免疫病癥的治療的制作方法

本公開涉及表達高水平血管生成素-1(Ang1)的干細胞和其抑制TNF-α和/或IL-6釋放以及治療例如糖尿病等發炎性疾病的用途。

發明背景

血管生成素屬于血管生長因子家族，血管生長因子在胚胎和出生后血管生成中起作用。Ang1促進內皮細胞和一些非內皮細胞(例如平滑肌細胞)的遷移。Ang1還誘導內皮細胞萌發和重新組織到小管中。Ang1對內皮細胞發揮有效的消炎作用，遏制血管內皮生長因子(VEGF)誘發的E-選擇素、ICAM-1和VCAM-1上調，并抑制回應于VEGF和TNF-α的白細胞附著和遷移(Kim等人Circ Res.,89(6),477-479,2001)。

當前大部分1型糖尿病患者的療法是基于定期皮下注射短效和長效胰島素制劑的混合物。施用給與中效和長效組分與更持續作用型態的不同尺寸的可溶性胰島素粒子的懸浮液以實現激素的恒定基線水平(Heine等人Br Med J(Clin Res編輯)290:204-205,1985)。

此當前療法的一個缺點是遲效制劑一般不產生平穩的胰島素背景水平，引起高血糖或者低血糖。高血糖的問題在于其可能引起糖尿病患者中進一步的并發癥。舉例來說，慢性高血糖引起嚴重小血管(視網膜病和腎病)、大血管(中風、心肌梗塞)和神經病并發癥。這些破壞性并發癥可以通過血糖水平的標準化來預防。

近年來，基于干細胞的技術已經顯現為一種治療糖尿病的可能方法。然而，除與可能需要終身免疫抑制的根本自體免疫疾病相關的問題外，這些技術尚有待顯現為一種有前途的治療選擇。

因此，在糖尿病和/或其相關病狀或癥狀的患者中治療需求仍未滿足，需要新的治療選擇。

本申請中任何文獻的引用或鑒別并非許可此類文獻可作為本公開的現有技術使用。

發明概要

本發明人已經發現其能夠使用表達高水平Ang1的未遺傳修飾的干細胞增加人類受試者中消炎細胞的產生，不需要用表達Ang1的核酸轉染細胞。

本發明人還發現其能夠在人類受試者中降低TNF-α水平、降低IL-6水平和/或增加IL-10水平。這些發現表明此類表達升高水平的Ang1的未遺傳修飾的干細胞適于治療發炎性病癥，例如糖尿病和其相關病狀和癥狀。

實際上，本發明人已經發現其能夠使用表達高水平Ang1的未遺傳修飾的干細胞在患有糖尿病的人類受試者中降低HbA1c、降低空腹胰島素水平和/或增加脂肪細胞因子水平，不需要用表達Ang1的核酸轉染細胞。

在其它實例中，本發明人還展示其能夠使用表達高水平Ang1的未遺傳修飾的干細胞改善人類受試者中類風濕性關節炎和糖尿病性腎病的癥狀，不需要用表達Ang1的核酸轉染細胞。

因此，在一個實例中，本公開提供了一種增加有需要的受試者中消炎細胞的產生和/或功能的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在一個實例中，消炎細胞是Th2細胞、TReg細胞或M2型巨噬細胞。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目至總單核細胞群體的至少10％。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目至總單核細胞群體的至少20％。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目至總單核細胞群體的至少40％。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目至總單核細胞群體的至少80％。

在另一實例中，所述方法增加受試者中M2型巨噬細胞的數目至總單核細胞群體的至少90％。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14+CD16+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14+CD16+CD163+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14+CD16+CD206+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14+CD16+CD163+CD206+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14++CD16+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14++CD16+CD163+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14++CD16+CD206+。

