表皮生長因子受體阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種表皮生長因子受體阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用，所述表皮生長因子受體阻斷劑為吉非替尼或厄洛替尼；本發明所述吉非替尼/殼聚糖微球分散良好、表面光滑，具有緩釋藥物的性能，具有小鼠關節腔生物相容性，有效緩解小鼠骨性關節炎，促進小鼠骨性關節炎膝關節膠原Ⅱ的表達和抑制MMP-13的表達；此外，吉非替尼是一種臨床用藥，被廣泛的用于非小細胞肺癌的治療并取得了很好的臨床療效，減少了藥物研發所需要的昂貴的經濟代價和漫長的研發周期；緩釋給藥的給藥途徑，可以在提高局部藥物濃度的同時減少全身用藥產生相應的副作用，具有臨床應用前景。
【專利說明】表皮生長因子受體阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的 應用 (一）
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種表皮生長因子受體阻斷劑的應用，特別涉及表皮生長因子受體阻 斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用。 (二）
【背景技術】
[0002] 骨性關節炎（osteoarthritis, 0A)是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為 特征的慢性關節病。本病在中年以后多發。國內的初步調查顯示，骨性關節炎的總患病率 約為15%，40歲人群的患病率為10% -17%，60歲以上則達50%。而在75歲以上人群中， 80%患有骨性關節炎。該病的最終致殘率為53%。臨床上以關節腫痛、骨質增生及活動受 限最為常見。骨性關節炎的發病無地域及種族差異。年齡、肥胖、炎癥、創傷及遺傳因素可 能與本病的發生有關。
[0003] 根據美國膝關節骨關節炎治療指南，目前可以用于骨性關節炎的藥物有皮質類固 醇激素，對乙酰氨基酚和環氧化物酶-2抑劑。這些藥物都是針對骨性關節炎的癥狀進行 治療。究其原因在于我們對于骨性關節炎的病理生理認識不足，隨著近年來分子生物學和 轉化醫學的發展，對骨性關節炎的發病發病機制有了深入的認識，尤其是參與骨性關節炎 主要信號通路的阻斷劑。TGF-0，PI3K-mT0R，Wnt和炎癥因子等相關信號通路的阻斷劑廣 泛用于骨性關節炎的治療，但僅僅限于基礎實驗階段，離最終的臨床應用比較遠，即使最終 可以用于臨床，也需要付出巨大的經濟代價，而且這些信號通路對骨性關節炎的調節都是 單向的，即主要是阻斷破壞軟骨的因素。近年來，發現表皮生長因子受體（EGFR，Epid ermal Growth Factor Receptor)信號通路參與了軟骨發育和骨性關節炎的發生，該受體在動物 和人的0A樣本中表達升高；同時EGFR受體的配體TGF-a抑制膠原II的合成和增加MMP-13 的分泌。因此，可以認為激活狀態的受體參在0A的發生發展中起重要作用。而阻斷該受體 既可以保護現存軟骨又可以促進其進行自我修復。
[0004] 吉非替尼在非小細胞肺癌中可以有效阻斷EGFR受體從而提高癌癥病人的存活 率，由于該藥物是化療藥物，其是否可以用于骨軟骨相關疾病的治療成為關注的焦點。基礎 研究表明，給予SD大鼠灌胃7天可以使生長板軟骨的厚度增加一倍；吉非替尼的類似物厄 洛替尼可以有效阻斷類風濕性關節的滑膜炎癥；吉非替尼參與軟骨下骨的骨重建，上述研 究表明吉非替尼可以用于骨軟骨相關疾病的治療。吉非替尼全身用藥會產生相應的副作 用，因此改善其用藥途徑和方式，不僅可以減少副作用的發生，而且可以提高療效。殼聚糖 是甲殼素的脫乙酰基產物，它能被人體吸收利用與人體組織器官及細胞有良好的生物相容 性，無毒，具有生物降解性，降解過程中產生的殼寡糖在體內不積累，幾乎無免疫原性，因此 在生物醫藥方面應用廣泛是良好的藥物緩釋材料。由于殼聚糖緩釋微球的各種優點，制備 吉非替尼/殼聚糖緩釋微球可以有效用于骨性關節炎的治療。 (三）
