抑制眼部血管生成的方法

專利名稱：抑制眼部血管生成的方法
技術領域：
本發明一般涉及可用于治療與血管生成相關的病癥和疾病的組合物和方法。具體 地,本發明涉及tetraspanin 12(TSPAN12)和Norrin的拮抗劑。
背景技術：
現已相當確定血管生成是促進多種病癥發病的重要因子。這些包括實體瘤 和轉移瘤、眼內新血管疾病(intraocular neovascular disease)如增殖性視網膜病 (proliferative retinopathies),例如糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy) > 視網膜靜脈閉塞(retinal vein occlusion, RV0)、濕性年齡相關的黃斑變性(wet age-related macular degeneration, AMD)、新血管性青光目艮(neovascular glaucoma)、 移植角膜組織和其它組織的免疫排斥和類風濕性關節炎。Duda等人J. Clin. Oncology (臨 床腫瘤學雜志)25 (26) =4033-42 (2007) ；Kesisis 等人 Curr. Pharm. Des.(現代藥物設 計)13 :2795-809^007) ；Zhang 和 Ma Prog. Ret. & Eye Res.(視網膜和眼研究進展)26 1-37(2007)。視網膜從視網膜血管和脈絡膜血管獲得其血液供應，視網膜血管供應視網膜內 部部分，脈絡膜血管供應外部部分。視網膜血管損傷發生在數種疾病過程中，包括糖尿病 性視網膜病、早產兒視網膜病(retinopathy of prematurity)和視網膜中央和分支靜脈 1 塞(central and branched retinal vein occlusions) ( 生豐見網月莫病(ischemic retinopathies)) 0來自這種損傷的視網膜局部缺血導致不良的新血管形成。脈絡膜的新 血管形成在許多其它疾病過程(包括AMD)中發生。相比之下，視網膜不完全的血管化是 患有某些遺傳病的患者的標志，該遺傳病例如由Wnt受體FrizzlecM0^(14)、共受體LRP5 或分泌的配體Norrin的突變導致的家族性滲出性玻璃體視網膜病(familial exudative vitreoretinopathy, FEVR)禾口諾里病(Norrie disease) (Berger 等人 Nature Genet.(自 然遺傳)1 :199-203(1992) ；Chen 等人 Nature Genet.(自然遺傳)1 :204-208 (1992)； Robitaille 等人 Nature Genet.(自然遺傳)32 :326-30(2002) ；Toomes 等人 Am. J. Hum-Genet. (美國人類遺傳性雜志)74 :721-30(2004))。可在敲除相應同源基因的小鼠中獲得 這些遺傳病的模型。盡管在眼部血管生成領域有許多進展，仍然需要鑒定靶點并且開發能夠補充或增 強現有療法的效力的方式。發明概述本發明至少部分地基于以下發現，TSPAN12是Norrin誘導的、Frizzled_4-和LRP5-介導的信號轉導途徑的組分并且在病理性的血管生成的發展中是必需的。因此， Norrin和TSPAN12是抑制異常眼部血管生成(包括不含Norrin、TSPANl2, Frizzled-4或 LRP5基因的遺傳突變的病癥)的藥物靶點。因此，本發明提供使用阻斷Norrin或TSPAN12 活性的試劑治療與血管生成相關的眼部疾病的新方法。一方面，本發明提供減少或抑制患有與血管生成相關的眼部疾病或病癥的受試 者中血管生成的方法，該方法包括向該受試者施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案 中，該TSPAN12拮抗劑是抗-TSPAN12抗體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包含 TSPAN12的多肽片段，包括胞外域，如第二胞外環。在一些實施方案中，該拮抗劑還包含 免疫球蛋白恒定區，例如IgG Fe。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項 組成的組糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)、脈絡膜新血管形成(choroidal neovascularization, CNV)Stffi^;WJtSEi^ft (age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)、病理性近視(pathological myopia)、遺傳性斑痣性錯構瘤病(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的組織胞漿菌 ^f (histoplasmosis of the eye) > ^ N II Φ # J0C 1 ^ (central retinal vein occlusion，CRVO)、視網月莫分支靜脈 1 塞(branched central retinal vein occlusion, BRV0)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、視網膜新血管形成(retinal neovascularization)、早產兒視網膜病(retinopathy of prematurity, R0P)、結膜下出血 (subconjunctival hemorrhage)禾口高血壓性視網膜病(hypertensive retinopathy)。