在另一實例中，M2型巨噬細胞是CD14++CD16+CD163+CD206+。

在另一實例中，所述方法促進巨噬細胞從M1極化成M2表型。

在另一實例中，所述方法促進促炎性T輔助細胞分化成Th2或TReg細胞。

在一個實例中，促炎性T輔助細胞是Th17細胞。

在一個實例中，增加受試者中消炎細胞的產生和/或功能引起：

-受試者中IL-6水平降低；

-受試者中TNF-α水平降低；和/或

-受試者中IL-10水平增加。

在一個實例中，所述方法增加受試者中消炎細胞因子的水平。

在一個實例中，所述方法增加受試者中IL-10的水平。

在一個實例中，所述方法降低受試者中促炎性細胞因子的水平。

在一個實例中，所述方法降低受試者中IL-6、TNF-α和/或IL-17中任一者的水平。

在一個實例中，所述方法還抑制促炎性細胞的產生和/或功能。

在一個實例中，促炎性細胞是Th17細胞或M1型巨噬細胞。

在另一實例中，本公開提供了一種方法，其中所述方法抑制M1型巨噬細胞極化。

在另一實例中，本公開提供了一種方法，其中所述方法促進巨噬細胞從M1極化成M2表型。

在另一實例中，本公開提供了一種方法，其中所述方法抑制M1型巨噬細胞衍生細胞因子釋放。

在另一實例中，本公開提供了一種方法，其中所抑制的M1型巨噬細胞衍生細胞因子是TNF-α和/或IL-6。

在另一實例中，本公開提供了一種治療發炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在另一實例中，發炎性疾病是糖尿病或選自由以下組成的組的糖尿病相關病狀或癥狀：異常傷口愈合、心臟病發作癥狀、中風癥狀、周圍血管疾病癥狀、截肢、腎病癥狀、腎衰竭、失明、神經病、腎病、視網膜病、發炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

舉例來說，本公開提供了一種治療類風濕性關節炎的方法。

舉例來說，本公開提供了一種治療糖尿病性視網膜病的方法。

在另一實例中，本公開的方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的血管生成素-1(Ang1)。在另一實例中，干細胞表達至少0.5μg/10⁶個細胞的量的Ang1。在另一實例中，干細胞表達至少0.7μg/10⁶個細胞的量的Ang1。在另一實例中，干細胞表達至少1μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在另一實例中，干細胞表達少于約0.1μg/10⁶個細胞的量的VEGF。在另一實例中，干細胞表達少于約0.05μg/10⁶個細胞的量的VEGF。在另一實例中，干細胞表達少于約0.04μg/10⁶個細胞的量的VEGF。在另一實例中，干細胞表達少于約0.03μg/10⁶個細胞的量的VEGF。在另一實例中，干細胞表達少于約0.02μg/10⁶個細胞的量的VEGF。在另一實例中，干細胞表達少于約0.01μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在另一實例中，干細胞表達至少約2:1比率的Ang1:VEGF。在另一實例中，干細胞表達至少約10:1比率的Ang1:VEGF。在另一實例中，干細胞表達至少約20:1比率的Ang1:VEGF。在另一實例中，干細胞表達至少約30:1比率的Ang1:VEGF。在另一實例中，干細胞表達至少約50:1比率的Ang1:VEGF。

在另一實例中，干細胞為間質干細胞。在另一實例中，干細胞為間質前驅細胞。在另一實例中，干細胞是誘導多潛能干細胞(iPS細胞)。

在另一實例中，組合物進一步包含可接受的藥物載劑。

在另一實例中，通過根據下述體外方法培養未遺傳修飾的干細胞，產生組合物。

在一個實例中，干細胞可以從任何哺乳動物獲得。舉例來說，干細胞可以來源于靈長類動物、奶牛、綿羊、馬、犬、貓或山羊。在另一實例中，干細胞為人類干細胞。

在另一實例中，發炎性疾病是II型糖尿病。

在一個實例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約0.1×10⁶至約3×10⁶個干細胞。

在一個實例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約0.3×10⁶至約2×10⁶個干細胞。

在一個實例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約1×10⁶至約2×10⁶個干細胞。

在一個實例中，治療II型糖尿病的方法可包括向受試者施用每公斤約2×10⁶個干細胞。

在一個實例中，以下任一者指示所述受試者中糖尿病或糖尿病相關病狀或癥狀已得到治療：

-HbA1c值(總血紅蛋白％)減少；

-空腹胰島素水平降低；

-IL-6水平降低；

-TNF-α水平降低；和/或

-脂肪細胞因子水平增加。

在一個實例中，受試者具有II型糖尿病，其中受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個實例中，二甲雙胍(metformin)對受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個實例中，受試者具有超過7.5％的基線HbA1c值。

