桔梗皂苷d在制備抑制血管生成藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及桔梗皂苷D的一種新用途，即，在制備抑制血管生成藥物中的應用。本發明的優點在于：首次發現桔梗皂苷D具有抗血管生成活性，可作為血管生成抑制劑使用，能夠作為血管生成抑制劑應用于血管生成藥物的制備以治療腫瘤、關節炎、銀屑病、眼科疾病、動脈粥樣硬化等新生血管依賴性和新生血管相關性疾病。
【專利說明】桔梗皂苷D在制備抑制血管生成藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，具體地說，是桔梗皂苷D在制備抑制血管生成藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]血管生成是一個涉及多種細胞的多種分子的復雜生理過程，包括內皮細胞分泌蛋白酶降解基底膜、內皮細胞的增殖和遷移、新生毛細血管官腔結構的形成，募集周細胞以穩定新形成的毛細血管網、通過原始血管的重塑和擴展形成成熟的血管網。
[0003]抑制血管生成分子和促進血管生成分子間的動態平衡被認為是調控血管生成的“開關”。正常生理狀況下，抑制血管生成分子和抗血管生成分子之間處于相對平衡狀態，血管生成機制處于“關閉”狀態；而當二者的平衡狀態被破壞時，血管生成機制呈現“開啟”狀態，從而在疾病的發生和發展過程中扮演重要的角色。值得注意的是血管生成在胚胎發育、生殖、創傷修復以及女性的生理周期等機體正常生理過程中發揮著重要作用。但在一些疾病過程中，例如各種原因引起的腫瘤、眼部新血管形成、關節炎、皮膚疾患、動脈粥樣硬化等疾病的發生與發展，都與病理性的血管生成有重大關系。
[0004]惡性腫瘤是當今世界嚴重威脅人類健康的重大疾病，腫瘤血管為腫瘤的生長提供必須的營養成分并幫助排出代謝廢物，腫瘤血管形成與腫瘤生長、復發、轉移的密切關系被認為是上世紀腫瘤學理論的重大突破之一，而腫瘤抗血管生成治療被認為是治療惡性腫瘤具有重大醫學價值的策略之一。
[0005]桔梗阜苷D (Platycodin D)是一種植物阜苷衍生物,來自于桔梗(platycodongrandiflorum)的干燥根。其分子式為C57H92O28，分子量為1224.38。對桔梗皂苷D藥理學活性的研究表明:桔梗皂苷D具有抗炎，止疼，治療呼吸系統癥狀的作用。該化合物還被證明具有抗腫瘤作用，能誘導人肺癌細胞A549，人胃癌細胞AGS，人乳腺癌細胞MCF-7以及人肝癌細胞H印G2凋亡，抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231和4T1以及人肝癌細胞HepG2遷徙等藥理學活性。但目前尚未有桔梗皂苷D抑制新生血管形成并作為血管形成抑制劑使用的報道。
[0006]中國專利文獻CN100577180C公開了一種藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用。該發明提供了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應用，特別是在制備抑制腫瘤、關節炎、視網膜病、血管瘤、銀屑病等疾病的病變組織血管生成的藥物中的應用。中國專利文獻CN1511531A公開了高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿在抑制血管生成中的應用。該發明公開了高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿在抑制血管生成中的新用途，研究表明，高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿具有抑制血管生成的作用，同時具有特異性、劑量小、療效高、副作用小和不易產生耐藥性等優點。中國專利文獻CN101342214A公開了一種木香總內酯藥物組合物及其制備方法。該發明提供了一種木香總內酯藥物組合物及其制備方法，還提供了一種木香總內酯藥物組合物在制備治療或預防胃運動障礙的藥物中的應用。中國專利文獻CN101073590A公開了一種從中藥木香中提取得到的總內酯提取物及其制備方法，還提供了一種該提取物用于制備藥物或功能性食品的應用。CN102058579A公開了去氫木香內酯在制備抑制血管生成藥物中的應用。該發明公開了去氫木香內酯在抑制血管生成中的新用途。
[0007]但是，關于桔梗皂苷D在制備抑制血管生成藥物中的應用目前還未見報道。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供桔梗皂苷D —種新用途。
[0009]為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:桔梗皂苷D在制備抑制血管生成藥物中的應用。
[0010]所述的血管生成為腫瘤血管新生，所述的腫瘤為實體腫瘤，所述的實體腫瘤為原發性或繼發性實體腫瘤。
[0011]所述的腫瘤血管新生為腫瘤病變組織的血管新生或腫瘤導致的血管新生。
