脂質體莫匹羅星的制作方法

本公開內容涉及藥物遞送，特別地涉及脂質體藥物遞送。
背景技術：
：在下文列出被認為與目前公開的主題相關的作為背景的參考文獻：-McCormackB,GregoriadisG.1998.Drugs-in-cyclodextrins-in-liposomes:anapproachtocontrollingthefateofwaterinsolubledrugsinvivo.IntJPharm162:59–69-ClercS,BarenholzY.1995.Loadingofamphipathicweakacidsintoliposomesinresponsetotransmembranecalciumacetategradients.BiochimBiophysActa1240:257–265.-ZuckerD,MarcusD,BarenholzY,GoldblumA.2009.Liposomedrugs’loadingefficiency:aworkingmodelbasedonloadingconditionsanddrug'sphysicochemicalproperties.JControlRelease139:73–80-CernA,BarenholzY,TropshaA,GoldblumA.2014.Computer-aideddesignofliposomaldrugs:Insilicopredictionandexperimentalvalidationofdrugcandidatesforliposomalremoteloading.JControlRelease173:125-31-ZhouX,YungB,HuangY,LiH,HuX,XiangGLR.2012.Novelliposomalgefitinib(L-GEF)formulations.AnticancerRes32(7):2919–23-NobleWC.1991.Theusesandabusesofmupirocin.JAmAcadDermatol:3–5.-Cern,A.等人Quantitativestructure-propertyrelationshipmodelingofremoteliposomeloadingofdrugs.J.Control.Release160,147–157(2012)本文上文的參考文獻的承認不應被推斷為意指：這些參考文獻以任何方式與目前公開的主題的可專利性相關。背景為了使脂質體藥物在臨床上被使用，該脂質體藥物應當以每脂質體的高濃度被裝載。這是強制性要求，以便提供治療劑量。在大多數情況下，由于納米脂質體的極其小的體積(～1x10-19升)，藥物的遠程(主動)裝載是實現期望的藥物濃度的唯一方法。遠程裝載使用離子梯度作為用于使藥物(通常是兩親性弱酸或弱堿)到達預先形成的脂質體的驅動力。藥物遠程裝載需要足夠的藥物溶解度，對于不溶性藥物或具有低溶解度的那些藥物，“增溶劑”例如聚乙二醇(PEG)400、丙二醇(PG)、或環糊精例如羥丙基-β-環糊精(HPCD)可以在遠程裝載期間添加。迄今為止，環糊精用于增強脂質體裝載的用途已主要關于通過被動裝載所裝載的藥物進行研究[GregoriadisG.IntJPharm162:59–69,1998]。關于遠程裝載收集的大量數據已導致表征分子特性和實驗條件二者對藥物遠程裝載的影響的模型的開發[ZuckerD,MarcusD,BarenholzY,GoldblumA.2009.Liposomedrugs’loadingefficiency:aworkingmodelbasedonloadingconditionsanddrug'sphysicochemicalproperties.JControlRelease139:73–80]。所構建的定量結構性質關系(QSPR)模型(Cern,A.等人Quantitativestructure-propertyrelationshipmodelingofremoteliposomeloadingofdrugs.J.Control.Release160,147–157(2012))允許用于識別用于遠程脂質體裝載的良好候選物的藥物數據庫篩選[CernA,BarenholzY,TropshaA,GoldblumA.2014.Computer-aideddesignofliposomaldrugs:Insilicopredictionandexperimentalvalidationofdrugcandidatesforliposomalremoteloading.JControlRelease173:125–31]。識別為用于裝載至脂質體的良好候選物的藥物之一是莫匹羅星(9-[(E)-4-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-二羥基-5-[[(2S,3S)-3-[(2S,3S)-3-羥基丁-2-基]環氧乙烷-2-基]甲基]噁烷-2-基]-3-甲基丁-2-烯酰基]氧基壬酸)，即經由抑制異亮氨酰基tRNA合成酶起作用的抗生素。當被吸收至血流中或被腸胃外施用時，莫匹羅星迅速降解以形成非活性的單胞菌酸。因此，迄今，用莫匹羅星的治療受限于局部應用[NobleWC.1991.Theusesandabusesofmupirocin.JAmAcadDermatol:第1卷,第6期,第317-319頁]。另外，描述了HPCD在通過將其包含在含有硫酸銨且被動地裝載有吉非替尼的聚乙二醇化的納米脂質體的脂質體內水相中的裝載方面的影響。Zhou等人(AnticancerRes32(7):2919–232012)如下制備脂質體(抄錄自論文中的方法部分)：“將EPC或HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE(55/40/5mol/mol)的混合物和吉非替尼以20:1的脂質與藥物的重量比溶解在氯仿中并且隨后在35℃下蒸發以形成薄膜。得到的脂質膜用PBS(pH7.4)、0.3M(NH4)2SO4溶液或0.3M(NH4)2SO4加上0.1MHPβCD再水化，并且在室溫下溫育持續30min”。一般描述根據本公開內容的第一方面，本公開內容提供了脂質體，所述脂質體包含脂質膜和脂質體內區室，所述脂質體內區室封裝莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子，所述脂質體在其全身施用至需要所述效果的受試者之后提供治療效果。在某些實施方案中，脂質體內區室還包含抗衡陽離子(抗衡所述pH依賴性的可電離陰離子并且是如以下在本文中進一步定義的高度水混溶性鹽的一部分)。在某些實施例中，脂質體具有一定量的莫匹羅星(例如通過其與脂質的摩爾比定義的)和一定量的至少一種環糊精化合物(還例如通過其與脂質的摩爾比定義的)，所述量足以在向受試者全身施用脂質體之后提供治療效果。本文中公開的脂質體是穩定的脂質體。在某些實施例中，穩定性可以在4℃的儲存下保持在生理學上可接受的介質內時確定，在儲存持續至少一個月的時期之后，不超過20％的莫匹羅星被釋放至介質。本公開內容還提供了脂質體，所述脂質體包含脂質膜和脂質體內區室，所述脂質體內區室封裝莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子，所述脂質體用于在用于用所述莫匹羅星全身治療受試者的方法中使用。本公開內容還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含適合于全身施用的生理學上可接受的載體和在該載體內的脂質體，該脂質體包含脂質膜和脂質體內區室，所述脂質體內區室包含莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子。還進一步地，本公開內容提供了一種用莫匹羅星治療受試者(例如，患有感染的受試者)的方法，該方法包括全身施用包含脂質膜和脂質體內區室的脂質體，所述脂質體內區室封裝莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子。附圖簡述為了更好地理解本文公開的主題并且為了例示主題可以如何在實踐中實施，現在將參照附圖通過僅非限制性實施例的方式描述實施例，在附圖中：圖1呈現作為初始D/L摩爾比和溫育溶液含量的函數的至乙酸鈣脂質體中的莫匹羅星裝載(最終的藥物與脂質(D/L)的摩爾比)。(平均值±SE，n＝2)。圖2呈現作為初始D/L摩爾比和溫育溶液組成的函數的至包含HPCD的乙酸鈣脂質體(CA-HPCD-脂質體)中的莫匹羅星裝載。(平均值±SE，n＝2)。