一種巖藻聚糖硫酸酯、其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及提取多糖，更具體地說，涉及一種巖藻聚糖硫酸酯、其制備方法及在制 備用于預防或治療腫瘤的藥物或保健品中的應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是威脅全世界人民健康的頭號殺手。每年因腫瘤死亡的人數位居所有疾病之 首。隨著環境的惡化以及人民生活壓力的增加，腫瘤的發病率有逐年升高的趨勢。治療腫 瘤的策略有很多。抑制血管生成就是治療腫瘤的一種有效的策略。自從1971年Folkman 提出通過抑制新生血管生成來治療腫瘤的思路后，人們對于腫瘤治療的思路得到了極大的 拓寬。目前已有一些小分子和生物大分子成為通過抗血管生成來治療腫瘤的藥物。
[0003] BMP (bone morphogenetic protein，骨形成蛋白）是一類屬于 TGF-β (轉化生長 因子β)超家族的細胞因子。最初研究人員發現BMP能促進骨的形成，所以把這一類氨基 酸序列同源性高、結構相似的生長因子稱為骨形成蛋白。但是后續深入的研究表明，這一類 蛋白不僅僅是與骨形成有關，它還與各種細胞的分化、器官形成有密切關系。通過抑制BMP4 的信號通路，可以抑制新生血管生成，實現抗腫瘤的目的。
[0004] 多糖物質是海蘊藻體的重要組成部分，目前研究較少。現有的研究僅限于海蘊巖 藻聚糖硫酸酯結構的初步表征，并不了解其詳細結構，并且沒有關于海蘊來源的巖藻聚糖 硫酸酯的生物活性的報道。
【發明內容】
[0005] 本申請的發明人經過廣泛深入的研究，利用一種簡單有效的多糖提取工藝和方 法，從海蘊（Nemacystus decipiens)提取獲得了一種巖藻聚糖硫酸酯。藥理實驗表明，所 述巖藻聚糖硫酸酯可以劑量依賴性地抑制HMEC-I細胞的迀移和管腔形成，其作用機制是 與BMP4結合并抑制下游信號通路，同時下調BMP4的表達水平，具有潛在的預防或治療腫瘤 的作用。
[0006] 因此，本發明的一個方面是提供一種巖藻聚糖硫酸酯，其結構式如下：
[0008] 其中，a 為約 17. 6mol %，b 為約 45. Omol %，c 為約 16. 6mol %，d 為約 20. 8mol %，
[0009] R為結構式如下的基團：
[0011] 其中，m為4, η為5, O為3, P為4, q為7, r為4,并且乙酰基的位置可以是 a _L_1，3_Fucp4S 的 C2 位或 a _L_1，3-Fucp 的 C2 位，
[0012] 其中，Fuc代表巖藻糖，GlcA代表葡萄糖醛酸，Man代表甘露糖。
[0013] 圖6顯示了根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯的結構式的放大圖。
[0014] 上式和圖6中，α和β代表糖苷鍵連接的兩種構型，D和L代表單糖的構型，p代 表糖環是吡喃型，箭頭代表一個化學鍵，箭頭兩邊的數字代表糖苷鍵的成鍵位置。括號外面 字母代表的數字是相應基團的摩爾比。
[0015] 其中，所述巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量范圍為約10_350kD，優選為約 100-280kD，更優選為約 150-250kD。
[0016] 所述巖藻聚糖硫酸酯含有甘露糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、硫酸基和乙酰基，它們的 摩爾比為約 3. 0:14. 4:82. 6:34. 3:13. 9。
[0017] 所述巖藻聚糖硫酸酯具有基本上與圖1中的主要伸縮振動吸收峰一致的紅外 圖譜，其中，在所述巖藻聚糖硫酸酯的紅外圖譜中，3447. Icm1附近為O-H伸縮振動吸收 峰，2928. 4cm 1附近為C-H伸縮振動吸收峰，1000 -HOOcm 1附近為C-O和糖環振動信號， 1256. 4cm 1附近是0 = S = 0伸縮振動吸收峰。
[0018] 所述巖藻聚糖硫酸酯具有基本上與圖2中的主要信號值一致的13C-NMR譜，其中， 在所述巖藻聚糖硫酸酯的 13C-NMR譜中，位于δ 175. 75的信號是葡糖糖醛酸的羧基碳信號， 位于δ 174. 51的信號是巖藻糖上乙酰基的羰基碳信號，位于δ 91- δ 103的端基碳信號分 別為末端巖藻糖、1，4-巖藻糖、1，3-巖藻糖、1，3, 4-巖藻糖、1，2-甘露糖、1，2, 3-甘露糖、 1，2, 4-甘露糖、1，2, 6-甘露糖和末端甘露糖的Cl信號；在δ 16. 29左右為巖藻糖甲基碳的 信號峰；在S 21. 29處為乙酰基甲基碳的信號峰。
