白蛋白結合多肽的制作方法
【專利說明】白蛋白結合多肽 發明領域
[0001] 本發明涉及結合白蛋白結合結構域ABD的多肽。該多肽具有多種工業和藥物應 用，例如在分離技術中用作親和配體或在分子診斷學中用作檢測劑。
[0002] 置量
[0003] 血清白蛋白是在哺乳動物血清中最豐富的蛋白（在人中35_50g/l， 即 0.53-0.75mM)，且例如在W091/01743、W001/45746 和Dennis等（JBiolChem 277:35035-43、2002)中已經描述了將肽或蛋白共價偶聯到將允許體內連接到血清白蛋 白的載體分子上的若干策略。W091/01743特別地（interalia)描述了源自鏈球菌蛋白 G(SpG)的白蛋白結合肽或蛋白用于增加其他蛋白的半衰期的用途。該觀念是將源自細菌的 白蛋白結合肽/蛋白融合到治療目的的肽/蛋白，所述治療目的的肽/蛋白已經顯示出具 有從血液中的快速消除。在體內，產生的融合蛋白與血清白蛋白結合，且受益于其更長半衰 期，這增加了融合的治療目的的肽/蛋白的凈半衰期。血清白蛋白的半衰期與動物的大小 直接成比例，其中例如人血清白蛋白（HSA)具有19天的半衰期且兔血清白蛋白具有約5天 的半衰期（McCurdy等，JLabClinMedl43:115,2004)。
[0004] 鏈球菌蛋白G(SpG)是存在于鏈球菌（str印tococci)某些菌株的表面上的雙功 能受體，并能夠結合IgG和血清白蛋白兩者（.Bj6rck.等，MolImmunol24:1113,1987)。 該結構為高度重復的，具有若干結構上和功能上不同的結構域（Guss等，EMB0J 5:1567, 1986)，更準確地說三個Ig結合結構域和三個血清白蛋白結合結構域（Olsson 等，EurJBiochem168:319,1987)。已經確定了SpG中的三個血清白蛋白結合結構域之 一的結構，顯示為三螺旋束折疊（Kraulis等，FEBSLett378:190, 1996,Johansson等，工 Biol.Chem. 277:8114-20, 2002)。46個氨基酸的基序被定義為ABD(白蛋白結合域，albumin bindingdomain)并且隨后還已被命名為G148-GA3(GA代表蛋白G相關的白蛋白結合 (proteinG-relatedalbuminbinding)且G148 來自其源自的鏈球菌菌株）。
[0005] 開發了具有極大改善對人血清白蛋白的親和性的GA3-G148的人工變體（Jonsson 等，ProtEngDesSel21:515-27,2008;W02009/016043)、以及具有減少的免疫刺激性質 的工程化高親和性變體（W02012/004384)。后者受在GA3-G148內實驗性地鑒定了數個T細 胞和B細胞表位的事實的啟發（Goetsch等，ClinDiagnLabImmunol10:125-32, 2003), 使得此結構域本身較不適合用在用于人類施用的藥物組合物中。遍及當前文本中，例如在 W02009/016043和W02012/004384中展示的GA3-G148及其各種工程化衍生物共同地被稱為 "ABD"。因此，在本公開內容中"ABD"表示此類白蛋白結合多肽，而不是具有特定氨基酸序 列的特定多肽。
[0006] 隨著將白蛋白結合結構域摻入治療或診斷組合物中興趣的增加，帶來了對用于分 離共價連接到ABD的分子的廉價和高效純化策略的增長的需求，所述共價連接到ABD的分 子例如通過在原核或真核系統中重組表達或通過直接化學共軛連接到ABD來產生。用于純 化重組表達蛋白的一般策略將包括通常使用的親和標簽諸如聚組氨酸標簽、幾丁質結合蛋 白（CBP)、麥芽糖結合蛋白（MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST)標簽或FLAG標簽，并使用了 特別為每種標簽開發的商業樹脂進行經典親和分離。然而，對于某些應用，且特別是對于將 作為治療劑使用的分子，終產物必須為均質的。由于需要例如通過酶促或化學裂解去除標 簽，必須確保完全裂解以獲得均質產物，或當去除未完全裂解的產物時遭受收率的損失。此 類問題兩者造成增加產物的生產成本。因此，更具啟發性的策略將是利用ABD基序本身作 為純化標簽。