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該TSPAN12拮抗劑之前或之后施用。在一些實施方案中，該 第二抗-血管生成劑與該TSPAN12拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗-血管 生成劑是Norrin的拮抗劑或血管內皮細胞生長因子(VEGF)的拮抗劑。在一些實施方案 中，該Norrin拮抗劑或該VEGF拮抗劑是抗-Norrin抗體或抗-VEGF抗體(例如，雷珠單抗 (ranibizumab))。另一方面，本發明提供減少或抑制罹患與血管生成相關的眼部疾病或病癥的受試 者中血管生成的方法，該方法包括向該受試者施用Norrin拮抗劑。在一些實施方案中，該 Norrin拮抗劑是抗-Norrin抗體。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組 成的組糖尿病性視網膜病、CNV、AMD、DME、病理性近視、遺傳性斑痣性錯構瘤病、眼睛的組 織胞漿菌病、CRV0、BRV0、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、R0P、結膜下出血和高血壓性 視網膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該Norrin拮抗劑之前或之后施用。在一些實施方案中，該第 二抗-血管生成劑與該Norrin拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗_血管生成 劑是VEGF的拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，如雷珠單抗。另一方面，本發明提供治療受試者中與不希望的血管生成相關的眼部疾病或病癥 的方法，該方法包括向該受試者施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗 劑是抗-TSPAN12抗體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包含TSPAN12的多肽片段， 包括胞外域，如第二胞外環。在一些實施方案中，該拮抗劑還包含免疫球蛋白恒定區，例如 IgG Fe。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組成的組包括增殖性糖尿病性視網膜病的增殖性視網膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相關的視網膜病、DME、病理 性近視、遺傳性斑痣性錯構瘤病、眼睛的組織胞漿菌病、CRVO、BRV0、角膜新血管形成、視網 膜新血管形成、R0P、結膜下出血和高血壓性視網膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該TSPAN12拮抗劑之前或之后施用。在其它實施方案中，該 第二抗-血管生成劑與該TSPAN12拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗-血管 生成劑是Norrin的拮抗劑或VEGF拮抗劑。在一些實施方案中，該Norrin拮抗劑或該VEGF 拮抗劑是抗-Norrin抗體或抗-VEGF抗體(例如，雷珠單抗)。另一方面，本發明提供治療受試者中與不希望的血管生成相關的眼部疾病或病癥 的方法，該方法包括向該受試者施用Norrin拮抗劑。在一些實施方案中，該Norrin拮抗劑 是抗-Norrin抗體。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組成的組包括 增殖性糖尿病性視網膜病的增殖性視網膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相關的視網膜 病、DME、病理性近視、遺傳性斑痣性錯構瘤病、眼睛的組織胞漿菌病、CRVO、BRV0、角膜新血 管形成、視網膜新血管形成、R0P、結膜下出血和高血壓性視網膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該Norrin拮抗劑之前或之后施用。在其它實施方案中，該第 二抗-血管生成劑與該Norrin拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗_血管生成 劑是VEGF拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，如雷珠單抗。另一方面，本發明提供使用肽產生抗體的方法，該肽基本上由氨基酸 CRREPGTDQMMSLK(SEQ ID NO 5)組成。在一些實施方案中，該方法包括用該肽免疫動物。在 一些實施方案中，該方法包括篩選文庫(例如Fab文庫)以鑒定結合該肽的抗體或抗體片 段。在一些實施方案中，本發明提供通過任何此類方法產生的抗體。在一些實施方案中，本 發明提供使用任何此類抗體檢測TSPAN12的方法。另一方面，本發明提供抑制FZD4多聚體形成的體外和體內方法，其包括施用 TSPAN12拮抗劑。