在一個實例中，受試者具有大于或等于8％的基線HbA1c值。

在一個實例中，發炎性疾病是類風濕性關節炎。

在一個實例中，治療類風濕性關節炎的方法可包括向受試者施用每公斤約0.5×10⁶至約3.0×10⁶個干細胞。

在一個實例中，治療類風濕性關節炎的方法可包括向受試者施用每公斤約1.0×10⁶至約2.0×10⁶個干細胞。

在一個實例中，以下任一者指示類風濕性關節炎已得到治療：

-ACR20；

-ACR50；

-ACR70；

-IL-6水平降低；和/或

-疾病活性評分降低。

在另一實例中，發炎性疾病是糖尿病性神經病。

在一個實例中，治療類風濕性關節炎的方法可包括向受試者施用約1.0×10⁸至約4.0×10⁸個干細胞。

在一個實例中，治療類風濕性關節炎的方法可包括向受試者施用約1.5×10⁸至約3.0×10⁸個干細胞。

在一個實例中，以下任一者指示糖尿病性腎病已得到治療：

-抑制eGFR和/或mGFR下降；

-改善eGFR和/或mGFR；和/或

-IL-6水平降低。

在一個實例中，受試者基線eGFR超過約35ml/min/1.73m²。

在一個實例中，受試者基線eGFR超過30ml/min/1.73m²。

在一個實例中，受試者基線eGFR超過28ml/min/1.73m²。

在一個實例中，受試者基線eGFR超過25ml/min/1.73m²。

在一個實例中，干細胞全身施用。

在一個實例中，干細胞靜脈內施用。

在另一實例中，本公開涉及包含未遺傳修飾的干細胞的組合物的用途，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述組合物用于制造供治療發炎性疾病用的藥物。

在另一實例中，本公開涉及一種包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達升高水平的血管生成素-1(Ang1)，所述組合物用于治療發炎性疾病。

在另一實例中，本公開涉及一種包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中當用于治療發炎性疾病時所述未遺傳修飾的干細胞表達升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

圖示簡單說明

圖1：使用當前(方法A)和重新調配的培養基(方法B)的MPC生長。Y軸指示細胞數；X軸為時間，以天為單位。對照培養基為用于方法A的培養基，且重新調配的培養基為用于方法B的培養基。

圖2：在當前(方法A)和重新調配的培養基(方法B)中的MPC倍增時間。MPC在當前αMEM培養物中生長(方法A)或在改良的αMEM中重新調配(方法B)。細胞從P3傳代到P5。

圖3：MPC群體倍增時間(PDL)。MPC在當前αMEM培養基(方法A)對比重新調配的αMEM(方法B)中從P3生長至P5。在當前(方法A)培養基中生長的MPC進行8個PDL，且在重新調配的培養基(方法B)中生長的MPC進行7.33個PDL。

圖4：CD14+免疫選擇的單核細胞與MPC共培養產生展現M2巨噬細胞的表型特性的CD14+16+巨噬細胞。

圖5：與MPC共培養預防巨噬細胞在發炎驅動下(LPS)分泌TNFα。

圖6：通過與MPC在LPS存在下共培養，增強巨噬細胞產生消炎細胞因子IL-10。

圖7：MPC在調節巨噬細胞極化中的作用。

圖8：分泌PGE2：IL-1β和TNFα的累加效應。

圖9：施用MPC后促炎性和消炎細胞因子的水平的變化。

圖10：在建立疾病后期(第42天)時施用MPC引起關節中發炎細胞因子的水平降低。

圖11：組1-3的MPC給藥

圖12：第12周脂肪細胞因子水平(自基線的變化)。

圖13：第12周TNF-α水平(自基線的變化)。

圖14：第12周IL-6水平(自基線的變化)。

圖15：基線HbA1c<8％或≥8％的子群的HbA1c改變

圖16：第12周處于目標HbA1c(<7.0％)下的受試者

圖17：隨著時間推移的中位IL-6改變

圖18：生物制劑難治性RA的ACR 20反應：1M MPC/kg

圖19：生物制劑難治性RA的ACR 50反應：1M MPC/kg

圖20：生物制劑難治性RA的ACR 70反應：1M MPC/kg

圖21：隨著時間推移組分的ACR反應；以周計，觸痛(TJC；左)和腫脹(SJC；右)關節數

圖22：隨著時間推移組分的ACR反應；以周計，受試者疾病活性總評估(SGADA)(左)；以周計，研究者疾病活性總評估(IGADA)(右)。

圖23：第12周DASCRP反應者分析。

圖24：健康評估問卷疾病指數(HAQ-DI)：到達MCID的比例(-0.22)