此策略的一個實例為將重組白蛋白偶聯到固體支持物（參見例如，Jonsson 等，ProtEngDesSel21:515-27,2008;Andersen等，JBiolChem286:5234-41,2011)。 從粗溶質中，包含ABD標簽的化合物被白蛋白捕獲，去除非特異性吸附的污染物且隨后通 過干擾與白蛋白特異性但可逆的相互作用回收加ABD-標簽的化合物。然而，白蛋白是對不 同蛋白、脂肪酸、固醇類、離子等具有若干相互位點的大天然載體分子，且因此特異性和非 特異性組分兩者的背景結合可污染回收的樣品。盡管事實上已經開發了重組人白蛋白，將 其包括作為治療產品的大規模生產中的親和配體還是昂貴的，特別是因為其與用于就地清 洗（cleaninginplace)的標準程序不相容，對于白蛋白偶聯基質的重復使用將不得不應 用用于就地清洗的標準程序。此外，可需要更苛刻的洗脫條件以回收包含對白蛋白具有異 常高親和性的ABD變體的分子。此類條件還可對于加ABD-標簽的分子是不利的。
[0007] 由于蛋白A對IgG的Fc部分的天然親和性，長期以來已經使用來自金黃色葡萄球 菌（Staphylococcusaureus)的蛋白A作為單克隆抗體和Fc融合蛋白的工業生產中的親和 配體。因而，蛋白A以其整體，以及其單獨的Fc結合結構域，已作為具有改善性質的工程化 親和配體的合理設計的起點。對于介紹，參見由NordK和同事在ProtEng(Nord等，Prot Eng8:601-608;1995)和在NatBiotech(Nord等，NatBiotech15:772-777 ;1997)中的文 早。
[0008] 本公開內容的一個目的在于提供新的ABD結合劑。此外，本公開內容的一個目的 在于提供用于在生物技術例如在蛋白純化和分離應用中使用的新ABD結合劑。
[0009] 發明描沐
[0010] 這些目標和從本公開內容對技術人員明顯的其他目標可通過一種或更多種以下 公開的多個發明方面來實現。
[0011] 因此，在第一方面，本公開內容提供ABD結合多肽，包含ABD結合基序BM，該基序由 選自以下的氨基酸序列組成：
[0012] i)EX2X3X4AX6X7EIX10XnLPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
[0013] 其中，彼此獨立地，
[0014] X2選自F、I和L;
[0015] X3選自H、K、N、Q、R、S、T*V;
[0016] 父4選自八、0、卩、6、11、1、1(、1、]\1、隊〇、1?、5、1\￥、1和￥;
[0017] X6選自F、I、L和Y;
[0018] 父7選自八、11、1、1(、1、隊〇、1?、5、1'和￥;
[0019] X1(l選自G、H、K、N、Q、R和S;
[0020] 父11選自六、0、卩、6、1、1(、1、隊〇、1?、5、1\￥和￥;
[0021] X16選自N和T;
[0022] X17選自F、H、L、S和T;
[0023] X18選自D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T和V;
[0024] X2Q選自H、K和R;
[0025] X21選自I、L和V;
[0026] X25選自F、I、L、V和Y;
[0027] X26選自K和S;
[0028] X28選自 D 和E;
[0029] 和
[0030] ii)與在i)中定義的序列具有至少89%同一性的氨基酸序列。
[0031] 與以上定義一類序列相關的ABD結合多肽是基于親本支架的許多隨機多肽變體 的統計學分析，所述多肽變體在若干不同選擇實驗中通過其與ABD的相互作用來選擇。鑒 定的ABD結合基序，或"BM"相應于親本支架的靶結合區域，所述區域構成在三螺旋束蛋白 結構域內的2個a螺旋。在親本支架中，兩個BM螺旋的變化的氨基酸殘基組成用于與抗 體的恒定Fc部分的相互作用的結合表面。在本發明中，結合表面殘基的隨機變化和變體的 后續選擇已經用與ABD相互作用的容量替換Fc相互作用容量。
[0032] 本文公開的ABD結合多肽表現一系列特性，例如當偶聯到固體支持物時，使得其 適于作為用于純化包含ABD的分子的親和配體。例如，與使用人白蛋白作為親和配體相比 較，公開的ABD結合多肽顯示以下優勢：
[0033] ?每毫升配體偶聯基質的更高純化能力。
[0034] ?與用于就地清洗的重復程序的相容性，例如使用0. 5M氫氧化鈉，其使得ABD結合 多肽在大規模生產治療產品中有用。
