 2%。多數為I型變態反應，表現為支氣管痙攣性呼吸困難，蕁麻疹和低血壓。其他毒副作 用包括骨髓抑制作用、神經毒性、心血管毒性、胃腸道反應、肝臟毒性、脫發等。為避免過敏 反應，分別在給藥12小時前和6小時前服用地塞米松，在給藥前30?60分鐘注射苯海拉 明口服及西替利嗪，且注射時要緩慢滴注，滴注時間較長。其所帶來的毒副作用對患者的生 理和心理影響很大。
[0004] 注射用紫杉醇白蛋白納米混懸劑（Abraxane?，ABI-007)是近年來美國FDA批準的 一種新型抗腫瘤藥物，用于治療聯合化療失敗的轉移性乳腺癌或輔助化療后6個月內復發 的轉移性乳腺癌。ABI-007是一種通過人白蛋白穩定化的紫杉醇制劑。它能分散在生理鹽 水溶液中以很高的紫杉醇濃度直接注射，不含毒性乳化劑，安全性提高。用藥前不需預防過 敏反應的預處理治療，且能提高紫杉醇劑量，縮短滴注時間，在藥物有效率、降低毒副作用、 縮短給藥時間方面較紫杉醇注射劑有很大提高。
[0005] 絕大部分腫瘤內部血管生長迅速不規則，內部淋巴系統清除慢，存在腫瘤滲透增 強因子，使大分子和納米顆粒易滯留在腫瘤內部，稱為"增強滲透和滯留效應"（Enhanced Permeability and Retention, EPR)。納米給藥系統由于EPR效應可被動革巴向到腫瘤。
[0006] 納米給藥系統靜注后大部分被單核巨噬細胞系統（MPS)攝取，從而減少了在其他 組織和細胞的分布。如果想避開MPS的攝取，需要通過長循環手段對納米給藥系統進行改 進。
【發明內容】
[0007] 普通白蛋白結合型紫杉醇納米粒由于未經長循環修飾，被動靶向作用較差。本發 明提供了一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，保留ABI-007在制劑處方方面 的優點，并在此基礎上，在安全范圍內加入長循環材料，可進一步提1?紫杉醇制劑的腫瘤革巴 向性，降低毒副作用。
[0008] 本發明公開了一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑及其制備方法。
[0009] 白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑中紫杉醇的量和輔料的量沒有限制， 優選的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑含有〇. 1%?50%重量比的紫杉醇，其 余為輔料，并且輔料中白蛋白和長循環材料的比例為2 : 1?30 : 1重量比，優選的是輔 料中白蛋白和長循環材料的比例為5 : 1?20 : 1重量比。由紫杉醇、白蛋白、長循環材 料組成的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒組合物在各成分比例合適以及制備方法適當 的情況下，可不含其他輔料，得到的凍干制劑疏松，易被注射溶媒分散。但大部分情況下，白 蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑輔料中除白蛋白和長循環材料外，還含有基于改 善外觀形狀、穩定性、重分散性的其他輔料，選自穩定劑、抗氧化劑、凍干保護劑。
[0010] 白蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白，優選的是人血清白蛋白。
[0011] 長循環材料選自聚乙二醇脂肪醇醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇的磷脂衍生物、 聚乙二醇的膽固醇衍生物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物，具體選自二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇1500、膽固醇基琥珀酰聚乙二醇1500、泊羅沙姆188、聚山梨酯80、聚山梨酯 60、聚山梨酯20、聚乙二醇（24)月桂酸酯、聚乙二醇（40)月桂酸酯、聚乙二醇（40)硬脂酸 酯、聚氧乙烯（40)蓖麻油，優選自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1500、膽固醇基琥珀酰 聚乙二醇1500、泊羅沙姆188、聚山梨酯80。
[0012] 穩定劑主要是附著在白蛋白表面，防止白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒在制 備、放置、重分散時聚集，長循環材料可發揮穩定劑作用，另外，穩定劑還可以是磷脂。磷脂 有很多種。在本發明中，作為穩定劑的磷脂可選自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷 脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂、鞘磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、羥基卵磷脂、氫化磷 脂。
[0013] 抗氧化劑是防止白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒在制備、放置、重分散時其中 的成分發生氧化。如果嚴格控制處方組成、輔料規格、工藝條件，氧化也可以避免，但通常在 制劑中加入抗氧化劑防止氧化。抗氧化劑選自維生素 C、維生素 C衍生物、輔酶Q10、維生素 E、維生素 E衍生物、亞硫酸鹽類、乙二胺四乙酸及其衍生物、鹽酸半胱氨酸。