圖3A-3B呈現作為所使用的初始D/L摩爾比的函數的從磷酸鹽緩沖液至具有不同的脂質體內水相的脂質體的莫匹羅星裝載，HPCD-脂質體、乙酸鈣-脂質體“CA-脂質體”或HPCD+乙酸鈣脂質體“HPCD-CA-脂質體”(圖3A)或乙酸鈣-脂質體“CA-脂質體”、HPCD+乙酸鈣脂質體“HPCD-CA-脂質體”、乙酸鈉-脂質體“SA-脂質體”、或HPCD+乙酸鈉脂質體“HPCD-SA-脂質體”(圖3B)。(平均值±SE，n＝2)。圖4呈現在37℃下溫育不同的脂質體(HPCD-脂質體、乙酸鈣-脂質體“CA-脂質體”或HPCD+乙酸鈣脂質體“CA-HPCD-脂質體”)1h之后在脂質體中所保留的％莫匹羅星。圖5呈現來自乙酸鈣-HPCD脂質體(“CA-HPCD-脂質體”)的隨著時間在鹽水和血清中的％保留的脂質體莫匹羅星，其中每個時間點代表通過在瓊脂糖柱上收集23個級分所獲得的脂質體面積比，如在方法部分中描述的(P＝0.04，通過ANOVA計算:無重復的兩個因素)。圖6A-6D呈現包含莫匹羅星的乙酸鈣脂質體和乙酸鈣-HPCD脂質體(分別地，圖6A和圖6B)相對于不包含藥物的乙酸鈣脂質體和乙酸鈣-HPCD脂質體(分別地，圖6C和圖6D)的低溫-TEM圖像。圖7A-7B是在具有乙酸鈣的磷酸鹽緩沖液中的藥物溶液(圖7A)和包含15％HPCD的具有乙酸鈣的藥物溶液(圖7B)的1:1混合物的熱譜圖。圖8A-8B是乙酸鈣-脂質體(圖8A)和乙酸鈣-HPCD-脂質體(圖8B)的熱譜圖。圖9A-8B是裝載有莫匹羅星的乙酸鈣-脂質體(圖9A)和裝載有莫匹羅星的乙酸鈣-HPCD-脂質體(圖9B)的熱譜圖。圖10呈現在細菌挑戰之后隨著時間的跨越治療組的平均小鼠重量；圖11A-11D是在細菌挑戰之后48h的未治療的小鼠(圖11A-11B)和經脂質體莫匹羅星治療的小鼠(圖11C和圖11D)的外觀。詳細描述通過本發明解決的問題涉及全身遞送莫匹羅星(9-[(E)-4-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-二羥基-5-[[(2S,3S)-3-[(2S,3S)-3-羥基丁-2-基]環氧乙烷-2-基]甲基]噁烷-2-基]-3-甲基丁-2-烯酰基]氧基壬酸)，莫匹羅星具有化學式：已知莫匹羅星在血流中迅速地降解并且證明了與血漿蛋白質的高結合，從而致使其用途被限制且受限于僅局部應用。莫匹羅星針對革蘭氏陽性細菌在體外是活性的，革蘭氏陽性細菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和肺炎鏈球菌，二者均被疾病控制中心(CDC)視作嚴重威脅。在敏感的革蘭氏陰性細菌中，莫匹羅星針對被CDC視作緊急威脅的奈瑟氏淋球菌(0.05μg/ml的MIC)是活性的。莫匹羅星的作用模式不同于其他可用的抗生素的作用模式(異亮氨酸tRNA合成酶的抑制)，并且因此，與其他抗生素的交叉耐藥性不被預期，使得該藥物對于全身遞送是特別感興趣的。因此，存在對臨床上可接受的用于全身施用該藥物的制劑的需求。為此，如本文中所公開的，莫匹羅星的脂質體制劑被開發。存在許多先決條件，以便實現用于全身遞送的基于脂質體的臨床上可行的制劑。一個先決條件是實現足夠水平的藥物裝載；第二個先決條件是將藥物保持在脂質體中同時在血液中循環；第三個先決條件是以足以產生期望的治療功效的速率和水平在靶部位處釋放藥物；并且第四個先決條件是在保存期穩定性方面實現藥學上被接受的產品。莫匹羅星的脂質體制劑(納米莫匹羅星)可以使其通過全身施用的應用成為可能，因為封裝在脂質體內水相中將保護莫匹羅星免于在血液循環中降解并且使其能夠利用在細菌感染的組織中的增強的滲透和滯留(EPR)效應被動靶向至受感染的組織[Azzopardi,E.a,Ferguson,E.L.&Thomas,D.W.Theenhancedpermeabilityretentioneffect:anewparadigmfordrugtargetingininfection.J.Antimicrob.Chemother.68,257–74(2013)]。然而，為了使這樣的制劑是有效的，除在感染部位處的積累之外，脂質體還應當呈現出莫匹羅星在疾病部位中的控制的緩慢釋放。關于莫匹羅星，另外的挑戰涉及其溶解度，因為莫匹羅星在水性介質中僅是略可溶的并且溶解度是pH依賴性的。如將在以下實施例中示出的，在pH6.3的磷酸鹽緩沖液中，莫匹羅星具有約28mM的溶解度并且該濃度僅在劇烈攪拌和聲處理之后實現。因此，已作出嘗試以使用各種增溶劑增大藥物溶解度。結果證明，在聚乙二醇(PEG)400、丙二醇(PG)和環糊精羥丙基-β-環糊精(HPCD)用作增溶劑的情況下，溶解度增大。然而，意外地，當嘗試將這些增溶劑并入(通過遠程裝載)用于將莫匹羅星裝載至脂質體中的溫育溶液中時，所獲得的脂質體制劑示出在血清中的非常迅速的藥物釋放，這使它們不適合于臨床使用。此外，當藥物從pH6.3的磷酸鹽緩沖液裝載或包含作為增溶劑的PEG400時，藥物至脂質體中的裝載具有鐘形行為。從PG溶液和HPCD溶液的裝載圖案不是鐘形的。然而，從HPCD溶液的裝載取決于HPCD濃度。HPCD(1％)示出略微較高的裝載比(loadedratio)，但示出相似的鐘形裝載曲線。較高的HPCD濃度(2.5％–10％)隨著初始比率的增大而示出裝載比的恒定增大，并且不導致鐘形圖案。然而，裝載比對于2.5％HPCD是較高的，并且隨著HPCD的增大的濃度(5％和10％)而降低；高的HPCD濃度看起來抑制裝載。當所獲得的脂質體制劑關于該制劑的釋放曲線被測試時，發現的是，這些制劑在血清的存在下示出非常迅速的釋放，這可能不適合于臨床使用。盡管如此，本發明人已成功地開發了滿足所有先決條件的脂質體制劑，即，具有高的藥物/脂質比率、長的血液循環時間、藥物從裝載的脂質體中的緩慢釋放、長的保存期的脂質體，并且最重要地，開發了示出優越的治療功效且適合于全身臨床使用的制劑。具體地，基于發明人的開發，本公開內容提供包含脂質體內區室的脂質體，該脂質體內區室封裝莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子。如在本文中將示出的，莫匹羅星和至少一種環糊精化合物在脂質體中的量足以在向受試者全身施用脂質體之后提供治療效果。封裝莫匹羅星的脂質體可以具有任何形式或大小。在某些實施例中，脂質體是多層囊泡或寡層囊泡。在某些實施例中，脂質體是多囊囊泡。在某些其他實施例中，脂質體是單層囊泡。脂質體可以是小的、中等的、大的或甚至巨大的。當提到小的脂質體時，應理解為具有在約20nm-100nm之間的范圍內的平均大小；當提到中等大小的脂質體時，應理解為具有在約100nm-200nm之間的范圍內的平均大小；當提到大的脂質體時，應理解為具有高于約200nm的平均大小；并且當提到巨大的脂質體(通常是巨大的單層囊泡或多囊囊泡)時，應理解為指的是大于1μm的脂質體。在某些實施例中，脂質體是小單層囊泡(SUV)。在某些實施例中，SUV具有在20nm至100nm之間、有時在20nm至100nm之間、還有時在40nm至100nm之間或50nm至100nm之間的大小分布。在某些實施例中，脂質體具有在60nm至90nm之間、有時在70nm至80nm之間、并且有時約77±5.0nm的平均大小。脂質體被發現是穩定的。實際上，已發現，當在生理學上可接受的介質內時，封裝莫匹羅星的脂質體在于4℃的儲存條件下是顯著地穩定的。當在本文所公開的上下文中提到穩定性時，應理解，在儲存(在4℃下)持續至少一個月之后，與初始裝載的藥物相比，不多于20％、有時不多于10％的莫匹羅星將被釋放至儲存介質。在某些實施例中，脂質體的穩定性通過以下事實來表征：在于4℃下儲存至少3個月之后，不多于10％的莫匹羅星在儲存期間被釋放至周圍介質。在某些實施例中，脂質體的穩定性通過以下事實來表征：在于4℃下儲存至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、12個月、和甚至24個月之后，不多于10％的莫匹羅星被釋放至周圍介質。穩定性通過在儲存條件(4℃，在緩沖液中)下的化學穩定性和物理穩定性中的一個或兩個來確定。在該上下文中，化學穩定性可以被檢驗，尤其，通過以下參數中的一種或更多種：a)分散體pH的測量(pH計)；b)磷脂(PL)酰基酯水解，其通過在PL水解之后釋放的未酯化(游離)脂肪酸(NEFA)的變化來確定[Barenholz等人FromLiposomes:apracticalapproach,第2版,RRCNew編輯,IRLPressOxford,1997]或通過薄層色譜法(TLC)來確定[Barenholz,Y.和Amsalem,S.In:LiposomeTechnology第2版,G.Gregoriadis(編輯)CRCPress,BocaRaton,1993,第1卷,第527-616頁]。