[0035] ?實現更溫和洗脫條件，例如在更高pH下的洗脫，其使得純化更寬范圍的包含ABD 的不同分子成為可能。
[0036] 在純化包含ABD的靶蛋白的上下文中，本公開內容的ABD結合多肽可在一個或更 多個不同純化階段中有用。因此，可在第一捕獲步驟中、在任意中間純化步驟或在最終精制 步驟中的一個或者更多個中使用所述ABD結合多肽而沒有限制。
[0037] 技術人員將理解，使用包含根據本公開內容的ABD結合多肽的樹脂可實現靶蛋白 的成功純化，而無論ABD基序在靶蛋白中所處的位置。因此，可將ABD部分放置在靶蛋白的 N端或C端。可選地，靶蛋白可以為包含在其兩側側面為其他蛋白部分的ABD部分的融合蛋 白。
[0038] 在本公開內容的上下文中，"ABD"是指來自鏈球菌蛋白G的三螺旋白蛋白結合結 構域及其衍生物。特別地，"ABD"可以指GA3-G148 (上述Johansson等，特此通過引用并入） 或對白蛋白具有增強親和性的GA3-G148的變體（W02009/016043,特此通過引用并入）以及 具有減少的免疫刺激性質的高親和性變體（W02012/004384)。換句話說，在本公開內容中， "ABD"表示在參考文獻中所述的此類白蛋白結合多肽，而不是具有特定氨基酸序列的特定 多肽。
[0039] 如技術人員將認識到的，任何多肽的功能諸如本公開內容的多肽的ABD結合容量 取決于多肽的三級結構。因此，對多肽中的氨基酸序列做出較小改變而不影響其功能是可 能的。因此，本發明涵蓋包含BM的修飾變體的多肽，所述BM的修飾變體使得產生的序列與 通過i)定義的序列至少89%相同。在本發明的一個實施方案中，所述BM的修飾變體使得 其與通過i)定義的序列至少93%相同。在又另一個實施方案中，所述BM變體與通過i)定 義的序列至少96%相同。
[0040] 在一些實施方案中，此類變化可在如本文公開的ABD結合多肽的序列的所有位置 中做出。在其他實施方案中，此類變化可僅在非可變位置中做出，所述非可變位置還被表示 為支架氨基酸殘基。在此類情況下，不允許在可變位置，即在序列i)中用"X"表示的位置 中的改變。例如，屬于氨基酸殘基的某些功能分組（例如，疏水、親水、極性等）的一個氨基 酸殘基，可被來自相同功能組的另一個氨基酸殘基交換是可能的。
[0041] 如遍及使用的術語"同一性％ "可如下計算。使用CLUSTALW算法（Thompson 等，NucleicAcidsResearch, 22:4673-4680 (1994))將查詢序列與靶序列進行比對。在與 比對序列的最短序列相應的窗口上進行比較。在一些情況下，比對序列的最短序列可以是 靶序列。在其他情況下，查詢序列可構成比對序列的最短序列。比較了每個位置上的氨基 酸殘基，且將在查詢序列中具有靶序列中的相同對應的位置的百分比報告為同一性％。
[0042] 在一個實施方案中，在序列i)中X2選自F和L。
[0043] 在一個實施方案中，在序列i)中&為F。
[0044] 在一個實施方案中，在序列i)中&為L。
[0045] 在一個實施方案中，在序列i)中X3選自H、K、R、T和V。
[0046] 在一個實施方案中，在序列i)中X3選自H、K、R和V。
[0047] 在一個實施方案中，在序列i)中X3選自H、K和V。
[0048] 在一個實施方案中，在序列i)中X3選自K和R。
[0049] 在一個實施方案中，在序列i)中&為K。
[0050] 在一個實施方案中，在序列i)中&為R。
[0051] 在一個實施方案中，在序列i)中X3sv。
[0052] 在一個實施方案中，在序列i)中X4選自A、H、I、L、N、V*W。
[0053] 在一個實施方案中，在序列i)中X4選自H、L、N和V。
[0054] 在一個實施方案中，在序列i)中\為V。
[0055] 在一個實施方案中，在序列i)中乂4為N。
[0056] 在一個實施方案中，在序列i)中\為H。
[0057] 在一個實施方案中，在序列i)中乂4為L。
[0058] 在一個實施方案中，在序列i)中X4選自A、L、N、V和W。
[0059] 在一個實施方案中，在序列i)中X4選自A、N、V和W。
[0060] 在一個實施方案中，在序列i)中X4選自A、N和W。
[0061] 在一個實施方案中，在序列i)中X6選自F和L。
[0062] 在一個實施方案中，在序列i)中X6為F。