另一方面，本發明提供抑制Norrin-介導的信號傳導的體外和體內的方 法，其包括施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑是抗-TSPAN12抗 體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包括TSPAN12的多肽片段，包括胞外域，如第二 胞外環。在一些實施方案中，該拮抗劑還包括免疫球蛋白恒定區，例如IgG Fe。另一方面，本發明提供治療患有先天眼部疾病的受試者的方法，該眼部疾病是由 Norrin, TSPANl2, FZD4或LRP5基因中任意一個的遺傳突變導致的，該方法包括向該受試 者施用增強FZD4多聚體形成的試劑。在一些實施方案中，該疾病是FEVR、諾里病(Norrie disease)或滲出性視網膜病(Coate，s disease)。在一些實施方案中，提高FZD4多聚體 形成的試劑選自由下述各項組成的組=Norrin、抗-FZD4抗體、抗-LRP5抗體和雙特異性 抗-FZD4/抗-LRP5抗體。在一些實施方案中，該遺傳突變破壞FZD4-介導的信號傳導。在 一些實施方案中，受試者中的該遺傳突變在該受試者中產生異常蛋白產物，該產物選自由 Norrin-C95R、FZD4-M105V和FZD4-M157V組成的組。在一些實施方案中，在治療受試者之 前檢測該突變在受試者中的存在。附圖簡述

圖1顯示代表性早產兒視網膜病(ROP)視網膜切片野生型(頂部)和TSPAN12敲除(KO)小鼠(底部)。圖2顯示在來自于野生型(WT ；左)和TSPANl2 KO小鼠(Hom ；右)的ROP視網膜 切片中觀察的新血管核數目的定量結果。圖3顯示TSPAN12增強Norrin通過FzcM/LRPS介導的信號轉導。圖4顯示TSPAN12對Norrin-介導的信號轉導的增強是!^zcM特異性的。圖5顯示TSPAN12不增強介導的信號轉導。圖6顯示Norrin結合至!7ZtM但不結合至LRP5或TSPAN12。圖7顯示Norrin結合至表達!7ZtM的細胞，但不結合至表達!^(15，LRP5或TSPAN12 的細胞，并且Norrin不與TSPAN12免疫共沉淀。圖8顯示TSPAN12不與LRP5相關聯。圖9顯示TSPAN12不增強Norrin對Fzd4的結合。圖10顯示共表達TSPAN12不改變在質膜上的表達。圖11顯示野生型Norrin和C95R突變體Norrin形成的高級結構。圖12顯示過表達TSPAN12能夠補償單體C95R Norrin的缺陷。圖13顯示TSPAN12調節FZD4在信號傳導過程中的聚集(clustering)。優選實施方案的詳細描述定義除非另有定義，本文使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人 員通常理解的相同含義。參見例如Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物學和分子生物學詞典)第二版，J. Wiley & (New York, NY 1994) ；Sambrook 等人，Molecular CloninR, A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室指 南)，Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)。為本發明的目的，對某 些術語定義如下。當用于本文時，術語“TSPAN12”、“TSPAN12多肽”、“Norrin”、和“Norrin多肽”是指 具有從自然界獲得的TSPAN12或Norrin多肽的氨基酸序列的多肽，而不論其制備方式或物 種。因此，此類多肽可具有來自于人、小鼠或任何其它物種的天然存在的TSPAN12或Norrin 的氨基酸序列。全長人TSPAN12氨基酸序列是MAREDSVKCLRCLLYALNLLFffLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMI AVCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGSLLVIFCVELACGVWTYEQELMVPVQWSDMVTLKARMTNYGLPRYR ffLTHAWNFFQREFKCCGVVYFTDWLEMTEMDWPPDSCCVREFPGCSKQAHQEDLSDLYQEGCGKKMYSFLRGTKQ LQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLWALYYDRREPGTDQMMSLKNDNSQHLSCPSVELLKPSLSRIFEHTSMAN SFNTHFEMEEL(SEQ ID NO :1).全長小鼠TSPANl2氨基酸序列是MAREDSVKCLRCLLYALNLLFWLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMIA VCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGTLLVIFCVELACGVWTYEQEVMVPVQffSDMVTLKARMTNYGLPRYRffL THAffNYFQREGCGKKMYSFLRGTKQLQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLffALYYDRREPGTDQMLSLKNDTSQHL SCHSVELLKPSLSRIFEHTSMANSFNTHFEMEEL(SEQ ID NO :2).