脂質組合體的物理穩定性可以被檢驗，尤其，通過以下參數中的一種或更多種：a)通過動態光散射(DLS)的組合體大小分布。b)游離的(未締合的/未聚集的)組分的水平。c)ζ-電勢。脂質體先驗地用至少一種脂質體形成脂質來制備。在本發明的上下文中，術語“脂質體形成脂質”主要表示在水中形成為囊泡的甘油磷脂或鞘磷脂，囊泡例如脂質體，但不限于此，如下文進一步討論的。脂質體然后尤其通過每種組分相對于脂質體形成脂質的比率來表征。此類組分包括藥物即莫匹羅星、至少一種CD、和pH依賴性的可電離陰離子以及相對其的抗衡離子(例如，乙酸鈣或乙酸鈉)。CD化合物被識別為由(α-1,4)-連接的α-D-吡喃葡萄糖單元組成的環狀低聚糖并且包含親脂性中央空腔和親水性外表面。在本公開內容的上下文中，CD可以是天然存在的CD，以及天然存在的CD的衍生物。天然的CD包括分別由六個、七個和八個吡喃葡萄糖單元組成的α-、β-、或γ-環糊精(αCD、βCD或γCD)。當提到天然CD的衍生物時，應理解為具有親脂性中央空腔和親水性外表面的由(α-1,4)-連接的α-D-吡喃葡萄糖單元組成的任何環狀低聚糖。在某些實施例中，CD是2-羥丙基-β-環糊精(HPβCD)。在某些實施例中，CD是2-羥丙基-γ-環糊精(HPγCD)。在某些實施例中，CD是磺丁基醚(SBE)環糊精。在一個優選的實施例中，CD是HPβCD。在某些實施例中，HPβCD與至少一種另外的增溶劑例如另外的CD或類似丙二醇的助溶劑組合。本文中公開的脂質體包含一定量的CD，該CD的量甚至當存在血清時仍足以允許莫匹羅星在脂質體內的穩定性。不受理論束縛，據相信，HPCD以影響藥物從脂質體中滲漏的方式、可能通過絡合與莫匹羅星相互反應。這可以從本文中呈現的DSC圖像來推斷(圖9A和圖9B)，其中與在不存在HPCD下的78.447的相應的熔化溫度相比，包含HPCD的脂質體呈現出對于非脂質組分的81.307的熔點的變化(脂質具有約50℃的熔點)。此外，本文中呈現的低溫-TEM圖像示出，封裝莫匹羅星連同HPCD和作為抗衡離子的鈣的脂質體不具有在它們內部的可觀察到的藥物晶體。盡管如此，存在莫匹羅星的非常高的脂質體內濃度，該脂質體內濃度超過莫匹羅星的溶解度極限。在乙酸鈣200mMpH5.5中的莫匹羅星溶解度被發現為低于2mg/ml。在介質中的HPCD(15％)將使其溶解度增大至不多于10倍。然而，莫匹羅星的脂質體內濃度被發現為在88-108mg/ml的范圍內。莫匹羅星的脂質體內濃度通過確定脂質體內水體積來計算，該脂質體內水體積如從通過電感耦合等離子體(ICP)測量的脂質體內Ca離子水平來確定(A.Montaser和D.W.Golightly,編輯(1992).InductivelyCoupledPlasmasinAnalyticalAtomicSpectrometry.VCHPublishers,Inc.,NewYork,)。發現對于40mM脂質濃度的脂質體內鈣濃度是296mg/L，在用于脂質體制備的溶液中的鈣濃度是5812mg/L。除以這兩個值是脂質體內體積在制劑中的分數(5.09％)，對應于每μmol脂質1.27μl。(對于用以確定捕獲體積的方法，見由R.R.C.New.編輯的Liposomes:apracticalapproach.ThePracticalApproachSeries(Book58),OxfordUniversityPress,1990)。如下文詳細描述的，已發現，在脂質體內包含莫匹羅星的抗衡離子增大脂質體的穩定性，以及脂質體在血液中的循環時間。具體地，已發現，與沒有CD的脂質體或沒有鈣抗衡離子的脂質體相比，封裝莫匹羅星和除CD之外還有乙酸鈣的脂質體(為了提供CA-HPCD-脂質體)在鹽水和血清中相對于藥物滲漏和釋放速率是穩定的。具體地，已發現，與莫匹羅星從HPCD-脂質體(不包含乙酸鈣)中的釋放(在1小時之后73％)和從無HPCD的乙酸鈣脂質體中的釋放(在1h內釋放82％)相比，乙酸鈣-HPCD脂質體在血清中釋放莫匹羅星緩慢得多(在1小時之后17-22％)。這些發現支持以下的理解：由包含HPCD和抗衡離子梯度例如乙酸鈣梯度或乙酸鈉梯度的組合的介質制備的脂質體對于建立用于全身遞送的臨床上合適的脂質體是至關重要的。當提到“pH依賴性的可電離陰離子”時，應理解為在合適的pH條件下帶電荷的任何鹽衍生的陰離子。因此，應理解，陰離子當在脂質體中時可以實際上呈非離子化的形式，使得當陰離子呈離子化的形式時，它被保留在脂質體中，并且當呈非離子形式時，它將穿過脂質膜并且從脂質體的脂質體內芯中滲漏出。這將取決于內部pH，即，在脂質體內區室內的pH。鹽是具有高溶解度(至少250mM)的鹽，其中陰離子是具有高于3.5的pKa和在pH7下在約-2.5與約1.5之間的范圍內、優選地在約-1.5與約1.0之間的范圍內的logD的陰離子。在某些實施例中，pH依賴性的可電離陰離子選自由乙酸根、苯甲酸根、甲酸根組成的組。在某些實施例中，陰離子是有機陰離子，例如膽堿。在一個特定實施例中，陰離子是乙酸根。在鹽內的陽離子在脂質體內充當莫匹羅星的抗衡離子。作為弱的兩親性酸，合適的抗衡陽離子可以是有機陽離子以及無機陽離子。在某些實施例中，抗衡陽離子選自由鈣、鎂和鈉組成的組。在某些實施例中，陽離子抗衡pH依賴性的可電離陰離子、優選地具有非常低的滲透系數、優選地<10-11的乙酸根(其通常是用于將莫匹羅星遠程裝載至脂質體中的驅動力)。在某些其他實施例中，抗衡陽離子包括陽離子聚合物。陽離子聚合物的非限制性實例包括右旋糖酐精胺、右旋糖酐亞精胺、氨乙基右旋糖酐、三甲基銨右旋糖酐、二乙基氨乙基右旋糖酐、聚亞乙基亞胺右旋糖酐以及類似物。在某些特定實施例中，抗衡陽離子是鈣。在某些實施例中，鈣離子衍生自甲酸鈣、乙酸鈣和苯甲酸鈣中的任一種。在某些其他實施例中，抗衡陽離子是鈉，例如衍生自乙酸鈉、甲酸鈉和苯甲酸鈉的鈉。在某些實施例中，脂質體包括乙酸鈣或乙酸鈉。脂質體可以通過每種組分在脂質體制劑中的量來表征。用于表達脂質體組成的更加可接受的方式是通過在各個組分與脂質體形成脂質(形成脂質體膜的脂質)之間的摩爾比。為了確定摩爾比，每種組分在脂質體制劑中的絕對量被首先確定，這通過本領域任何技術人員已知的常規技術來實現。該量然后被轉變成摩爾數，并且計算與脂質體形成脂質的摩爾數的摩爾比。在某些實施例中，至少一種CD與脂質的摩爾比是在0.05-2.5之間，有時，在0.1至2之間。在某些實施例中，至少一種CD與脂質之間的摩爾比是0.15±0.03。至少一種CD在脂質體區室內的濃度還可以被定義(如在以下非限制性實例中示出的)并且用于表征脂質體。在某些實施例中，至少一種CD在脂質體內水相中的濃度是至少約100mg/ml(對應于73mM)；有時，至少125mg/ml(90mM)。在某些實施例中，至少一種CD的濃度是至多200mg/ml(145mM)，有時，至多175mg/ml(241mM)。在還某些實施例中，至少一種CD的濃度是在120mg/ml至180mg/ml(87mM)的范圍內。在某些實施例中，至少一種CD的濃度是約150mg/ml±10mg/ml(約109mM)。在某些實施例中，離子(陽離子或陰離子)與脂質之間的摩爾比是在約0.1至約0.5之間，有時在約0.2至0.4之間，還有時，摩爾比是約0.3±0.05。另外，離子例如陽離子(例如鈣和鈉)或陰離子(例如，乙酸根)的濃度可以用于表征其脂質體內部區室含量。在某些實施例中，離子源(例如，來自乙酸鈣的鈣和來自乙酸鈉的鈉)的濃度是至少100mM，有時150mM。在某些實施例中，離子源(例如乙酸鈣和乙酸鈉)的濃度是至多300mM，有時至多250mM、或至多225mM。在某些實施例中，離子的濃度是約200mM。在該特定情況下，相對于藥物自身，莫匹羅星，其截留于脂質體中的量是特別重要的，因為該量是用于臨床上可接受的脂質體制劑的先決條件之一。為了評估藥物截留，藥物與脂質的比率被確定并且與初始比率(在封裝之前)進行比較。為此，藥物裝載的脂質體通常被純化以在藥物裝載之后除去未封裝的藥物。然后，在脂質體中的藥物的量和脂質的量通過常規方法來確定。基于所確定的藥物和脂質的量，各個參數是可確定的并且對于表征脂質體是重要的：“載藥量”，其是每克或每摩爾的脂質中的藥物的克數和摩爾數；以及“截留效率”，其被表示為作為初始預裝載比的函數的封裝的藥物的百分比；以及“藥物與脂質的摩爾比”，其是在除去未封裝的藥物之后的每摩爾的脂質中的藥物的摩爾數。莫匹羅星在脂質體中的量可以使用商業色譜技術來確定。在某些實施例中，莫匹羅星的濃度基于美國藥典(USP)35.Mupirocinofficialmonograph.；:3962–3]、使用高效液相色譜(HPLC)/UV法來確定。