[0014] 凍干保護劑是在冷凍干燥過程中維持白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒的形態， 防止納米粒聚集，在重分散時，能迅速溶解并促進恢復白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒 水混懸液。凍干保護劑選自氨基酸、多糖和多元醇。氨基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨 酸。多糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖。多元醇選擇甘露醇、山梨醇、木糖醇。
[0015] 白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑的制備方法采用先制備成白蛋白結 合型紫杉醇長循環納米粒水性混懸液，然后經冷凍干燥得到粉末。白蛋白結合型紫杉醇長 循環納米粒凍干制劑的使用方法是將凍干制劑與注射用溶媒混合均勻，再進行注射。注射 溶媒選自注射用水、生理鹽水、葡萄糖溶液、磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液，優選的是注射用 水。
[0016] 白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒水性混懸液的制備方法沒有限制，只要獲得相 應的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒，并能滿足后面冷凍干燥制備得到狀態良好的凍干 制劑就可以，制備方法可選自聚合法、沉淀法、溶劑揮發法、鹽析法、高壓均質法、乳化法，優 選白沉淀法、高壓均質法，更優選的是高壓均質法。這些制備方法可以參考相關專業書籍和 文獻，由專業技術人員設計和操作完成。
[0017] 本發明中的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒，其粒徑為1?1000納米，優選的 是10?600納米，更優選的是90?200納米。
[0018] 白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑可用于治療非小細胞肺癌、胰腺癌、 乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤疾病。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑照片
[0020] 圖2.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒透射電鏡圖片
[0021] 圖3.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒粒徑測定圖
[0022] 圖4.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒Zeta電位圖
[0023] 圖5.白蛋白結合型紫杉醇納米粒的藥物組織分布
[0024] 圖6.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒的藥物組織分布
【具體實施方式】
[0025] 實施例1.空白白蛋白結合型長循環納米粒
[0026] 取300mg人血清白蛋白溶于30ml水中，再加入150mg泊洛沙姆188緩慢攪拌溶解， 加 lml氯仿振搖，靜置，分離氯仿，重復3次，使白蛋白水溶液被氯仿飽和；取氯仿0. 55ml和 無水乙醇0. 05ml混合，并逐滴滴入白蛋白水溶液中，用高速分散器攪拌，攪拌10秒后間隔 2秒，共2分鐘，形成初乳；移至高壓均質機中高壓乳勻，在3000psi下循環5次，得納米乳； 納米乳用旋轉蒸發儀在37°C以下揮發有機溶劑，得到的混懸液呈半透明狀，轉移至5ml西 林瓶中，lml/支，另加入lml20%的甘露醇，混勻，即為空白白蛋白結合型長循環納米粒。
[0027] 實施例2.白蛋白結合型紫杉醇納米粒
[0028] 取300mg人血清白蛋白溶于30ml水中，加 lml氯仿振搖，靜置，分離氯仿，重復3 次，使白蛋白水溶液被氯仿飽和；取氯仿〇. 55ml和無水乙醇0. 05ml混合，溶解50mg紫杉 醇，并逐滴滴入白蛋白水溶液中，用高速分散器攪拌，攪拌10秒后間隔2秒，共2分鐘，形成 初乳；移至高壓均質機中高壓乳勻，在3000psi下循環5次，得納米乳；納米乳用旋轉蒸發 儀在37°C以下揮發有機溶劑，得到的混懸液呈半透明狀，轉移至5ml西林瓶中，lml/支，另 加入lml20 %的甘露醇，混勻，即為白蛋白結合型紫杉醇納米粒。
[0029] 實施例3.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑
[0030] 取300mg人血清白蛋白溶于30ml水中，再加入150mg泊洛沙姆188緩慢攪拌溶解， 加 lml氯仿振搖，靜置，分離氯仿，重復3次，使白蛋白水溶液被氯仿飽和；取氯仿0. 55ml和 無水乙醇0. 05ml混合，溶解50mg紫杉醇，并逐滴滴入白蛋白水溶液中，用高速分散器攪拌， 攪拌10秒后間隔2秒，共2分鐘，形成初乳；移至高壓均質機中高壓乳勻，在3000psi下循 環5次，得納米乳；納米乳用旋轉蒸發儀在37°C以下揮發有機溶劑，得到的混懸液呈半透明 狀，轉移至5ml西林瓶中，lml/支，另加入lml20%的甘露醇，混勻，用冷凍干燥機中進行冷 凍干燥操作，得到疏松白色粉末，即為白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑。
[0031] 白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑的外觀為白色（圖1)。透射電鏡下觀 察白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒為均勻球形結構（圖2)，粒徑為104. 4nm(圖3)，Zeta 電位為-26. 7mV (圖4)。該凍干制劑每支加入2ml注射用水后振搖，能迅速分散成均勻的混 懸液。