全長人Norrin氨基酸序列是MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVL LARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS(SEQ ID NO 3).全長小鼠Norrin氨基酸序列是MRNHVLAASISMLSLLAIMGDTDSKTDSSFLMDSQRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQ ASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECSS(SEQ ID NO 4).此類TSPAN12或Norrin多肽可從自然界分離或可通過重組和/或合成方式產生。“分離的”用于指多肽時意思是其已經從天然來源純化或已經通過重組或合成方 法制備并純化。“純化”的多肽基本上無其它多肽或肽。此處“基本上無”的意思是低于大 約5 %，優選地低于大約2 %，更優選地低于大約1 %，甚至更優選地低于大約0.5%，最優選 地低于大約0. 的其它來源蛋白的污染。術語“拮抗劑”以最廣義使用，包括部分或完全阻斷、抑制、或中和多肽生物學活性 的任何分子。例如TSPAN12或Norrin的拮抗劑將部分或完全阻斷、抑制或中和TSPAN12或 Norrin的下述能力，即轉導或起始Norrin-誘導的信號傳導或在眼中形成病理性血管的能 力。合適的拮抗劑分子具體包括拮抗性抗體或抗體片段、天然TSPAN12或Norrin多肽的片 段或氨基酸序列變體、肽、TSPAN12或Norrin共受體的可溶性片段、反義RNA、核酶、RNAi、有 機小分子等。用于鑒定TSPAN12或Norrin多肽的拮抗劑的方法可包括使TSPAN12或Norrin 多肽接觸候選拮抗劑分子并測量通常與該多肽有關的一種或多種生物學活性的可檢測的 變化。為本文的目的“有活性的”或“活性”是指保留生物學和/或免疫學活性的TSPAN12 或Norrin的形式，其中“生物學”活性是指TSPAN12或Norrin引起的、除了誘導產生抗體 的能力之外的生物學功能，且“免疫學”活性是指誘導產生抗體的能力，該抗體針對TSPAN12 或Norrin具有的抗原表位。TSPAN12和Norrin主要的生物學活性是轉導或起始Norrin-誘 導的信號傳導和誘導眼中病理性血管形成。"TSPANl2 共受體(co-rec^ptor) ”或"Norrin 共受體”是指 TSPANl2 或 Norrin 結 合并介導TSPAN12或Norrin生物學活性的分子。術語“抗體”以最廣義使用，具體覆蓋人、非人(例如鼠的)和人源化的單克隆抗 體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段， 只要它們能展現出所期望的生物學活性。“天然抗體”通常是異源四聚體糖蛋白，大約150，000道爾頓，由兩條相同輕(L)鏈 和兩條相同重(H)鏈構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鍵的數量在 不同免疫球蛋白同種型的重鏈中是變化的。每條重鏈和輕鏈也具有規則間隔的鏈內二硫 鍵。每條重鏈在一個末端具有可變結構域(Vh)，隨之是一些恒定結構域。每條輕鏈在一個 末端具有可變結構域(VJ，且在其另一個末端具有恒定結構域；輕鏈的恒定結構域與重鏈 的第一恒定結構域并排，且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域并排。認為特定氨基酸殘 基形成輕-和重-鏈可變結構域之間的界面。木瓜蛋白酶消化抗體得到兩個相同的抗原結合片段，各帶一個抗原結合位點，稱 為“Fab”片段，和剩余的“Fe”片段，該名稱反映了其易于結晶的能力。胃蛋白酶處理得到 F(ab' )2片段，該片段具有兩個抗原-結合位點，仍能交聯抗原。“Fv”是最小的含有完整抗原識別和結合位點的抗體片段。該區由一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域緊密、非共價結合的二聚體組成。Fab段還含有輕鏈恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CHl)。Fab’片段不同于 Fab片段，因為在重鏈CHl結構域羧基末端添加了數個殘基，包括來自抗體絞鏈區的一個或 多個半胱氨酸。本申請中Fab’_SH為其恒定結構域的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab’。 F(ab' )2抗體片段最初作為在彼此之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段而制備。其它 抗體片段的化學偶聯也已知。根據其恒定結構域的氨基酸序列，任一脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”都可被劃分為兩種完全不同的類型之一，稱kappa ( κ )和IambdaU )。根據其重鏈恒定結構域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的類。主要有5 類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分為亞類(同種型)，例如， IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。免疫球蛋白不同類的重鏈恒定結構域分別稱為α、 δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結構和三維構象已經熟知。