[0012]所述的腫瘤血管新生為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌癥的血管新生。
[0013]所述的血管生成為銀屑病病變組織血管新生、Paget’s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、關節炎病變組織的血管新生、動脈粥樣硬化病變處的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病為原發性或繼發性新生血管性眼病。
[0014]桔梗皂苷D作為單一成分或與其他藥學上可接受的成分構成組合物制備抑制血管生成的藥物中的應用，所述的其他藥學上可接受的成分是與桔梗皂苷D沒有拮抗作用的藥物，或藥學上允許的一種或多種輔料。
[0015]所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、微囊制劑、注射劑、栓劑、噴霧劑或軟膏劑。
[0016]所述的藥物的給藥方式為注射、口服、吸入式噴霧或透皮給藥。
[0017]本發明優點在于:
本發明提供了桔梗皂苷D的一種新用途。首次發現桔梗皂苷D抗血管生成作用，首次發現桔梗皂苷D可有效抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和小管形成，首次發現桔梗皂苷D在雞胚絨毛尿囊膜試驗中可劑量依賴性抑制血管生成，首次發現桔梗皂苷D可通過抗血管生成作用抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤的生長，并首次發現桔梗皂苷D可特異性阻斷血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)介導的信號通路發揮其抗血管生成作用，以上發現說明桔梗皂苷D具有抗血管生成活性，可作為血管生成抑制劑使用，能夠作為血管生成抑制劑應用于血管生成藥物的制備以治療腫瘤、關節炎、銀屑病、眼科疾病、動脈粥樣硬化等新生血管依賴性和新生血管相關性疾病。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]附圖1A是桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人結直腸腺癌細胞(HCT-15)的增殖的照片，
附圖1B是桔梗皂苷D抑制HUVEC劃痕遷移的照片，
附圖1C是桔梗皂苷D抑制HUVEC細胞水平運動能力的照片，
附圖1D是桔梗皂苷D抑制HUVEC Transwell小室垂直遷移的照片，
附圖1E是桔梗皂苷D抑制HUVEC小管生成的照片。
[0019]附圖2是桔梗皂苷D抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗的照片。
[0020]附圖3A，3B是桔梗皂苷D抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤生長的照片和結果， 附圖3C是桔梗皂苷D抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤重量的照片，
附圖3D是桔梗皂苷D給藥后增加腫瘤組織壞死面積的圖片，
附圖3E是桔梗皂苷D給藥后顯著減少腫瘤組織內微血管密度的照片。
[0021]附圖4A、4B是桔梗皂苷D可特異性阻斷血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)介導的信號通路發揮其抗血管生成作用。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0023]實施例1A桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖實驗
采用CCK-8法檢測HUVEC的增殖。CCK-8試劑中含有WST - 8 (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4- 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-MethoxyPMS (1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜(Formazan)產物。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。通過該方法可評價藥物對HUVCE增殖的影響。
[0024]方法:HUVEC細胞接種于96孔板中培養。待細胞生長達到80%融合后，將桔梗皂苷D按以下濃度0.3、1、3、10、30 μΜ加入孔中，作用24 h后每孔加與孔內體積比為1:10體積的CCK-8溶液，置于37 1:培養箱繼續孵育2 h，用可調波長式微孔酶標儀在450 nm處檢測OD值。以未加桔梗皂苷D的孔作為對照。以含細胞培養液和CCK-8溶液但不含細胞的孔作為空白。按如下公式計算細胞活力:
細胞活力(％)= (ODsample - ODblank) / (ODcontrol- ODblank) X 100%
結果與結論:請參照附圖1A，附圖1A是桔梗皂苷D抑制HUVEC的增殖的照片。如圖所示，桔梗皂苷D對HUVEC的增殖抑制作用呈劑量依賴關系。桔梗皂苷D的濃度為10 μ M時，HUVEC的細胞活力為30%，30 μ M濃度以上時的HUVEC的增殖被完全抑制，細胞活力為
O。相同濃度下人結直腸腺癌細胞(HCT-15)組未見明顯作用，顯示桔梗皂苷D具有低毒、特異的抗血管生成活性。
[0025]*林:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有極顯著性差異(P < 0.01)。
[0026]實施例1B桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)劃痕遷移實驗
方法:HUVEC細胞接種于12孔板中培養。待細胞生長達到90%融合后，將桔梗皂苷D按以下濃度0.3、1、3、10、30 μΜ加入孔中，作用24 h后每孔加新鮮不含藥物的完全培養基，置于37 1:培養箱繼續孵育48 h，用EVOS倒置顯微鏡拍照。以未加桔梗皂苷D的孔作為對照。
[0027]按照如下公式計算抑制率:
抑制率(％)=(終點寬度sample-終點寬度。。ntMl)/初始劃痕寬度X 100%
結果與結論:請參照附圖1B，附圖1B是桔梗皂苷D抑制HUVEC的增殖的照片。如圖所示，桔梗皂苷D對HUVEC的劃痕遷移的抑制作用呈劑量依賴關系。桔梗皂苷D的濃度為3μ M時，桔梗皂苷D對HUVEC水平劃痕的抑制率為40%，10 μ M濃度以上時的HUVEC的水平劃痕遷移被完全抑制。
[0028]*林:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有極顯著性差異(P < 0.01)。
[0029]實施例1C桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞水平運動實驗
采用Cell Motility Kit (細胞運動試劑盒)對細胞運動能力進行定量計算,該實驗可以預測潛在藥物在某些領域內的治療效果。該實驗通過將細胞接種于鋪有極小的熒光顆粒的96孔板中，細胞運動時會將表面的熒光顆粒吞噬或推開，就會留下沒有熒光的運動估計區域，該區域面積與細胞運動能力呈現正相關關系。通過高內涵篩選分析儀和相關統計軟件可以計算運動區域面積。
[0030]方法:使用I型膠原包被96孔板，將含有熒光顆粒的溶液加入，置于37 °C避光孵育I h，使用清洗液清洗5遍。使用含有不同桔梗皂苷D濃度(0.3-30 μ Μ)的培養基將HUVECC500細胞/孔)加入96孔板中，置于37 1:培養箱繼續孵育20 h。每孔加入200 μ L濃度為5.5%的甲醛溶液室溫下繼續孵育I h。使用清洗液清洗3遍，每孔加入含鬼筆環肽和細胞透化作用的溶液。清洗3遍后，置于高內涵篩選分析儀進行拍照分析。(鬼筆環肽，激發波長:542 nm,發射波長565 nm ;藍色突光顆粒,激發波長:365 nm,發射波長:415 nm。)以未加桔梗皂苷D的孔作為對照。
[0031]按照如下公式計算抑制率:
抑制率(％)=(軌跡面積。mtMl -軌跡面積sample)/軌跡面積。。ntMl X 100%
結果與結論:請參照附圖1C，附圖1C是桔梗皂苷D抑制HUVEC水平運動的照片。如圖所示，桔梗皂苷D對HUVEC的細胞水平運動抑制作用呈劑量依賴關系。桔梗皂苷D的濃度為3 μ M時，桔梗皂苷D對HUVEC細胞水平運動的抑制率為80%，10 μ M濃度以上時的HUVEC的細胞水平運動被完全抑制。
[0032]*林:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有極顯著性差異(P < 0.01)。
[0033]*:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有顯著性差異(P < 0.05) 實施例1D桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC) Transwell小室垂直遷移實驗 Transwell法檢測HUVEC遷移。Transwell是一種實驗技術，這項技術的主要材料是Transwell小室(chamber),小室的底層有一層通透性的膜(一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane),這層膜帶有孔徑大小0.1 - 12.0 Mm的微孔,實驗中細胞置于小室上，在小室下含有的趨化因子或生長因子的作用下，細胞透過聚碳酸酯膜，從而進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面的研究。