為了計算莫匹羅星的脂質體內濃度，人們還需要水性脂質體內捕獲體積，該體積可以由脂質體內鈣濃度(之前描述的)來計算。在制劑中的莫匹羅星脂質體濃度通過HPLC方法來確定。該濃度除以脂質體內捕獲體積將得到脂質體內莫匹羅星濃度(詳見實施例)。在某些實施例中，載藥量是在2-10mg/ml的脂質體分散體的范圍內。在某些實施例中，載藥量是至少2mg/ml、有時至少3mg/ml、有時至少4mg/ml、有時至少5mg/ml、有時至少6mg/ml、有時至少7mg/ml、有時至少8mg/ml。在某些實施例中，載藥量是有時至多10mg/ml、有時至多9mg/ml、有時至多8mg/ml、有時至多7mg/ml、有時至多6mg/ml。在某些實施例中，藥物與脂質的摩爾比被確定。在某些實施例中，莫匹羅星/脂質的摩爾比是在0.1至1.0之間、有時至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.7、或至少0.8、或至少0.9、或至少1.0。在某些實施例中，摩爾比是至多1.0、或至多0.9、或至多0.8、或至多0.7、或至多0.6、或至多0.5、或至多0.4、或至多0.3。在某些實施例中，摩爾比是在0.2至0.4之間。關于脂質體形成脂質，當提到甘油磷脂時，應理解為具有甘油骨架的脂質，其中在頭部基團處的羥基中的至少一個、優選地兩個被酰基鏈、烷基鏈或烯基鏈、磷酸基中的一種或兩種、或上文任何的組合、和/或其衍生物取代，并且在頭部基團處可以包含化學反應基團(例如，胺、酸、酯、醛或醇)，從而提供具有極性頭部基團的脂質。鞘磷脂由具有附接至位置1的磷酰膽堿部分的神經酰胺單元組成，并且因此實際上是N-酰基鞘氨醇。在鞘磷脂中的磷酰膽堿部分貢獻鞘磷脂的極性頭部基團。在脂質體形成脂質中，酰基鏈、烷基鏈或烯基鏈在長度上通常是在14個至約24個碳原子之間，并且作為全部地氫化、部分地氫化或未氫化的天然存在的脂質、半合成的或全合成的脂質，具有不同的飽和度，并且飽和的水平可能影響由此形成的脂質體的剛性(通常地，具有飽和鏈的脂質比其中存在不飽和鏈、尤其具有順氏雙鍵的相同鏈長度的脂質更剛性)。在某些實施例中，脂質體包含單一類型的脂質體形成脂質或脂質體形成脂質的組合。在某些實施例中，脂質體形成脂質是磷脂。當脂質體形成脂質是磷脂時，其在脂質體中的量可以通過修改的Bartlett法作為有機磷來確定[ShmeedaH,Even-ChenS,HonenR,CohenR,WeintraubC,BarenholzY.2003.Enzymaticassaysforqualitycontrolandpharmacokineticsofliposomeformulations:comparisonwithnonenzymaticconventionalmethodologies.MethodsEnzymol367:272–92]。在某些實施例中，脂質體形成脂質是膽堿型磷脂例如二酰基甘油-磷酰膽堿(酰基鏈、烷基鏈或烯基鏈為如上文所定義的)。在某些其他實施例中，脂質體形成脂質是二-月桂酰基-sn-甘油-2-磷酰膽堿(DLPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DMPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DPPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DPPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二(十七烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DSPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二(十九烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DBPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二(二十一碳四烯酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿(1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二(二十二烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿、1,2-二(二十三烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二(二十四烷酰基)-sn-甘油-3-磷酰膽堿。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1-棕櫚酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(PSPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1-硬脂酰基-2-棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(SPPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質是1,2-二-油酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DOPC)或二-月桂酰基-sn-甘油-2-磷酰膽堿(DLPC)。在某些實施例中，脂質體形成脂質包括至少氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)。在一個優選的實施方案中，脂質體形成脂質包括氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)或由氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)組成。在某些實施例中，脂質體包括固醇，例如膽固醇。在某些實施例中，脂質體包括脂質聚合物。脂質聚合物包括在它們的頭部基團處被聚合物部分(PEG)改性的脂質，該聚合物部分(PEG)具有等于或高于750Da的分子量。頭部基團可以是極性的或非極性的，大的(>750Da)柔性親水性聚合物被附接至該頭部基團。親水性聚合物頭部基團至脂質區域的附接可以是共價附接或非共價附接，然而優選地經由共價鍵的形成(任選地，經由連接基)。雖然改性成脂質聚合物的脂質可以是中性的、帶負電荷的以及帶正電荷的，即，對于具體的電荷(或無電荷)沒有限制。例如，中性二硬脂酰基甘油和帶負電荷的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，二者均共價地附接至Mw750、2000、5000或12000的甲氧基聚(乙二醇)(mPEG或PEG)[PrievA等人Langmuir18,612-617(2002)；GarbuzenkoO.,ChemPhysLipids135,117-129(2005)；M.C.WoodleandDDLasicBiochim..Biohys.Acta,113,171-199.1992]。衍生化成脂質聚合物的最常用的且可商購的脂質是基于磷脂酰基乙醇胺(PE)、通常是二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(DSPE)的脂質。本發明采用的脂質聚合物的具體家族包括甲氧基PEG-DSPE(具有不同長度的PEG鏈)，其中PEG聚合物經由氨基甲酸酯連接被連接至DSPE伯氨基。PEG部分優選地具有從約750Da至約20,000Da的頭部基團的分子量。更優選地，分子量是從約750Da至約12,000Da并且最優選地在約1,000Da至約5,000Da之間。本文中采用的一個具體的PEG-DSPE是其中PEG具有2000Da的分子量的PEG-DSPE，本文中指定為2000PEG-DSPE或2kPEG-DSPE(M.C.Woodle和DDLasicBiochim.Biohys.Acta,113,171-199.1992)。在本公開內容的上下文中的一個特定的實施方案涉及脂質體，該脂質體包含至少氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](2kPEG-DSPE)和膽固醇的脂質聚合物。在某些實施例中，脂質體膜包含至少脂質體形成脂質(其可以是此類脂質中的一種或組合)、固醇和脂質聚合物。這些組分之間的摩爾比可以改變。