[0019] 所述巖藻聚糖硫酸酯具有基本上與圖3中的主要信號值一致的1H-NMR譜。其 中，在所述巖藻聚糖硫酸酯的 1H-NMR譜中，位于δ 5. 0-5. 7的信號是異頭氫的信號，位于 δ 3. 25-4. 65的信號是糖環上的氫的信號，位于δ 2. 28附近的信號是典型的乙酰基上甲基 氫的信號，位于δ 1. 30附近的信號是巖藻糖Η6的信號。根據δ 2. 28附近的信號和δ 1. 30 附近的信號的積分面積比可知，乙酰基與巖藻糖的摩爾比為0. 168:1。由于巖藻糖占總糖的 摩爾分數是82.6%。所以可以換算出乙酰基與總糖的摩爾比是0.139:1。從上述結果可以 發現本發明的巖藻聚糖硫酸酯是一種乙酰化的巖藻聚糖硫酸酯。
[0020] 優選地，本發明的巖藻聚糖硫酸酯是從海蘊（Nemacystus decipiens)中提取出的 多糖。
[0021] 本發明的另一方面是提供所述巖藻聚糖硫酸酯的制備方法，該方法包括以下步 驟：
[0022] a.多糖提取：干燥的海蘊經乙醇脫脂后用約20°C -90°C (優選約50°C -80°C，更 優選約80°C )水提取，提取液過濾后濃縮得到濃縮液，向濃縮液中加入乙醇至乙醇濃度為 約40% -90% (V/V)(優選約80% (V/V))得到沉淀，將沉淀干燥后得水提粗多糖；
[0023] b.多糖純化：將步驟a得到的水提粗多糖用強陰離子柱（例如，Q sepharose Fast Flow)進行分級純化，依次用水和約0. 1-0. 5M NaCl (優選約0. 1-0. 4M，更優選約 0. 15-0. 3M，最優選約0. 2M NaCl)水溶液洗脫，收集NaCl水溶液洗脫組分得純化多糖，純化 多糖再經凝膠色譜（例如，Sephacryl S-300HR)純化得到根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯。
[0024] 更具體地，本發明提供的巖藻聚糖硫酸酯的制備方法包括以下步驟：
[0025] a.多糖提取：干燥的褐藻海蘊經乙醇脫脂，風干，用約20 °C -90 °C (優選約 50°C -80°C，更優選約80°C )去離子水提取，過濾，殘渣再次用所述去離子水提取，如此反復 提取4-20次，濾液合并，加熱濃縮，透析，再濃縮，加入乙醇至乙醇濃度為約40% -90% (V/ V)(優選約80% (V/V))，離心得沉淀，沉淀經無水乙醇和無水丙酮依次洗滌后，真空干燥得 水提粗多糖；
[0026] b.多糖純化：將步驟a中得到的水提海蘊粗多糖用強陰離子柱（例如，Q sepharose Fast Flow)進行分級純化，依次用水和約0. 1-0. 5M NaCl (優選約0. 1-0. 4M，更 優選約0. 15-0. 3M，最優選約0. 2M NaCl)水溶液洗脫，收集NaCl水溶液洗脫組分得純化多 糖，純化多糖再經凝膠色譜（例如，Sephacryl S-300HR)純化得到根據本發明的巖藻聚糖 硫酸酯。
[0027] 根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯能與BMP4強烈結合，顯著地抑制BMP4的表達，并且 通過顯著地抑制Smadl/5/8的磷酸化而阻斷BMP4/Smad信號通路，從而抑制BMP4誘導的管 腔形成，由此能夠抑制表皮血管內皮細胞的生長和迀移，具有抗血管生成活性，進而能夠用 于預防或治療腫瘤。
[0028] 因此，本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于抑 制BMP4的表達的藥物組合物或保健品中的用途。
[0029] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于抑制 Smadl/5/8的磷酸化的藥物組合物或保健品中的用途。
[0030] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于阻斷 BMP4/Smad信號通路的藥物組合物或保健品中的用途。
[0031] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于抑制 BMP4誘導的管腔形成的藥物組合物或保健品中的用途。
[0032] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于抑制表 皮血管內皮細胞的生長和迀移的藥物組合物或保健品中的用途。
[0033] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備用于抗血管 生成的藥物組合物或保健品中的用途。
[0034] 本發明的又一方面是提供上述根據本發明的巖藻聚糖硫酸酯在制備預防或治療 腫瘤的藥物組合物或保健品中的用途。
[0035] 本發明的再一方面是提供一種藥物組合物，其包含上述根據本發明的巖藻聚