[0034]方法:下室加入600 μ?含有20 ng/ml的VEGF165的HUVEC培養液。上室中加入含有不同濃度桔梗皂苷D (0.3-30 μ M)的HUVEC (2X 14 cells/孔)，置于37 °〇培養箱中培養8 h。未加桔梗皂苷D的組為對照。8 h后，從培養箱取出培養板，棄去孔中培養液，力口Λ 600 μ?，4%多聚甲醛溶液常溫固定20 min，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后加Λ 200 μ?,Ο.1%結晶紫染色，最后用PBS溶液洗去多余的結晶紫染料。在蔡司倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0035]結果與結論:遷移后的細胞經結晶紫染色后顯紫紅色。請參照附圖1D，附圖1D是桔梗皂苷D抑制HUVEC Transwell小室垂直遷移的照片。由圖所示，與對照組相比，去氫木香內酯的濃度為10 μ M時，桔梗皂苷D對HUVEC細胞Transwell小室垂直遷移的抑制率為90%，30 μ M濃度以上時的HUVEC的細胞垂直遷移被完全抑制。
[0036]*林:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有極顯著性差異(P < 0.01)。
[0037]實施例1E桔梗皂苷D抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)小管生成實驗運用Matrigel膠檢測HUVEC的小管形成作用。人工基膜Matrigel膠是從小鼠EHS肉瘤中提取的基膜成分，在37 °C下可自發形成凝膠狀的人工基膜，具有天然基膜的生物學作用。人臍靜脈內皮細胞可以在Matrigel膠上粘附成管，從而可用于研究藥物對內皮細胞小管形成作用的影響。
[0038]方法:取50 UL Matrigel膠溶液加入到預冷的96孔培養板中，然后放置于37 °C培養箱孵育0.5 h使膠固化。將含有不同濃度桔梗皂苷D (0.3-30 μ Μ)的HUVEC (IXlO4cell/孔)分別加入鋪有Matrigel的96孔板中，置于37 °C培養箱培養10 h。未加桔梗皂苷D的組為對照。10 h后在倒置光學顯微鏡下觀察血管形成。按照如下公式計算抑制率:
抑制率(％)=(小管長度。mtMl -小管長度―)/小管長度_tMlX 100%
結果與結論:人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)可在Matrigel上延伸生長呈管狀并相互連接，形成三維網狀結構。請參照附圖1E，附圖1E是桔梗皂苷D抑制HUVEC小管形成的照片。由圖所示，與對照組相比，桔梗皂苷D的濃度為3 μ M時HUVEC的小管形成能力受到顯著抑制，濃度增至10 μ M時，細胞散在存在，未見小管形成，HUVEC小管形成能力被完全抑制。
[0039]實施例2桔梗皂苷D抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗
可將雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成實驗歸為體外模型，最初由Lewis等于1931年建立。并于1977年時，由Knighton、Folkman等首先將其用于腫瘤血管生成的相關領域研究。目前雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型成為國內外抗血管生成研究中使用較多的模型之一。
[0040]方法:受精雞蛋置于37 V，相對濕度60%培養箱孵育7天，用微型電動砂輪在氣室區域磨出直徑1.5 cm的一個圓環。揭去內殼膜，暴露出雞胚絨毛尿囊膜。將不同濃度的H)溶液(0.3-30 μ M)加于直徑0.5 cm的醋酸纖維素濾膜上，置于雞胚絨毛尿囊膜表面合適位置。在37 °C，相對濕度60%培養箱中繼續孵育48 h。采用數碼相機對雞胚絨毛尿囊膜進行拍照。按照如下公式計算抑制率:
抑制率(％)=(血管長度。mtMl -血管長度s_) /血管長度。mtMl X 100%
結果與結論:請參照附圖2。附圖2是桔梗皂苷D抑制雞胚絨毛尿囊膜表面血管生成的照片。如圖所示，桔梗皂苷D對雞胚絨毛尿囊膜表面血管生成的抑制作用呈劑量依賴關系。桔梗皂苷D的濃度為10 μ M時，桔梗皂苷D對血管生成的抑制率為80%，30 μ M濃度以上時表面的血管生成幾乎被完全抑制。
[0041]***:與對照組(桔梗皂苷D的濃度為O μ Μ)相比具有極顯著性差異(P < 0.01)。
[0042]實施例3桔梗皂苷D抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤生長的實驗
方法:人結直腸腺癌細胞(HCT-15)接種于BALB/c裸鼠皮下(IXlO6 cell/每只裸鼠)，待腫瘤平均體積達到100 mm3,每天腹腔注射給予6 mg/kg劑量的桔梗阜苷D,給藥過程中每天測量腫瘤體積。腫瘤體積計算公式如下:
腫瘤體積=0.5 X (腫瘤長徑)X (腫瘤短徑)2