“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合結構域或可變結構域。抗 體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'片段。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體中獲得的抗體，即除 了可能少量存在的天然存在的突變之外，構成群體的各個抗體相同。單克隆抗體是高度特 異性的，其針對單一抗原位點。另外，與典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的 常規(多克隆)抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克 隆”表明抗體的特征是從基本上同質的抗體群中獲得的抗體，并不能解釋為要求通過任何 特定方法來生成抗體。例如，將用于本發明的單克隆抗體可通過雜交瘤方法(由Kohler等 人，Nature(自然)，256 =495(1975)第一次描述)制備，或可通過重組DNA法(參見如，美國 專利No. 4，816，567)制備。“單克隆抗體”也可以使用例如在Clackson等人，Nature (自然)， 352 :624-628 (1991)和 Marks 等人，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，222 :581-597 (1991) 中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特 定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍 生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，還可以是此類 抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ；和Morrison等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國科學院院刊)，81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠的)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白 的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中受體的高 變區殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(如小鼠、大鼠、兔或非 人靈長類動物)的高變區殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用 相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的 至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有高變區對應于非人免疫球蛋白的 高變區，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少 部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見Jones等人， Nature (自然)321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature (自然)332 :323-3 (1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.(結構生物學新觀點)2 :593-596 (1992)。當用于本文時，“治療0”是獲得有益或期望臨床結果的方式。為本發明的目的， 有益或期望的臨床結果包括但不限于緩解癥狀、減輕疾病程度、穩定(例如不惡化)疾病病 癥、延緩或減慢疾病進展、改善或緩和疾病病癥、和緩解(無論部分或完全)、無論可檢測或 不可檢測。“治療”是一種介入，其實施的意圖是預防病癥的進展或改變疾病的病理。因此， “治療”可以指治療性處理或預防性或防范性措施。需要治療的那些包括已經患有病癥的那 些，也包括其中需要預防病癥的那些。具體而言，治療可直接預防、減緩或其它情況下降低 細胞退化的病理或損傷，如在癌癥治療中腫瘤細胞的病理，或可使細胞更易于通過其它治 療劑治療。“長期”施用指與短期模式相反，以連續模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活 性)維持較長一段時間。“間歇”施用指不是無間斷連續進行的治療，而是本質上周期性的。“眼內新血管疾病(intraocular neovascular disease) ”是一種以眼部新血 管形成為特征的疾病。眼內新血管疾病的實例包括，但不限于，包括增殖性糖尿病性視 網膜病(proliferative diabetic retinopathy)的增殖性視網膜病、脈絡膜新血管生