圖25：第12周mGFR[⁹⁹Tc DTPA]和eGFR[MDRD]，自基線的變化(ml/min/1.73m²)。

圖26：第12周IL-6自基線的中位變化

圖27：MPC治療的患者中基線IL-6與第12周血清肌酸酐提高相關。

圖28：在基線eGFR>30ml/min/1.73m²的mGFR和eGFR受試者中第12周自基線的變化。

發明詳述

通用技術和定義

本說明書通篇中，除非以其它方式特別陳述或上下文另外要求，否則對單個步驟、目標組合物、步驟組或目標組合物組的提及應涵蓋那些步驟、目標組合物、步驟組或目標組合物組的一個和多個(即一個或多個)。

本領域技術人員將了解本文中描述的公開內容可以進行除特別描述內容以外的變化和修改。應了解本公開包括所有這類變化和修改。本公開還包括所有在本說明書中個別或共同提及或指示的步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有組合或任兩個或超過兩個所述步驟或特征。

本公開在范圍上不受本文所述的特定實施方案限制，這些實施方案僅僅是為了例示而已。功能同等的產物、組合物和方法清楚地在如本文中描述的公開內容的范圍內。

除非另外特別陳述，否則本文公開的任何實例作必要修改后應適用于任何其它實例。

除非另外特別定義，否則本文中使用的所有技術和科學名詞都應具有與本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、干細胞分化、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學和生物化學中)技術人員通常所了解相同的含義。

除非另外指明，否則本公開中利用的干細胞、細胞培養和免疫技術是本領域技術人員眾所周知的標準程序。此類技術在例如以下等來源中文獻通篇中加以描述和解釋：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(編輯),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(編輯)；以及F.M.Ausubel等人(編輯),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有更新，直至現在)；Ed Harlow和David Lane(編輯)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；以及J.E.Coligan等人(編輯)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括所有更新，直至現在)。

應了解術語“和/或”，例如“X和/或Y”意指“X和Y”或“X或Y”，且應清楚證明兩種含義或者任一含義。

如本文所用，除非相反陳述，否則術語“約”是指指定值+/-10％，更優選地+/-5％。

體積百分比(v/v％)定義[(溶質體積)/(溶液體積)]×100％。體積百分比是相對于溶液體積。舉例來說，補充5％v/v FCS的細胞培養基意指每100ml細胞培養基存在約5ml FCS。

本說明書通篇中，應了解詞語“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”意味包括所述要素、整數或步驟，或者要素、整數或步驟組，但不排除任何其它要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟組。

干細胞

如本文所用，術語“干細胞”是指能夠產生表型和基因型一致的子代以及至少一種其它最終細胞類型(例如終末分化的細胞)的自我更新細胞。術語“干細胞”包括全能細胞、多能細胞和多潛能細胞以及來源于其分化的祖細胞和/或前驅細胞。干細胞可以是成年或胚胎干細胞。

如本文所用，術語“全能細胞(totipotent cell)”或“全能細胞(totipotential cell)”是指能夠形成完整胚胎的細胞(例如胚泡)。

如本文所用，術語“多能細胞(pluripotent cell)”或“多能細胞(pluripotential cell)”是指具有完整的分化多樣性，即能夠生長成哺乳動物身體大約260種細胞類型任一者的細胞。多能細胞可以自我更新，且可保持在組織內休眠或靜止。

“多潛能細胞(multipotential cell)”或“多潛能細胞(multipotent cell)”意指能夠產生若干成熟細胞類型任一者的細胞。如本文所用，此短語涵蓋成年祖細胞和這些細胞的多潛能子代。不同于多能細胞，多潛能細胞不能夠形成所有細胞類型。

如本文所用，術語“間質譜系前驅細胞或干細胞”是指可以分化成間質細胞類型的細胞。舉例來說，間質譜系前驅細胞和間質前驅細胞可以分化成骨骼、軟骨、肌肉和脂肪細胞以及纖維結締組織。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞是STRO-1+間質前驅細胞。