在某些實施例中，脂質體膜包含在1摩爾％至10摩爾％脂質聚合物。有時，脂質體膜包含至少1摩爾％脂質聚合物；有時，至少2摩爾％脂質聚合物；有時，至少3摩爾％脂質聚合物；有時，至少4摩爾％脂質聚合物；有時，至少5摩爾％脂質聚合物；有時，至少6摩爾％脂質聚合物；有時，至少7摩爾％脂質聚合物；有時，至少8摩爾％脂質聚合物。有時，脂質體膜包含至多8摩爾％脂質聚合物；有時，至多7摩爾％脂質聚合物；至多6摩爾％脂質聚合物；至多5摩爾％脂質聚合物；至多4摩爾％脂質聚合物；至多3摩爾％脂質聚合物；至多2摩爾％脂質聚合物。在某些實施例中，脂質體膜包括氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和mPEG-DSPE。當使用組分的這種組合時，一個特定的摩爾比包括約55:40:5的HSPC:膽固醇:mPEG-DSPE的氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和mPEG-DSPE的摩爾比。在脂質體的脂質體內區室中包含莫匹羅星、至少一種環糊精化合物和pH依賴性的可電離陰離子的脂質體，通過將莫匹羅星遠程裝載至封裝至少一種CD和陰離子的脂質體的脂質體內水相中來制備。這些脂質體在本文中被稱作脂質體的“第一群體”。具體地，脂質體的第一群體被制備并且這些包括至少一種CD和pH依賴性的可電離陰離子。一般地，因為pH依賴性的可電離陰離子被設置有與其配對的抗衡陽離子，所以配對的陽離子也是存在的。例如，當陰離子是乙酸根時，本領域技術人員將理解到，鈣或鈉也可以存在，作為配對的乙酸鈣或乙酸鈉的一部分。在某些實施例中，脂質體的第一群體通過遠程裝載有緩沖溶液來制備，該緩沖溶液包含至少pH依賴性的可電離陰離子和至少一種CD(跨膜的乙酸根梯度)。本發明人已驚人地發現，將HPCD添加在脂質體內水相中減緩在血清中的莫匹羅星滲漏。在無HPCD的情況下，當在血清的存在下溫育時，藥物滲漏是非常迅速的并且實際上大多數藥物滲漏至血清中。不受理論束縛，本發明人相信，CD與莫匹羅星相互反應以使后者在脂質體中穩定化。在某些更具體的實施例中，制備脂質體的第一群體的方法包括再水化，再水化通過用包含期望的高度可混溶的鹽(包括pH依賴性的可電離陰離子和相對其的抗衡離子)的緩沖溶液攪拌(優選地，在高于環境溫度但低于100℃的溫度下)待被包括在脂質膜中的脂質例如脂質體形成脂質、膽固醇、脂質聚合物，和期望量的至少一種CD(脂質和CD共同地被稱作混合物)，從而形成脂質體。然后，如果必要或期望，則脂質體被減小尺寸。減小尺寸可以通過擠出和/或通過對本領域技術人員已知的任何其他手段進行。在某些實施例中，在用于再水化的緩沖液中的CD重量比是至少1％，有時至少5％,有時至少10％，有時至少15％，有時至少20％，有時至少25％，有時至少30％，有時至少35％，有時至少40％，并且有時多達其溶解度的極限，即至少45％(最大CD溶解度)。在某些實施例中，在通過緩沖溶液再水化之前在混合物中的CD重量比是至多45％，有時至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％。在某些實施例中，脂質體的第一群體然后針對通常認知的且安全的(GRAS)、非電解質的緩沖溶液來滲析，該緩沖溶液將不滲透脂質體雙層并且接近于與血液等滲。非電解質溶液的實例包括糖溶液，例如，右旋糖、葡萄糖、蔗糖，但不限于此。在某些特定的實施例中，滲析是針對蔗糖溶液。在某些實施例中，滲析是針對包含10％±1蔗糖的溶液。由此形成的脂質體的第一群體然后裝載有莫匹羅星。在某些實施例中，莫匹羅星至脂質體的第一群體的裝載包括遠程裝載。在某些實施例中，遠程裝載通過用包含莫匹羅星的緩沖溶液溫育第一群體來進行。在某些實施例中，用于裝載的保持莫匹羅星的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖液。莫匹羅星的裝載可以以任何脂質體(在形成脂質體的第一群體的脂質體分散體中)與莫匹羅星的比率用包含莫匹羅星的溶液。在某些實施例中，用于裝載的脂質體與莫匹羅星的比率通過在約1:0.5至1:2.0之間的體積比來定義。在某些實施例中，在脂質體與莫匹羅星溶液之間的體積比是約1:1。在某些實施例中，包含莫匹羅星的緩沖溶液還包含至少一種CD。根據某些實施例，緩沖溶液包含在1％至15％之間的至少一種CD。在某些實施例中，緩沖溶液包含在2％至5％之間的至少一種CD。在某些實施例中，用于裝載莫匹羅星的緩沖溶液可以包含其他賦形劑。例如，緩沖溶液可以包含，除至少一種CD之外的一種或更多種增溶劑，例如PG和/或PEG。根據某些實施例，由此形成的脂質體的第二群體是SUV，該SUV包含在上文和下文中討論的、被封裝在脂質體內水性芯中的莫匹羅星、至少一種CD和pH依賴性的可電離陰離子。如在非限制性實施例中示出的，至CA-HPCD脂質體的裝載高于至其他類型的脂質體例如乙酸鈣脂質體的裝載。此外，當使用CA-HPCD脂質體時，關于從具有其他增溶劑例如PEG400的磷酸鹽緩沖液中裝載所獲得的鐘形圖案消失。為了評估裝載不被HPCD單獨地驅動，無乙酸鈣梯度的對照HPCD脂質體被制備。至這些脂質體的裝載低得多并且達到0.1的最大的裝載D/L值。此外，本文中呈現的非限制性實施例示出，本文中公開的脂質體(在實施例中的CA-HPCD脂質體)比其他脂質體制劑遠遠更慢地在血清中釋放莫匹羅星(在1h之后17-22％)。不受理論束縛，據相信，釋放通過將莫匹羅星保護在包絡物中來抑制，這通過脂質體內部的HPCD來實現。如在非限制性實施例中進一步示出的，從對照-HPCD脂質體中釋放比從乙酸鈣-HPCD脂質體更迅速(在血清中1h之后73％)。從無HPCD的乙酸鈣脂質體中釋放是略微較高的(在1h內釋放82％)，這指示HPCD與乙酸鈣梯度的組合對于該目的是重要的。本公開內容還提供了一種藥物組合物，其包含適合于全身施用的生理學上可接受的載體和如上文所定義的脂質體。在本發明的上下文中，生理學上可接受的載體表示可用于制備藥物組合物的任何載體，該載體通常是安全的、無毒的且在生物學或其他方面都不是不合意的。在某些實施例中，生理學上可接受的載體是適合于全身施用的水基溶液。在某些實施例中，適合于全身(或腸胃外)施用的生理學上可接受的載體包括水性的和非水性的、等滲無菌注射溶液/輸注溶液，所述溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及致使制劑與被意圖的接受者的血液等滲的溶質。在某些實施例中，載體是鹽水、緩沖溶液、水性糖溶液(右旋糖、蔗糖等等)等等中的任一種或組合。在某些實施例中，載體還可以包括增稠劑、穩定劑和防腐劑。在某些實施例中，生理學上可接受的載體包括緩沖劑。在還某些實施例中，緩沖劑包括或是磷酸鹽緩沖液。在某些實施例中，生理學上可接受的載體包括糖。在某些實施例中，糖選自由右旋糖、葡萄糖和蔗糖組成的組。糖的量可以例如取決于組合物的稀釋而改變。然而，在某些實施例中，糖的量基于其與脂質體形成脂質的摩爾比來確定/定義。在某些實施例中，糖與脂質的比率是在約3至6之間，有時在約3.5至5之間。在某些實施例中，摩爾比是約4±0.5。在某些實施例中，糖是蔗糖并且蔗糖與脂質的比率是4±0.5。莫匹羅星和至少一種環糊精化合物在脂質體中的量被設計成足以在全身施用莫匹羅星之后向受試者提供治療效果。在全身施用之后足以或有效地實現治療效果的量應被理解為包括至少一種治療效果，該至少一種治療效果已知通過莫匹羅星來實現或與莫匹羅星相關。不限于此，治療效果可以是減輕或消除感染。在某些實施例中，治療效果可以與減少經治療的受試者中的微生物(細菌、真菌)負載相關。在某些實施例中，治療效果可以是減輕或消除感染或與通過革蘭氏陽性細菌引起的感染相關的癥狀。在某些實施例中，治療效果是針對葡萄球菌和/或鏈球菌，例如，金黃色葡萄球菌。包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎鏈球菌、腦膜炎雙球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血桿菌。在某些實施例中，感染由原生動物引起。在某些實施方案中，原生動物是鐮狀瘧原蟲。通過藥物組合物遞送的莫匹羅星的量取決于如對本領域中技術人員已知的各個參數，并且可以基于適當設計的臨床試驗(劑量范圍研究)來確定，并且本領域中熟練的人員將知道如何適當地進行此類試驗以便確定有效量。量尤其取決于待被治療的疾病的類型和嚴重程度以及治療方案(全身施用的模式)、經治療的受試者的性別和/或年齡和/或重量等等。在某些實施例中，藥物組合物被配制成包括適合于通過注射或輸注施用的載體。在某些實施例中，施用是通過靜脈內(i.v.)注射、肌內(i.m.)注射、腹膜內(i.p.)