將最終的腫瘤組織經多聚甲醛固定，石蠟包埋。經免疫組化實驗檢查腫瘤組織內壞死面積和微血管密度。
[0043]結果與結論:請參照附圖3。附圖3A是桔梗皂苷D(PD)抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤生長的照片不含桔梗皂苷D的生理鹽水組作為對照。附圖3B是給藥過程中H)抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤生長的腫瘤體積記錄，不含桔梗皂苷D的生理鹽水處理組作為對照。附圖3C是給藥15天后，桔梗皂苷D處理組和不含桔梗皂苷D的生理鹽水組的腫瘤重量比較。附圖3D是給藥15天后，桔梗皂苷D處理組和生理鹽水組腫瘤組織壞死面積的免疫組化結果。結果顯示，桔梗皂苷D給藥組與生理鹽水給藥組相比顯著增加腫瘤組織壞死面積。附圖3E是給藥15天后，桔梗皂苷D處理組和生理鹽水組腫瘤組織微血管密度的免疫組化結果。結果顯示，桔梗皂苷D給藥組與生理鹽水組相比顯著降低腫瘤組織微血管密度。
[0044]通過附圖3A、B、C、D、E可知，桔梗皂苷D可通過其抗血管生成作用顯著抑制裸鼠皮下異位接種腫瘤的生長，減小腫瘤體積，增加腫瘤組織壞死面積，降低腫瘤組織微血管密度。
[0045]實施例4桔梗皂苷D特異性阻斷血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)介導的信號通路發揮其抗血管生成作用。
[0046]方法:采用western-blot實驗評價桔梗阜苷D對VEGF依賴性血管生成的作用。將HUVEC細胞接種于6孔板內(IX 15 cell/孔)，置于37 °C培養箱孵育24 h。采用無血清培養基饑餓培養6 h后，加入不同濃度的桔梗皂苷D (0.1-10 μΜ)孵育0.5 h，隨后加入100 ng/mL VEGF刺激4 min。使用加入PMSF和磷酸化抑制劑的RIPA裂解液對HUVEC細胞進行裂解。經蛋白定量后，沒份樣本取40 μ g膜蛋白于8%-10% SDS-PAGE膠上樣。采用分子對接軟件(Μ0Ε 2011.10)考察血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)和桔梗皂苷D之間的分子相互作用。
[0047]結果與結論:請參照附圖4。附圖4A是桔梗皂苷D (PD)呈劑量依賴性的抑制磷酸化的VEGFR2表達水平，以及對其下游的PLCyI，JAK2, FAK, Src, Akt也呈現顯著抑制作用。附圖4B是桔梗皂苷D (PD)可成功結合于VEGFR2的ATP結合位點，表明桔梗皂苷D通過抑制VEGFR2的ATP結合位點表現出VEGFR2激酶抑制劑的作用。
[0048]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.桔梗皂苷D在制備抑制血管生成藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的血管生成為腫瘤血管新生，所述的腫瘤為實體腫瘤，所述的實體腫瘤為原發性或繼發性實體腫瘤。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤血管新生為腫瘤病變組織的血管新生或腫瘤導致的血管新生。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤血管新生為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌癥的血管新生。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的血管生成為銀屑病病變組織血管新生、Paget’s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、關節炎病變組織的血管新生、動脈粥樣硬化病變處的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病為原發性或繼發性新生血管性眼病。
6.桔梗皂苷D作為單一成分或與其它藥學上可接受的成分構成組合物在制備抑制血管生成的藥物中的應用，所述的其它藥學上可接受的成分是與桔梗皂苷D沒有拮抗作用的藥物，或藥學上允許的一種或多種輔料。
7.根據權利要求1-6任一所述的應用，其特征在于，所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、微囊制劑、注射劑、栓劑、噴霧劑或軟膏劑。
8.根據權利要求1-6任一所述的應用，其特征在于，所述的藥物的給藥方式為注射、口月艮、吸入式噴霧或透皮給藥。
【文檔編號】A61P9/00GK104161765SQ201410414981
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】方超, 陳紅專, 欒鑫, 趙梅, 管瀅蕓, 陸琴, 徐見容, 劉亞蓉, 劉海軍, 高云鴿 申請人:上海交通大學醫學院