STRO-1+多潛能細胞是在骨髓、血液、牙髓、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎、肝、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結、胸腺、骨骼、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中發現的細胞。因此，STRO-1+多潛能細胞能夠分化成大量細胞類型，包括(但不限于)脂肪、骨、軟骨、彈性和纖維結締組織。這些細胞進入的特定譜系定型和分化途徑取決于來自機械影響的多種影響和/或內源性生物活性因子，例如生長因子、細胞因子和/或宿主組織建立的局部微環境條件。在一個實施方案中，STRO-1+多潛能細胞是非造血祖細胞，其分裂產生子細胞，這些子細胞是干細胞或者是將按期不可逆地分化產生表型細胞的前驅細胞。

在一個實例中，STRO-1+細胞從獲自受試者(例如有待治療的受試者或相關受試者或無關受試者(無論是相同物種還是不同)的樣品富集。術語“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或其變化形式在本文中用以描述當與未處理的細胞群體(例如天然環境中的細胞)比較時，一種特定細胞類型的比例或大量特定細胞類型的比例增加的細胞群體。在一個實例中，STRO-1+細胞富集的群體包含至少約0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％或85％或95％或99％STRO-1+細胞。關于此，術語“STRO-1+細胞富集的細胞群體”將清楚地證明術語“包含X％STRO-1+細胞的細胞群體”，其中X％是如本文中敘述的百分比。在一些實例中，STRO-1+細胞可以形成克隆源性群落，例如CFU-F(成纖維細胞)或其子集(例如50％或60％或70％或80％或90％或95％)可以具有此活性。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞從包含STRO-1+細胞的細胞制劑以可選擇形式富集。關于此，應了解術語“可選擇形式”意指細胞表達標記物(例如細胞表面標記物)，從而允許選擇STRO-1+細胞。標記物可以是STRO-1，但無須是STRO-1。舉例來說，如本文中描述和/或例示，表達STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的細胞(例如MPC)還表達STRO-1(且可以是STRO-1^亮)。因此，指示細胞是STRO-1+并不意指通過STRO-1表達選擇細胞。在一個實例中，基于至少STRO-3表達，例如其是STRO-3+(TNAP+)，來選擇細胞。在另一實例中，基于至少STRO-4表達，例如其是STRO-4+，來選擇細胞。

提及細胞或其群體的選擇不一定要求從特定的組織來源選擇。如本文所述，STRO-1+細胞可以從各種來源選擇或分離或富集。也就是說，在一些實例中，這些術語支持從包含STRO-1+細胞的任何組織(例如MPC)或血管化組織或包含外膜細胞(例如STRO-1+外膜細胞)的組織或本文中敘述的任一種或多種組織選擇。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞表達一種或多種個別或共同選自由以下組成的組的標記物：STRO-1+、TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+、CC9或其任何組合。

“個別”意指本公開分別涵蓋敘述的標記物或標記物組，且盡管個別標記物或標記物組可能在本文中未分別列出，但隨附權利要求書可分別且彼此區別地定義此類標記物或標記物組。

“共同”意指本公開涵蓋任何數目的敘述的標記物或肽組或其組合，且盡管此類數目的標記物或標記物組或其組合可能在本文中未特別列出，但隨附權利要求書可分別且與標記物或標記物組的任何其它組合相區別地定義此類組合或亞組合。

在一個實例中，STRO-1+細胞是STRO-1^亮(同義詞STRO-1^bri)。在一個實例中，STRO-1^bri細胞相對于STRO-1^暗或STRO-1^中間細胞優先富集。

在一個實例中，STRO-1^亮細胞另外是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一個或多個。舉例來說，針對上述標記物的一個或多個，選擇細胞，和/或選擇展示表達上述標記物中的一個或多個的細胞。關于此，展示表達標記物的細胞無須特別測試，而是可以測試以前富集或分離的細胞，且隨后使用、分離或富集的細胞可以合理地假設成也表達相同的標記物。

在一個實例中，STRO-1^亮通過免疫選擇來分離。在一個實例中，STRO-1^亮細胞通過表達TNAP的細胞的免疫選擇來分離。如本文所用，術語“TNAP”意圖涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有同功異型物。舉例來說，該術語涵蓋肝同功異型物(LAP)、骨骼同功異型物(BAP)和腎同功異型物(KAP)。在一個實例中，TNAP是BAP。在一個實例中，如本文所用，TNAP是指可以結合由融合瘤細胞系產生的STRO-3抗體的分子，STRO-3抗體依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的條款以寄存編號PTA-7282于2005年12月19日寄存在ATCC。