注射和皮下(s.c.)注射中的任一種。本公開內容還提供了一種用莫匹羅星治療受試者的用于施用的方法，該方法包括全身施用如本文中公開的脂質體。根據該方面，本公開內容還提供了一種治療患有微生物感染的受試者的方法，方法包括向受試者全身施用本文中公開的脂質體。施用可以通過對全身藥物遞送可接受的任何方案。在某些實施例中，施用是通過注射。如本文中首次公開的，本文中公開的脂質體的注射被發現在減輕細菌負載中在體內是有效的。具體地，在壞死性筋膜炎模型中的小鼠分組地接受皮下注射鏈球菌(GAS)。在細菌挑戰之后二十四小時，未接受治療的小鼠示出疾病的體征，該體征包括粗糙的毛發、重量損失和傷口形成并且在兩種情況下還包括運動和閉眼困難。在細菌挑戰之后四十八小時，在未治療的組中的小鼠中的兩個死亡。接受游離莫匹羅星(對照)的組中的小鼠沒有示出死亡率，但它們形成疾病癥狀。然而，在脂質體莫匹羅星組中的小鼠沒有形成疾病。脂質體莫匹羅星甚至在細菌挑戰之前3h接受單一脂質體莫匹羅星劑量的預防性組中是活性的。當通過腸胃外/全身途徑施用時，該途徑優于用游離的莫匹羅星以較低的或相等的劑量的治療，本文中詳細描述的研究示出脂質體莫匹羅星的功效。相比于從游離的莫匹羅星消除半衰期(20-40min)的文獻數據中已知的，如可以基于預防性劑量的活性評價的莫匹羅星消除較低。鑒于上文，在本公開內容的上下文中，當提到通過本文中公開的脂質體的治療時，應理解為涵蓋改善與疾病相關的不期望的癥狀，在癥狀出現之前防止此類癥狀的表現、減緩疾病的進展、減緩癥狀的惡化、增強疾病緩解期的開始、減緩在疾病進行性慢性階段中引起的不可逆的損傷、延遲進行性階段的開始、減輕嚴重程度或治愈疾病、提高存活率或從疾病更迅速的恢復、防止疾病發生、或上文中兩種或更多種的組合。現在將通過非限制性實施例的方式來描述本發明。非限制性實施方案和實施例的詳細描述實施例1–脂質體的制備和表征材料莫匹羅星(Teva)是來自FoamixLtd(以色列)的贈品。羥丙基-β-環糊精(HPCD)和Dowex1×8-200從SigmaAldrich獲得。氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEGDSPE)、以及膽固醇從LipoidGmbH(路德維希港，德國)獲得。瓊脂糖CL-4B從GEHealthcare獲得。成年牛血清從BiologicalIndustries(以色列)獲得。用于分析的溶劑是HPLC級。所有其他化學品是試劑級的商業產品。方法脂質體莫匹羅星的制備脂質體使用乙酸鈣(CA)梯度法來制備[ClercS,BarenholzY.1995.Loadingofamphipathicweakacidsintoliposomesinresponsetotransmembranecalciumacetategradients.BiochimBiophysActa1240:257–265]。具體地，以55:40:5的HSPC:膽固醇:mPEGDSPE的摩爾比的脂質通過在65℃下用pH5.5的200mM乙酸鈣以1:9的重量比攪拌來機械地水化。脂質體分散體通過逐步擠出來減小尺寸，逐步擠出使用聚碳酸酯過濾器、通過NorthernLipids(本拿比，BC，加拿大)擠出機來進行，開始于3次擠出穿過400nm孔徑的膜、然后3次穿過100nm孔徑的膜并且最終10次穿過50nm孔徑的膜。然后，脂質體使用CelluSep再生的纖維素膜(MembraneFiltrationProducts，USA)針對10％蔗糖溶液進行滲析。在含有HPCD的脂質體的情況下，脂質通過包含15％(w/w)HPCD的pH5.5的200mM乙酸鈣來水化。對照HPCD脂質體通過用在pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液中的15％(w/w)HPCD水化脂質來制備。所有其他制備步驟(減小尺寸和滲析)與上文所描述的相同。遠程裝載通過在65℃下將藥物與脂質體分散體以1:1的體積比的溶液溫育持續10min來進行。用于裝載的脂質體被新鮮地制備并且在一周內使用。藥物裝載溶液在pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液中制備。在pH6.3(28mM)的磷酸鹽緩沖液中的高的莫匹羅星濃度通過劇烈攪拌和在浴超聲波儀中的10min聲處理來實現。從在pH6.3的磷酸鹽緩沖液中的1％(w/w)至10％(w/w)HPCD溶液的裝載也被測試。在1％HPCD溶液中的高的莫匹羅星濃度(28mM)通過如關于磷酸鹽緩沖液所描述的劇烈攪拌和聲處理來實現。以較高的HPCD濃度(2.5-10％)的莫匹羅星溶液僅通過攪拌來制備。從丙二醇(PG)溶液和從聚乙二醇(PEG)400溶液的裝載也被進行。在這些情況下，100mM莫匹羅星的儲備溶液被制備且用pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液稀釋至期望的濃度。在用于裝載實驗的脂質體分散體中的磷脂濃度是在24-60mM的范圍內。脂質體的內部pH通過苯甲酸在脂質體內體積和外部體積之間的分布來測量，乙酸鈣脂質體的內部pH被計算為7.7。基于之前的經驗，裝載有藥物的乙酸鈣脂質體的內部pH應當低于7.0。脂質體還使用具有和不具有15％(w/w)HPCD的乙酸鈉梯度來制備。具體地，以55:40:5的HSPC:膽固醇:mPEGDSPE的摩爾比的脂質通過在65℃下用pH5.5的200mM乙酸鈉以1:9的重量比攪拌來機械地水化。脂質體分散體通過如上文所描述的逐步擠出以及然后滲析來減小尺寸。在包含HPCD的脂質體的情況下，脂質通過pH5.5的包含15％(w/w)HPCD的200mM乙酸鈉來水化。至乙酸鈉脂質體的裝載從在pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液中的莫匹羅星溶液來進行，如之前描述的。注意，在乙酸鈉的情況下，與其中對于每個鈣存在兩個乙酸根的乙酸鈣相比，對于每個鈉僅存在一個乙酸根部分。乙酸根是用于裝載的驅動力，與200mM乙酸鈣相比，在200mM乙酸鈉中較低的乙酸根含量使其難以在裝載效率方面比較這兩種方法。磷脂確定磷脂濃度通過修改的Bartlett方法在空白脂質體中作為有機磷來確定[ShmeedaH,Even-ChenS,HonenR,CohenR,WeintraubC,BarenholzY.2003.Enzymaticassaysforqualitycontrolandpharmacokineticsofliposomeformulations:comparisonwithnonenzymaticconventionalmethodologies.MethodsEnzymol367:272–92]。對照HPCD脂質體(包含磷酸鹽緩沖液)通過HPLC法針對它們的磷脂含量來測試，HPLC法基于用于測定從LipoidGmbH接收的脂質摻合物的程序。其使用LiChrospher100二醇5μm、250mmx4.0mm柱、用己烷:2-丙醇:水的梯度洗脫和用Alltech3300ELSD檢測器的蒸發光散射檢測。莫匹羅星定量藥物濃度使用HPLC/UV方法(HPLC系統-HewlettPackardSeriesII1090)來定量。所使用的柱是Waters、XBridgeC18柱，5μm，4.6mmx150mm。色譜法條件基于公布的方法[USP35.Mupirocinofficialmonograph.；:3962–3]。用于酸水解產物的分離溶液根據指令[USP35.Mupirocinofficialmonograph.；:3962–3]來制備。在莫匹羅星水解產物與莫匹羅星之間的分離度不小于2.0。總的(游離的加上脂質體的)藥物濃度通過被甲醇稀釋的脂質體分散體的HPLC測定來確定。脂質體藥物濃度在除去游離的藥物之后、通過使分散體與結合游離藥物的Dowex1×8-200陰離子交換劑混合來確定。脂質體內莫匹羅星濃度通過脂質體藥物濃度和脂質體內捕獲體積(通過之前描述的脂質體內鈣含量確定)并且根據以下等式來計算：藥物與脂質(D/L)的摩爾比初始D/L比指的是用于遠程裝載的初始摩爾比。在溫育中的初始D/L比被確定為用于遠程裝載的藥物的總量與用于遠程裝載的總脂質體磷脂的摩爾比。裝載D/L比指的是在脂質體藥物與磷脂濃度之間的摩爾比。粒度分布分析粒度使用建立好的動態光散射方法來確定，該方法用ZetasizerNanoSeriesZEN3600F(MalvernInstruments,Malvern,UK)來進行。平均直徑基于體積平均值。