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種表皮生長因子受體阻斷劑的新應用，即表皮生長因子受體 阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用。本發明以EGFR的酪氨酸激酶抑制劑吉非替 尼為例，提供吉非替尼/殼聚糖微球的制備方法，并明確了吉非替尼/殼聚糖微球在小鼠骨 性關節炎中的作用。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種表皮生長因子受體阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用， 所述表皮生長因子受體阻斷劑為吉非替尼或厄洛替尼。
[0008] 進一步，所述表皮生長因子受體阻斷劑以表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球 的形式應用。
[0009] 進一步，所述表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球按如下方法制備：（1)殼聚 糖溶液：用冰乙酸水溶液溶解殼聚糖，配制成殼聚糖溶液；(2)乳化體系：向殼聚糖溶液中 加入表皮生長因子受體阻斷劑，混合均勻，在40°C恒溫水浴、800-1000r/min條件下攪拌乳 化，形成乳化體系；所述殼聚糖溶液的用量以殼聚糖質量計，所述殼聚糖與表皮生長因子受 體阻斷劑質量比為1〇〇: 1-800:1(優選400:1) ; (3)微球：向乳化體系中加入戊二醛，保持 40°C，攪拌交聯，反應結束后，靜置30min，待完全分層后除去上層液，下層顆粒分別用石油 醚和異丙醇洗滌，然后冷凍干燥，即得表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球。
[0010] 進一步，所述冰乙酸水溶液的體積濃度為2%。
[0011] 進一步，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質量濃度為〇. 〇1-〇. lg/ml (優選0. 02g/ml)。
[0012] 進一步，所述冷凍干燥是在-109 °C下凍干。
[0013] 進一步，所述戊二醛的體積加入量以步驟（2)殼聚糖溶液中殼聚糖的質量計為 2. 0_15ml/g (優選 12. 5ml/g)。
[0014] 此外，本發明還提供一種表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球，所述表皮生 長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球按如下方法制備：（1)殼聚糖溶液：用體積濃度為2%的 冰乙酸水溶液溶解殼聚糖，配制成0. 01-0. lg/ml的殼聚糖溶液（優選0. 02g/ml) ; (2) 乳化體系：向殼聚糖溶液中加入表皮生長因子受體阻斷劑，混合均勻，在40°C恒溫水浴、 800-1000r/min條件下攪拌乳化，形成乳化體系；所述殼聚糖溶液的用量以殼聚糖質量計， 所述殼聚糖與表皮生長因子受體阻斷劑質量比為100:1-800:1(優選400:1);所述表皮 生長因子受體阻斷劑為吉非替尼或厄洛替尼；（3)微球：向乳化體系中加入戊二醛，保持 40°C，攪拌交聯，反應結束后，靜置30min，待完全分層后除去上層液，下層顆粒分別用石油 醚和異丙醇洗滌，然后冷凍干燥，即得表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球；所述戊二醛 的體積加入量以步驟（2)殼聚糖溶液中殼聚糖的質量計為2. 0-15ml/g(優選12. 5ml/g)。 [0015] 本發明所述表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球質量用量為 0? 88-7. 04X lO^ng/Kg體重（優選3. 52X lO^ng/Kg)，即表皮生長因子受體阻斷劑質量用量 為 2. 2-17. 6 X 10_4mg/Kg 體重（優選 8. 8 X 10_4mg/Kg)。
[0016] 本發明所述表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球（優選吉非替尼/殼聚糖微 球）以小鼠膝關節前交叉韌帶切除所致骨性關節炎模型驗證其對骨性關節炎的干預作用。
[0017] 本發明所述吉非替尼化學名稱為：N-(3-氯-4-氟苯基）-7_甲氧基-6-(3-嗎啉 丙氧基）喹唑啉-4-胺，分子式為：C 22H24C1FN403,分子量為：446. 90。
[0018] 本發明所述厄洛替尼化學名稱：N-(3-乙炔苯基）-6,7_雙（2-甲氧乙氧基）-4_喹 啉胺鹽酸鹽，分子式：C22H23N30 4 ? HC1，分子量：429. 90。