(choroidal neovascularization, CNV) Stffi^;WjtSEi^ft (age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性及其他缺血相關的視網膜病(diabetic and other ischemia-related retinopathies)、糖尿病性黃斑水月中(diabetic macular edema, DME)、病理性近視(pathological myopia)、遺傳性斑痣性錯構瘤(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的組織胞漿菌病(histoplasmosis of the eye)、視網膜中央靜脈閉塞 (central retinal vein occlusion，CRV0)、豐見網膜分支1 塞(branched central retinal vein occlusion，BI VO)、角月莫新il 管形 (corneal neovascularization) ^ 網膜新血管形成(retinal neovascularization)、早產 JL視網膜病(retinopathy of prematurity, R0P)、結膜下出血(subconjunctival hemorrhage)、禾口高血壓性視網膜病 (hypertensive retinopathy)。優選地，眼內新血管疾病不包括由于Norrin、TSPAN12、 Frizzled-4或LRP5基因的任一個遺傳突變導致的病癥。例如，本發明的眼內新血管疾病優 選不包括FEVR和諾里病等。疾病的“病理”包括危害患者健康的所有現象。“聯合”一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)和以任意次序的連續施用。當用于本文時，“載體”包括藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，其在所采用的 劑量和濃度對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是水性PH 緩沖溶液。生理學可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗 氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠 或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑， 諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑， 諸如 TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。本文定義的“小分子”具有低于大約500道爾頓的分子量。實施本發明的方法
TSPANl2或Norrin活性的拮抗劑的制備和鑒定設計用于拮抗性藥物候選物的篩選測定以鑒定下述化合物，該化合物結合或與 TSPAN12或Norrin多肽復合，或另外干擾它們的活性和/或與其它細胞蛋白相互作用。小分子可具有作為TSPAN12或Norrin拮抗劑起作用的能力并因而在治療上是有 用的。此類小分子可包括天然存在的小分子、合成有機或無機化合物和肽。然而。本發明 的小分子不限于這些形式。小分子的廣泛文庫是可商業獲得的，并且本文教導的或本領域 熟知的廣泛的多種測定用于關于期望的活性來篩選這些分子。在一些實施方案中，小分子TSPAN12或Norrin拮抗劑通過它們抑制一種或多種 TSPANl2或Norrin生物學活性的能力來鑒定。因而，使候選化合物與TSPAN12或Norrin 接觸，并然后評定TSPAN12或Norrin的生物學活性。在一個實施方案中，評定TSPAN12或 Norrin轉導或起始Norrin-介導的信號傳導的能力。當TSPAN12或Norrin的生物學活性 被抑制時，化合物被鑒定為拮抗劑鑒定為TSPAN12或Norrin拮抗劑的化合物可用于本發明的方法。例如，TSPANl2 或Norrin拮抗劑可用于治療眼內新血管疾病。多種熟知的動物模型(包括例如早產兒視網膜病和激光-誘導的脈絡膜新血管形 成的模型；Ruiz-Edera & Verkman hvest. Ophthalmol. & Vis. ki.(研究性眼科學和視覺 科學)48 (10) =4802-10 (2007)，Yu 等人 Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci.(研究性眼科學和 視覺科學)49(6) :2599-605(2007))可用于進一步理解TSPAN12或Norrin在眼內新血管疾 病的發展和發病中的作用，以及用于測試候選治療劑的效力，包括抗體和其它天然TSPAN12 或Norrin多肽的拮抗劑(諸如小分子拮抗劑)。此類模型的體內性質使得它們可特別對人 患者的反應進行預測。抗體結合研究測試了抗體結合并抑制TSPAN12或Norrin在Wnt信號傳導報告細胞中的效應的 能力。示例性方法在實施例2中提供，但其它方法對本領域普通技術人員是顯而易見的。示 例性抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異源偶聯的抗體，其制備在本 文中描述。抗體結合研究可通過任何已知的測定方法(如競爭性結合測定、直接和間接 夾心測定、和免疫沉淀測定)來進行。Zola，Monoclonal Antibodies :A Manual of ^Techniques (單克隆抗體技術手冊)(CRC Press, Inc.，1987)，第 147-158 頁。競爭性結合測定依賴于標記的標準物和測試樣品分析物競爭性結合有限量的抗 體的能力。測試樣品中靶標蛋白的量與已經與抗體結合的標準物的量成反比。為助于確定 已經結合的標準物的量，抗體在競爭前或競爭后優選是不溶解的，從而結合至抗體的標準 物和分析物可方便地從保持未結合的標準物和分析物中分離。夾心測定涉及使用兩種抗體，每種能夠結合至待檢測蛋白的不同免疫原性部 分，或表位。在夾心測定中，測試樣品分析物通過固定于固相支持物上的第一抗體結合， 此后第二抗體結合至分析物，從而形成不溶的三-部分復合物。參見例如美國專利號 No. 4，376，110。第二抗體本身可通過可檢測的結構部分標記(直接夾心測定)或可使用標 記有可檢測的結構部分的抗-免疫球蛋白抗體測量(間接夾心測定)。例如，一種類型的夾 心測定是ELISA測定，在該情形中可檢測的結構部分是酶。