(更多細節，見BarenholzY,AmselemS.1993.Qualitycontrolassaysinthedevelopmentandclinicaluseofliposome-basedformulations.In:G.Gregoriadis(編輯),LiposomeTechnology,第二版,LiposomePreparationandRelatedTechniques.；1993:527–616)低溫-TEM圖像在低溫溫度下的透射電子顯微鏡(TEM)(低溫-TEM)被用于引導溶液和分散體的成像。玻璃化的樣本在涂覆有穿孔的花邊碳、300目的銅網格(TedPella,Inc.)上來制備。將4μl的溶液滴施加至該網格并且用濾紙吸去，以形成溶液的薄的液體膜。吸去的樣品在其冰點(-183℃)下被立即投入液體乙烷中。該程序在Plunger(Lieca)中自動地進行。將玻璃化的樣本轉移至液氮中用于儲存。使用FEITecnai12G2TEM、在120kV下用保持在-180℃下的Gatan低溫-保持器來研究樣品，且將圖像記錄在慢掃描的、冷卻的電荷耦合器件(CCD)Gatan相機上。在低劑量條件下，用數碼顯微圖軟件包記錄圖像以最小化電子束輻射損傷。使用差示掃描量熱法(DSC)表征方法如本文中公開的脂質體莫匹羅星從在磷酸鹽緩沖液中的藥物溶液使用乙酸鈣梯度通過遠程裝載來制備。脂質體由55:40:5的HSPC:膽固醇:mPEGDSPE摩爾比組成。兩種類型的脂質體被測試：常規的乙酸鈣脂質體(CA-脂質體)和脂質體(CA-HPCD-脂質體)，該脂質體(CA-HPCD-脂質體)在它們的內部體積中包含在乙酸鈣中的15％羥丙基β環糊精(HPCD)。DSC測量在DSC-VP(GEHealthcare)上實施。樣品和參考物被裝載并且通常以1℃/min的速度從15-20℃至90℃掃描持續三個循環(加熱、冷卻和再加熱)。用于所有脂質體樣品的參考物是蔗糖:磷酸鹽緩沖液(1:1)。具有和不具有HPCD的乙酸鈣緩沖溶液分別充當用于在本體相中具有和不具有HPCD的藥物-鈣沉淀物的參考物。熱譜圖通過基線扣減來校正。莫匹羅星從脂質體莫匹羅星中的釋放動力學脂質體莫匹羅星在50％成年牛血清中或在鹽水中在37℃下在1:20的稀釋之后被溫育。等分試樣在期望的時間點從這些樣品中采集，并且通過使用SepharoseCL-4B柱的凝膠滲透色譜法(GPC)針對藥物釋放的水平來進行分析，SepharoseCL-4B柱使脂質體莫匹羅星從游離的莫匹羅星中分離。柱用鹽水溶液平衡，并且在樣品裝載在柱上之后，0.5ml的級分被收集并且對于莫匹羅星含量進行分析。在每種級分下通過HPLC獲得的莫匹羅星濃度相對于洗脫的體積被標繪以獲得用于每種樣品的洗脫曲線。洗脫曲線包含兩個峰：第一個峰對應于脂質體中的莫匹羅星并且第二個峰對應于游離的莫匹羅星。脂質體莫匹羅星和游離的莫匹羅星的曲線下面積(AUC)通過梯形法來計算。在每個時間點，在脂質體中保留的藥物百分數(保留的％)通過以下等式來計算：結果增溶劑對莫匹羅星至聚乙二醇化的納米脂質體中的遠程裝載的影響至呈現出乙酸鈣的跨膜梯度的聚乙二醇化的納米脂質體(CA-脂質體)的莫匹羅星裝載使用不同的裝載溶液組合物來評價。莫匹羅星在水性介質中不是自由地可溶的。作為弱酸，其溶解度隨著pH增大。莫匹羅星在pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液中是可溶的，多達15mM的濃度。較高的濃度在劇烈攪拌和聲處理下實現。改進的溶解度(約100mM)用PEG400和PG實現。pH6.3的磷酸鹽緩沖液中的1-10％w/w的HPCD溶液也導致增大的溶解度(>34mM)。然而，在1％HPCD中的高濃度(≥28mM)需要10min聲處理以便實現澄清的溶液。應注意，莫匹羅星在所測試的不同溶液中的色譜圖與標準溶液的色譜圖相似。在嘗試測試溶解度增強劑對莫匹羅星裝載的影響中，莫匹羅星從溫育溶液中被裝載至脂質體(呈現出跨膜乙酸鈣梯度)中，溫育溶液包含具有和不具有PEG400、PG和1-10％HPCD的pH6.3的磷酸鹽緩沖液。圖1呈現作為用于所測試的不同溫育溶液的初始D/L比的函數的裝載D/L比。從磷酸鹽緩沖液和PEG400的溫育示出鐘形曲線的相似圖案：裝載D/L達到0.23-0.25D/L的最大裝載比并且隨著初始D/L比的增大而減小。從PG的裝載在所測試的全部初始比下是高的(0.14-0.59)并且示出裝載D/L的恒定增大，對于所測試的最高初始比(0.59)，達到了0.48的值。與磷酸鹽緩沖液和PEG400溶液相比，在PG下的這種高裝載可以是PG滲透增強特性的結果。來自HPCD溶液的裝載曲線取決于HPCD濃度。一個％HPCD示出了略微較高的裝載比，但相似的鐘形裝載曲線是關于磷酸鹽緩沖液。較高的HPCD濃度(2.5-10％)示出裝載比隨著初始比率的增大而恒定增大，并且關于PG，從這些溶液中的裝載不產生鐘形圖案。然而，裝載比對于2.5％HPCD是較高的并且隨著HPCD的增大的濃度(5％和10％)而減小；高的HPCD濃度看起來抑制裝載。HPCD對裝載的影響還針對乙酸鈣脂質體來確定，該乙酸鈣脂質體在它們的內部體積中包含HPCD(CA-HPCD-脂質體)。聚乙二醇化的脂質體用包含15％(w/w)HPCD的乙酸鈣緩沖液來制備。在脂質體內部體積中的HPCD濃度高于抑制裝載的濃度(10％，見圖1)。因此，在脂質體內部的該濃度被假定為通過使莫匹羅星捕獲于脂質體內部的包絡物中并且抑制其對外部介質的滲透來輔助裝載。圖2呈現作為所使用的初始D/L比和溫育溶液組成的函數的在CA-HPCD脂質體中的裝載D/L比。另外，包含15％HPCD而不使用乙酸鈣梯度的對照HPCD脂質體(CTRL-HPCD-脂質體)也關于它們從磷酸鹽緩沖溶液中的莫匹羅星裝載來測試。如在圖2中呈現的，對于CA-HPCD脂質體，沒有裝載溶液示出鐘形曲線。至CA-HPCD-脂質體的裝載類似于從溫育溶液中至CA-脂質體的裝載(圖1)，對于CA-脂質體(PG和2.5-10％HPCD)不示出鐘形曲線。然而，對于從磷酸鹽緩沖液、1％HPCD和PEG400的裝載，顯著性差異被發現。通過裝載至這些CA-HPCD-脂質體，對于CA-脂質體所獲得的鐘形裝載消失。如對于CA-脂質體所示出的(圖2)，從HPCD溶液裝載至CA-HPCD-脂質體取決于HPCD濃度；裝載隨著溫育溶液中的HPCD濃度的增大而減少。圖2還示出，為了裝載至CA-HPCD-脂質體，不需要增溶劑用于溫育溶液；磷酸鹽緩沖液與PG、PEG400和1％HPCD一樣好。然而，在溫育溶液中較高的HPCD濃度(5-10％)減少裝載。圖3A示出從磷酸鹽緩沖溶液至CA-脂質體、CA-HPCD-脂質體和CTRL-HPCD-脂質體的莫匹羅星裝載的比較，而圖3B示出與‘乙酸鈣’對應的脂質體相比的、從磷酸鹽緩沖溶液至乙酸鈉(NA-乙酸鹽)脂質體、NA-乙酸鹽-HPCD脂質體的莫匹羅星裝載的比較。比較證明了脂質體內介質對裝載圖案的影響。CA-脂質體示出鐘形裝載曲線，而該圖案在包含HPCD的脂質體中未被觀察到。然而，在無鈣梯度的情況下，裝載是非常低的。另外，結果示出，在裝載效率方面，使用乙酸鈣優選于乙酸鈉。莫匹羅星釋放莫匹羅星從CA-脂質體、CA-HPCD脂質體和對照-HPCD脂質體的釋放被測試。釋放在鹽水或50％血清中被評價。圖4示出在鹽水或血清中于37℃下溫育1h之后被保留在具有不同的脂質體內介質的脂質體中的％莫匹羅星。包含莫匹羅星的CA-脂質體在鹽水中是穩定的，但在50％血清的存在下非常迅速地釋放藥物(在1h內釋放82％)。裝載溶液組成對釋放速率不存在影響；從PG溶液裝載的乙酸鈣脂質體示出，與從磷酸鹽緩沖液裝載的脂質體相比相似的在血清中的釋放值(數據未示出)。然而，血清中的釋放在CA-HPCD-脂質體中顯著減少。在溫育1h之后，僅22％被釋放，并且再次，對于裝載溶液組成未發現影響(數據未示出)。包含莫匹羅星的對照HPCD示出在溫育1h之后迅速釋放(73％)。在鹽水和血清中從CA-脂質體的莫匹羅星釋放之間的實質差異被歸因于莫匹羅星的高的蛋白質結合親和性(96.5％)。為了測試該假設，包含莫匹羅星的CA-脂質體在血清中被溫育，該血清用游離的莫匹羅星預溫育至12.5μM的濃度。在這種情況下，從CA-脂質體的釋放被大體上減少至35％，這支持我們關于作為釋放藥物槽(releaseddrugsink)參與的血清蛋白的工作假設。在溫育48h之后的釋放曲線在鹽水和血清的存在下針對包含莫匹羅星的CA-HPCD-脂質體來進行測試(圖5)。在鹽水中的釋放是相對低的，其中在溫育48h之后釋放37％。在血清中的釋放是更迅速的，分別在溫育3h和24h之后具有47％和72％釋放。在血清中從CA-HPCD-脂質體的釋放大體上低于從CA-脂質體的釋放(在溫育1h之后釋放82％，圖4)。脂質體莫匹羅星的低溫-TEM表征具有和不具有莫匹羅星的CA-脂質體和CA-HPCD-脂質體的低溫-TEM圖像在圖6中呈現。