[0019] 目前，針對骨性關節炎治療的臨床藥物大多集中在改善患者的癥狀，而對骨性關 節炎具有干預作用的臨床前藥物主要是抑制其炎癥過程或者是抑制破壞性酶的分泌。隨著 基礎研究者在骨性關節炎機制研究中形成共識，骨性關節炎的發病過程中涉及細胞外基質 合成抑制和降解酶的異常高表達，本發明從吉非替尼、厄洛替尼對骨性關節炎形成過程中 膠原II的合成和MMP-13的分泌入手，首先建立小鼠膝關節前交叉韌帶切除骨性關節炎模 型，通過對關節腔注射吉非替尼/殼聚糖微球后小鼠膝關節病理組織學觀察并進行相應的 組織學評分，觀察小鼠軟骨組織的破壞程度，以及膠原II和MMP-13的表達情況，并通過空 白組，模型組和吉非替尼/殼聚糖微球用藥組的比較，來研究吉非替尼/殼聚糖微球關節腔 注射對小鼠骨性關節炎的防治作用，探討吉非替尼對骨性關節炎轉歸機制的影響，表明吉 非替尼可通過促進膠原II的合成和抑制MMP-13的分泌來抑制骨性關節炎的病理過程，從 而為該藥物的進一步臨床應用提供實驗依據。
[0020] 國內外運用殼聚糖作為緩釋載體已取得具有應用價值的結果，主要表現為殼聚糖 微球具有良好的生物相容性和良好的緩釋效應從而明顯減少藥物的用量和提高了治療效 果。殼聚糖微球為本發明實驗研究提供了必要的條件。
[0021] C57BL/6J小鼠24只抽取18只切除小鼠膝關節的前交叉韌帶進行骨性關節炎造 模，造模后分為骨性關節炎組，殼聚糖微球組，吉非替尼/殼聚糖微球組，剩余小鼠為假手 術組。骨性關節炎組6只左右腿造模后不做任何處理，殼聚糖微球組6只左右腿造模1周 后開始關節腔注射不含藥物的殼聚糖微球，每3天一次，吉非替尼/殼聚糖微球組6只左右 腿造模1周后開始關節腔注射吉非替尼/殼聚糖微球，每3天一次，實驗8周后處死所有小 鼠，觀察各組小鼠膝關節病理組織學改變并進行相應的組織學評分。結果表明：吉非替尼 /殼聚糖微球分散良好、表面光滑，具有緩釋藥物的性能，具有小鼠關節腔生物相容性，有效 緩解小鼠骨性關節炎，促進小鼠骨性關節炎膝關節膠原II的表達和抑制MMP-13的表達。
[0022] 本發明有益效果主要體現在：本發明所述表皮生長因子阻斷劑/殼聚糖微球分散 良好、表面光滑，具有緩釋藥物的性能，具有小鼠關節腔生物相容性，有效緩解小鼠骨性關 節炎，促進小鼠骨性關節炎膝關節膠原II的表達和抑制MMP-13的表達；此外，吉非替尼、厄 洛替尼是一種臨床用藥，被廣泛的用于非小細胞肺癌的治療并取得了很好的臨床療效，減 少了藥物研發所需要的昂貴的經濟代價和漫長的研發周期；緩釋給藥的給藥途徑，可以在 提高局部藥物濃度的同時減少全身用藥產生相應的副作用，具有臨床應用前景。 (四）【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為殼聚糖微球掃描電鏡表征圖。
[0024] 圖2為吉非替尼/殼聚糖微球掃描電鏡表征圖。
[0025] 圖3為吉非替尼/殼聚糖微球體外緩釋曲線圖。
[0026] 圖4為厄洛替尼/殼聚糖微球掃描電鏡表征圖。
[0027] 圖5為厄洛替尼/殼聚糖微球體外緩釋曲線圖。
[0028] 圖6為關節腔滑膜組織的HE染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組，C為殼聚 糖緩釋微球組，D為吉非替尼/殼聚糖微球組。
[0029] 圖7為假手術組，骨性關節炎組，殼聚糖緩釋微球組和吉非替尼/殼聚糖微球體組 關節腔滑膜組織的炎癥評分。
[0030] 圖8為軟骨組織切片p-EGFR免疫組化染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組， C為殼聚糖緩釋微球組，D為吉非替尼/殼聚糖微球組。
[0031] 圖9為軟骨組織切片的番紅-阿辛藍染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組，C 為殼聚糖緩釋微球組，D為吉非替尼/殼聚糖微球中劑量組，E為吉非替尼/殼聚糖微球低 劑量組，F為吉非替尼/殼聚糖微球高劑量組。
[0032] 圖10為假手術組，骨性關節炎組，殼聚糖微球組和吉非替尼/殼聚糖微球組軟 骨組織的國際骨關節炎研究學會（Osteoarthritis Research Society International， OARSI)評分。
[0033] 圖11為軟骨組織切片膠原II免疫組化染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組， C為殼聚糖緩釋微球組，D為吉非替尼/殼聚糖微球組。