對于免疫組化，例如組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可以埋入石蠟并通過防 腐劑(如福爾馬林)固定。在治療心血管、內皮和血管原性病癥中有用的組合物非限制性地包括抑制靶標基 因產物的表達和/或活性的抗體、小有機分子和無機分子、肽、磷酸肽、反義的、siRNA和核 酶分子、三股螺旋(triple-helix)分子等。潛在拮抗劑的更具體的實例包括結合TSPAN12或Norrin的多肽，特別是抗體，該 抗體非限制性地包括多克隆和單克隆抗體和抗體片段、單鏈抗體、抗獨特型抗體、和此類抗 體或片段的嵌合或人源化版本，以及人抗體和抗體片段。對于TSPAN12，某些胞外結構域 也可以作為拮抗劑(參見例如Ho等人J.Virol·(病毒學雜志)80(13) =6487-96(2006)； Hemler Nature Rev. Drug Discovery (自然綜述藥物發現)7 :747-58 Q008))。備選地， 潛在的拮抗劑可以是密切相關蛋白，例如，與共受體相互作用但沒有效應的突變形式的 TSPANl2或Norrin，由此競爭性抑制TSPAN12或Norrin的作用。另一種潛在的TSPANl2或Norrin拮抗劑是使用反義技術制備的反義RNA或DNA構 建體，其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶標mRNA雜交并防止蛋白質翻譯來起直接阻斷 mRNA翻譯的作用。反義技術可用于通過形成三股螺旋或者反義DNA或RNA來控制基因表達， 這兩種方法都以多核苷酸與DNA或RNA的結合為基礎。例如，編碼本文所述成熟TSPAN12 或Norrin多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分，可用于設計長度為約10-40個堿基對的反 義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設計成與參與轉錄的基因區域互補(三股螺旋-參見， Lee 等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)6 :3073 (1979) ；Cooney 等人，Science (科學)241 456(1988) ；Dervan 等人，Science (科學)251 1360 (1991))，從而阻止 TSPAN12 或 Norrin 的轉錄和生成。本文所述的與RNA —部分“互補的”序列是指，具有與RNA雜交形成穩定 雙鏈體的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸情況下，可以由此測試雙鏈體DNA的單鏈， 或者可以測試三股螺旋的形成。雜交能力取決于互補程度以及反義核酸的長度。通常，雜 交核酸越長，它含有的與RNA錯配的堿基越多，但仍可形成穩定的雙鏈體(或者三鏈體，視 情況而定)。本領域技術人員可以通過使用常規方法測定雜交復合物的解鏈溫度，來確定 錯配的耐受程度。反義RNA寡核苷酸在體內可與mRNA雜交，并阻斷所述mRNA分子翻譯成 TSPANl2 (反義-Okano,Neurochem.(神經化學)56 :560 (1991) :01iRodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑)(CRC Press :Boca Raton, FL, 1988)。反義寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA、或其嵌合混合物或衍生物 或改良形式。例如，為了改善分子穩定性、雜交等，所述寡核苷酸可以在堿基結構部分、糖 結構部分或磷酸骨架上進行修飾。所述寡核苷酸可以包括其它附加基團，例如肽(例 如，為了靶向體內宿主細胞受體)，或有助于穿過細胞膜的試劑(參見，例如，Letsinger, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國科學院院刊)86 :6553-6556 (1989) ；Lemaitre, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國科學院院刊)84 :648-652(1987) ；PCT 公開 W088/09810，1988年12月15日公開)或有助于穿過血腦屏障的試劑(參見，例如，1988年 4月25目公開的PCT公開號為W089/10134)，雜交-觸發的切割試劑(參見，例如，Krol等 人，BioiTechniques (生物技術)6 :958-976(1988))或嵌入劑(參見，例如，Zon，Pharm. Res. (藥物研究)5 :539-549(1988))。