圖像示出球形的SUV脂質體，其中在它們內部或在脂質體介質中無可觀察到的藥物晶體。脂質體大小分布脂質體還使用馬爾文粒度分析儀針對它們的大小和大小分布進行評價。所獲得的大小是小的，77±5nm的Z平均值。對于制備的所有批次，多分散指數(PDI)低于0.05，這表示脂質體的大小分布的低變化性，在乙酸鈣和乙酸鈣-HPCD脂質體、乙酸鈉和乙酸鈉-HPCD之間未發現大小分布的差異。脂質體莫匹羅星的差示掃描量熱法(DSC)表征DSC分析基于通過Biltonen和Lichtenberg1993所描述的方法來進行(BiltonenR.L.和LichtenbergD.,1993,Chem.Phys.Lipids94,128-142)。具有和不具有HPCD的空白脂質體示出對應于可逆的廣義相變過程的一種吸熱(endotherm)，該可逆的廣義相變過程在53℃下具有熱容的最大改變，53℃被視作相變的Tm(圖8A-8B)。這與基于HSPC的脂質體的相變行為一致(Garbuzenko等人的2005Chem.PhysLipids，見上文的參考文獻)。與空白脂質體相同的脂質組成和大小分布的藥物裝載的脂質體示出兩種吸熱(圖9A-9B)。第一種吸熱表示可逆過程，其具有與空白脂質體的Tm相似的Tm，并且因此第一種吸熱歸因于膜脂質，第一種吸熱對于具有或不具有HPCD的藥物裝載的脂質體被觀察到。在較高溫度(>78℃)下的第二種吸熱涉及藥物-鈣絡合物的熔化。這種吸熱是不可逆的，這意味著在包括藥物的組合體的熔化發生后，其在冷卻之后不再形成相同的組合體。在不具有HPCD的乙酸鈣脂質體中的藥物絡合物具有78.4℃的熔點，而在乙酸鈣–HPCD脂質體中的藥物絡合物在較高溫度下示出兩個峰；81.3℃和87.0℃，這指示與不具有HPCD的情況下所觀察到的絡合物不同的絡合物。脂質體莫匹羅星的長期穩定性對于某些樣品，脂質體莫匹羅星的長期穩定性基于可見的外觀、封裝濃度和粒度分布在兩年的時期內來檢驗。方法以下是五種脂質體莫匹羅星制劑，其使用乙酸鈣梯度通過遠程裝載來制備并且在這五種脂質體莫匹羅星制劑的內部水相中包含HPCD。粒度和大小分布粒度測量使用Zetasizer(MalvernInstruments)進行。平均直徑基于體積平均值。在零時刻獲得的大小是77±1.5nm。多分散指數(PDI)低于0.05。脂質體莫匹羅星的水平和濃度的確定在脂質體分散體中的莫匹羅星濃度使用HPLC/UV法來定量。所使用的柱是Waters、XBridgeC18柱，5μm，4.6mmx150mm。色譜法條件基于USP法。脂質體藥物濃度在除去游離的藥物之后通過使分散體與結合游離的藥物的Dowex1×8-200陰離子交換劑混合來確定。結果在全部時間點的制劑的可見外觀是半透明的，其中沒有觀察到的沉淀。另外，在9-24個月之間的時期期間，未呈現出大小分布的變化，指示脂質體的穩定性。最終，下表1概述了在指示的時間段(第零天、9個月、14個月和24個月)內的莫匹羅星脂質體濃度(濃度)。在零時間點的藥物與脂質的摩爾比是制劑中的封裝藥物與脂質濃度之間的摩爾比。表1：穩定性測試濃度–按mg/ml±SD的單位計ND-不確定的上文的結果示出，脂質體制劑的大小以及PDI均無變化，脂質體分散體中的莫匹羅星濃度也無變化并且無脂質體聚集，這些指示長期穩定性。實施例2–在小鼠壞死性筋膜炎模型中的脂質體莫匹羅星材料和方法在研究中使用的藥物制劑脂質體如上文所描述地制備。脂質體莫匹羅星組成被包括在表1A中：表1A：脂質體分散體濃度材料濃度(mg/ml)濃度(mM)HSPC28.736.6mPEG-DSPE9.73.2膽固醇9.725.0HPCD7.6a，b5.5a,b乙酸鈣1.8a,c10.2a,c莫匹羅星5.5-6.511.0-13.0蔗糖55d，e160.7磷酸二氫鈉9.0d，e75.0d無水磷酸二鈉5.8d，e32.6da基于在5.09％(基于本文中未示出的鈣測量計算)的制劑中的捕獲的脂質體體積的評價。b在脂質體內區室中的HPCD濃度是150mg/ml乘以5.09％捕獲的脂質體體積，得到在總制劑中的7.6mg/mlHPCD。c在脂質體內的相中的乙酸鈣含量是35.2mg/ml乘以5.09％捕獲的脂質體體積，得到在總制劑中的1.8mg/ml乙酸鈣。d假設用裝載溶液的0.53的稀釋(基于在透析過濾之后獲得的磷脂濃度)。e最終制劑的同滲重摩低于400mOsm/kg。在用Dowex1×8-200(陰離子交換劑)分離游離的莫匹羅星之后，如通過HPLC/UV法確定的脂質體莫匹羅星濃度是5.5-6.5mg/ml。HPCD、乙酸鈣和莫匹羅星的脂質體內濃度被確定，如在表1B中所示的。HPCD:莫匹羅星的脂質體內摩爾比被發現是在0.6-0.8的范圍內。表1B：脂質體內含量：組分濃度(mg/ml)濃度(mM)HPCD150109鈣35200a，b莫匹羅星88-108c177-216a對應于在裝載之前的脂質體內體積中的20.4μmol乙酸根b在裝載之前的初始乙酸根濃度是400mM并且在裝載之后的初始乙酸根濃度被減少至約200mMc基于在濃縮成5.09％脂質體內體積的4.5-5.5mg/ml的制劑中的脂質體莫匹羅星濃度計算游離的莫匹羅星溶液游離的莫匹羅星溶液(6mg/ml)在pH6.3的200mM磷酸鹽緩沖液中來制備。在體內的研究程序壞死性筋膜炎模型基于公布的方法來進行[Hidalgo-grass,C.等人MechanismsofdiseaseEffectofabacterialpheromonepeptideonhostchemokinedegradationingroupAstreptococcalnecrotisingsoft-tissueinfections.363,(2004)]。具體地，工作方案包括：選擇雌性BALB/c小鼠，10g重量且年齡為3-4周。第一天：將細菌接種在血瓊脂板上并且在37℃下溫育。THY介質被制備、高壓滅菌并且保持在室溫下。第二天：從恒溫器中取出板并且放置在室溫下。第四天：將細菌從板轉移至5mlTHY管(在恒溫器中保溫)。第五天：將2ml細菌從5mlTHY管轉移至50mlTHY管。細菌生長至早期的對數期(O.D600＝0.3-0.4)，用PBS洗滌并且懸浮于PBS中至O.D600＝0.8，這與100μl的注射體積中的108個細菌相互關聯。所獲得的細菌體積根據研究中的小鼠數目被劃分至小瓶。每種稀釋液都被接種在血瓊脂板上并且在該天之后對菌落計數。分析：在第五天，從小鼠背部的中央除去小鼠的毛發，并且皮下注射細菌。第六天-第七天：以下是疾病狀態和小鼠死亡率。這些天存活的小鼠被處死。根據下表2A跟蹤疾病狀況。表2B呈現了研究組。具體地，組A鏈球菌(GAS)注射劑(0.75x108CFU)被施用至全部的研究組。藥物通過IV注射100μl制劑被施用。每個脂質體莫匹羅星劑量是45mg/kg。每個游離的莫匹羅星劑量是50mg/kg。結果基于在上文描述的研究程序中發現的參數來評價小鼠。在表3-9中總結了觀察結果。第1組(未治療的，無藥物施用)和第2組(游離的藥物)中的小鼠在細菌挑戰之后24h形成疾病。在未治療的組中，小鼠中的2個病的很重(比在該組中的其他小鼠更重)，如通過它們的閉合或部分閉合的眼睛以及它們在運動中的困難所示出的。這兩只小鼠在下一個觀察點(48h)死亡。在該組中以及第2組中的所有其他小鼠形成較小嚴重的疾病：它們在第一個24h內減輕重量，它們具有傷口并且它們的毛發粗糙并且不順滑。接受脂質體莫匹羅星的第3-5組中的小鼠未示出疾病的癥狀，即使是在接受僅一個預防性劑量(在細菌注射之前3h)的第3組。圖10呈現研究內的平均小鼠重量。如從圖中可以看到，在整個研究中，第3-5組中的小鼠獲得與在第一個24h示出重量減小的第1組和第2組相反的重量。圖11A和11B呈現在細菌注射之后48h在未治療的組和脂質體莫匹羅星組中的小鼠的圖片。表3：每時間點關于研究組的小鼠死亡率表4：在每個時間點的平均小鼠重量(g)a-在第24h時的第1組中的六只小鼠。在48h、72h和96h時的四只小鼠。b-每組六只小鼠表5：在細菌挑戰之后24h的平均小鼠重量變化(％)(每組6只小鼠)組編號％重量變化1-102-7344456表6：在每個時間點的毛發外觀a-在第24h時的第1組中的六只小鼠。在48h、72h和96h時的四只小鼠。b-每組六只小鼠表7：在每個時間點的傷口外觀a-在第24h時的第1組中的六只小鼠。在48h、72h和96h時的四只小鼠。b-每組六只小鼠表8：在每個時間點的眼睛外觀a-在第24h時的第1組中的六只小鼠。在48h、72h和96h時的四只小鼠。b-每組六只小鼠表9：在每個時間點的小鼠運動的描述a-在第24h時的第1組中的六只小鼠。在48h、72h和96h時的四只小鼠。b-每組六只小鼠。當前第1頁1 2 3