[0034] 圖12為軟骨組織切片MMP-13免疫組化染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組， C為殼聚糖緩釋微球組，D為吉非替尼/殼聚糖微球組。
[0035] 圖13為細胞的膠原II表達情況。
[0036] 圖14為細胞的MMP-13表達情況。 (五）【具體實施方式】
[0037] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0038] 本發明實施例所用實驗材料：
[0039] 實驗動物：雌性4周齡C57BL/6J小鼠24只SPF級浙江大學動物實驗中心提供。
[0040] 實驗藥品：
[0041] 吉非替尼（易瑞沙，Iressa):英國阿斯利康制藥有限公司批號：J20070047
[0042] 殼聚糖：上海伯奧生物科技有限公司批號：050106
[0043] 主要試劑：
[0044]
【權利要求】
1. 一種表皮生長因子受體阻斷劑在制備治療骨性關節炎藥物中的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述表皮生長因子受體阻斷劑為吉非替尼或 厄洛替尼。
3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于所述表皮生長因子受體阻斷劑以表皮生長因 子受體阻斷劑/殼聚糖微球的形式應用。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微 球按如下方法制備：（1)殼聚糖溶液：用冰乙酸水溶液溶解殼聚糖，配制成殼聚糖溶液；（2) 乳化體系：向殼聚糖溶液中加入表皮生長因子受體阻斷劑，混合均勻，在40°C恒溫水浴、 800-1000r/min條件下攪拌乳化，形成乳化體系；所述殼聚糖溶液的用量以殼聚糖質量計， 所述殼聚糖與表皮生長因子受體阻斷劑質量比為100:1-800:1 ;(3)微球：向乳化體系中加 入戊二醛，保持40°C，攪拌交聯，反應結束后，靜置30min，待完全分層后除去上層液，下層 顆粒分別用石油醚和異丙醇洗滌，然后冷凍干燥，即得表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖 微球。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述冰乙酸水溶液的體積濃度為2%。
6. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述殼聚糖溶液中殼聚糖的質量濃度為 0· 01-0. lg/ml。
7. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述冷凍干燥是在-109°C下凍干。
8. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述戊二醛的體積加入量以步驟（2)殼聚糖 溶液中殼聚糖的質量計為2. 0-15ml/g。
9. 一種表皮生長因子受體阻斷劑/殼聚糖微球，其特征在于所述表皮生長因子受體阻 斷劑/殼聚糖微球按如下方法制備：（1)殼聚糖溶液：用體積濃度為2%的冰乙酸水溶液溶 解殼聚糖，配制成〇. 01-0. lg/ml的殼聚糖溶液；（2)乳化體系：向殼聚糖溶液中加入表皮生 長因子受體阻斷劑，混合均勻，在40°C恒溫水浴、800-1000r/min條件下攪拌乳化，形成乳 化體系；所述殼聚糖溶液的用量以殼聚糖質量計，所述殼聚糖與表皮生長因子受體阻斷劑 質量比為100:1-800:1 ;所述表皮生長因子受體阻斷劑為吉非替尼或厄洛替尼；（3)微球： 向乳化體系中加入戊二醛，保持40°C，攪拌交聯，反應結束后，靜置30min，待完全分層后除 去上層液，下層顆粒分別用石油醚和異丙醇洗滌，然后冷凍干燥，即得表皮生長因子受體阻 斷劑/殼聚糖微球；所述戊二醛的體積加入量以步驟（2)殼聚糖溶液中殼聚糖的質量計為
2.〇-15ml/g〇
【文檔編號】A61K31/517GK104257659SQ201410414758
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月21日 優先權日:2014年8月21日
【發明者】歐陽宏偉, 吳巖, 熊思, 王俊娟, 鄒曉輝 申請人:浙江大學