為此，可以將所述寡核苷酸與另一分子例如肽、雜交觸發的交聯劑、轉運劑、雜交-觸發的切割劑等偶聯。反義寡核苷酸可包括至少一種修飾的堿基結構部分，其選自包括但不限于下列基 團的組5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰 胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧 啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖Q核苷(β -D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺 苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、 5-甲基胞苷、N6-腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿 嘧啶、β -D-甘露糖基Q核苷(β -D-mannosylqueosine)、5’ -甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲 氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸(oxyacetic acid) (ν)、 wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2_硫代胞苷、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿 嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧 啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、仏叩3) 、和2，6-二氨基嘌呤。反義寡核苷酸另外還可以包含至少一種修飾的糖結構部分，其選自包括但不限于 下列基團的組阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。另一實施方案中，所述反義寡核苷酸包含至少一種修飾的磷酸酯骨架，其選自硫 代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代亞磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷 酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯，及其formacetal或類似物組成的組。另一實施方案中，所述反義寡核苷酸是一種異頭(anomeric)寡核苷酸。異頭 寡核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的單元不同，所述鏈是彼此平 行的(Gautier，等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)15 :6625-6641 (1987))。所述寡核 苷酸是一種2’ -0-甲基核糖核苷酸anoue，等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)15 6131-6148 (1987))，或一種嵌合的DNA-DNA類似物Qnoue,等人，FEBS Lett.(歐洲生化學 會聯盟通訊)215 =327-330 (1987))。在一些實施方案中，拮抗劑是抑制性雙鏈體RNA，例如siRNA，shRNA等。本發明的寡核苷酸可以用本領域已知的標準方法合成，例如，通過利用一種自動 DNA合成儀(例如可購自Biosearch, Applied Biosystems等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷 酸可以用Stein，等人(Nucl. Acids Res.(核酸研究)16 :3209(1988))所述的方法合成，甲 基膦酸酯寡核苷酸可以通過使用可控的有孔玻璃多聚體支持物(controlled pore glass polymer supports) (Sarin,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(美國科學院院刊)85 7448-7451(1988))等來制備。上述寡核苷酸還可以遞送至細胞，從而使反義RNA或DNA在體內表達以抑制 TSPAN12或Norrin的生成。當使用反義DNA時，優選源自翻譯起始位點的寡脫氧核糖核苷 酸，例如，位于靶基因核苷酸序列約第-10至+10位之間。潛在的拮抗劑還包括與TSPAN12或Norrin6結合的小分子，從而封閉其活性。小 分子的實例包括，但不限于，肽或肽-樣小分子，優選可溶性肽，和合成的非-肽基的有機或 無機化合物。另外的潛在拮抗劑是核酶，它是一種能催化RNA特異性切割的酶促RNA分子。核 酶通過與互補的靶RNA序列特異性雜交，然后內核分離(endonucleolytic cleavage)來起作用。潛在RNA靶標中的特異性核酶切割位點可以用已知技術鑒定。更多細節見，例如， Rossi，CurrentBiology (現代生物學)4 :469-471 (1994)，和 PCT
發明者葉蔚藍, 哈拉爾德·J·容格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司