[0032] 將泊洛沙姆188換成二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1500、膽固醇基琥珀酰聚 乙二醇1500、聚山梨酯80,其他操作一致，得到的納米粒測定其粒徑，均在150nm以下。
[0033] 實驗例1.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒的藥效學評價
[0034] 材料：（1)市售紫杉醇注射液；⑵按照實施例1制備的空白白蛋白結合型長循環 納米粒；（3)按照實施例2制備的白蛋白結合型紫杉醇納米粒；(4)按照實施例3制備白蛋 白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，每只經加入注射用水2ml后得到重分散的白蛋白 結合型紫杉醇長循環納米粒。
[0035] 動物：C57BL/6雌性小鼠50只，體重為22. 1±2. 1克，鼠齡50?60天。在SPF級 動物房適應性飼養7天，整個實驗過程中，各組鼠均同等自由飲水、攝食，飼養觀察室保持 20?24°C，相對濕度70 %?80 %。
[0036] 方法和結果：取生長良好對數生長期的Lewis肺癌細胞，用0. 25%胰蛋白酶消化 細胞使其成為單細胞，經磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，通過細胞記數法，用生理鹽水調整細胞 濃度為1X10 7個/ml，每只健康C57BL/6小鼠右后肢外側皮下接種0. lml。正常飼養8天 后動物接種腫瘤成功。每日測量瘤徑，選取腫瘤長徑為5. 5-6. 5_左右的荷瘤小鼠50只， 隨機分為5組。荷瘤小鼠身體不同部位剪毛給予標記，分別標記為：（1)模型組；(2)模型+ 紫杉醇注射液組；(3)模型+空白白蛋白結合型長循環納米粒組；(4)模型+白蛋白結合型 紫杉醇納米粒組；（5)模型+白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒組。
[0037] 每只模型動物尾靜脈注射藥物，給藥劑量為20mg/kg，1次/天，連續尾靜脈注射3 天。模型組尾靜脈注射生理鹽水。用藥結束后，于第14天處死各組動物。完整分離皮下腫 瘤組織，稱量腫瘤，進行統計學處理，計算各組瘤重抑瘤率。
[0038] 瘤重抑瘤率=(1-藥物組平均瘤重/對照組平均瘤重）X 100%
[0039] 表1.白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒對Lewis肺癌模型小鼠的抑瘤效果
[0040]
【權利要求】
1. 一種白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑。
2. 如權利要求1所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，含有0. 1 %? 50%重量比的紫杉醇，其余為輔料，并且輔料中白蛋白和長循環材料的比例為2 : 1? 30 : 1重量比。
3. 如權利要求2所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，其中輔料中除白 蛋白和長循環材料外，還含有其他輔料，選自穩定劑、抗氧化劑、凍干保護劑。
4. 如權利要求2所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，白蛋白選自人血 清白蛋白、牛血清白蛋白。
5. 如權利要求2所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，長循環材料選 自聚乙二醇脂肪醇醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚乙二醇的磷脂衍生物、聚乙二醇的膽固醇衍生 物、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。
6. 如權利要求3所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，穩定劑是磷脂， 并且選自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂、鞘 磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、羥基卵磷脂、氫化磷脂。
7. 如權利要求3所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，凍干保護劑選自 氨基酸、多糖和多元醇。
8. 如權利要求1所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，其制備方法采用 先制備成白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒水性混懸液，然后經冷凍干燥得到粉末。
9. 如權利要求8所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，其中白蛋白結合 型紫杉醇長循環納米粒水性混懸液的制備方法選自聚合法、沉淀法、溶劑揮發法、鹽析法、 高壓均質法、乳化法，優選自沉淀法、高壓均質法。
10. 如權利要求1所述的白蛋白結合型紫杉醇長循環納米粒凍干制劑，其粒徑為1? 1000納米。
【文檔編號】A61K9/19GK104208030SQ201410373920
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】金義光, 杜麗娜, 李淼, 馮雪, 金仁熙 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所