在一個實例中，間質前驅細胞或干細胞是CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+間質干細胞(例如remestemcel-L)。

在一個實例中，間質前驅細胞是如WO 2004/85630中定義的血管周間質前驅細胞。舉例來說，間質前驅細胞表達血管周細胞的標記物，例如細胞是STRO-1+或STRO-1^亮和/或3G5+。在一個實例中，細胞是或以前是從血管化組織或器官或其部分分離的細胞或其子代。

稱為對既定標記物呈“陽性”的細胞可以表達低(lo或暗)或高(亮、bri)水平的該標記物，取決于細胞表面上標記物存在的程度，其中所述術語涉及熒光強度或者用于細胞分類過程中的其它標記物。在所分類的特定細胞群體上使用的標記物的上下文中將了解lo(或暗或暗淡)與bri的區別。稱為對既定標記物呈“陰性”的細胞不一定完全缺乏該細胞。此術語意指該細胞表達相對極低水平的所述標記物，且當可檢測地標記或超過背景水平，例如使用同型對照抗體檢測的水平而不可檢測時，其產生極低信號。

當本文中使用時，術語“亮”是指細胞表面上在可檢測地標記時產生相對高信號的標記物。雖然不希望受理論限制，但提出“亮”細胞表達的目標標記物蛋白質(例如由STRO-1識別的抗原)比樣品中其它細胞多。舉例來說，當用FITC結合的STRO-1抗體標記時，如熒光活化細胞分類(FACS)分析所測定，STRO-1^bri細胞產生的熒光信號比非亮細胞(STRO-1^暗淡/暗)大。在一個實例中，“亮”細胞構成起始樣品中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1％。在其它實例中，“亮”細胞構成起始樣品中所含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1％、至少約0.5％、至少約1％、至少約1.5％或至少約2％。在一個實例中，STRO-1^亮細胞相對于“背景”，即STRO-1-細胞，具有2log量值更高的STRO-1表面表達。比較起來，STRO-1^暗淡和/或STRO-1^中間細胞相對于“背景”具有少于2log量值更高的STRO-1表面表達，通常約1log或更少。

在一個實例中，顯著比例的STRO-1+多潛能細胞能夠分化成至少兩種不同的生殖系。多潛能細胞可以定型的譜系的非限制性實例包括骨骼前驅細胞；對膽管上皮細胞和肝細胞是多潛能的肝細胞祖細胞；神經限制細胞，其可以產生進展成少突神經膠質細胞和星形細胞的膠質細胞前驅物；進展成神經元的神經元前驅物；心肌和心肌細胞的前驅物，葡萄糖反應性分泌胰島素的胰腺β-細胞系。其它譜系包括(但不限于)成牙質細胞、產生牙質的細胞和軟骨細胞以及以下前驅細胞：視網膜色素上皮細胞、成纖維細胞、例如角化細胞等皮膚細胞、樹突狀細胞、毛囊細胞、輸尿管上皮細胞、平滑肌和骨骼肌細胞、睪丸祖細胞、血管內皮細胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞、成纖維細胞、骨髓基質、心肌、平滑肌、骨骼肌、外膜細胞、血管細胞、上皮細胞、神經膠質細胞、神經元細胞、星形細胞和少突神經膠質細胞。

在另一實例中，STRO-1+細胞不能在培養時產生造血細胞。

在一個實例中，目前描述的干細胞是間質干細胞。間質干細胞(MSC)可以是均質組合物或可以是MSC富集的混合細胞群體。均質間質干細胞組合物可以通過培養附著骨髓或骨膜細胞來獲得，且間質干細胞可以通過用獨特的單克隆抗體鑒別的特定細胞表面標記物來鑒別。用于獲得間質干細胞富集的細胞群體的方法描述于例如美國專利No 5,486,359中。間質干細胞的替代來源包括(但不限于)血液、皮膚、臍帶血、肌肉、脂肪、骨骼和軟骨膜。

可以通過大量不同的方法實現攜帶上述細胞表面標記物的干細胞的識別、選擇和純化。舉例來說，結合劑施加于相關標記物，接著分離展現結合，高水平結合或低水平結合或無結合的那些細胞。

舉例來說，結合劑可以包括抗體，例如單克隆抗體或基于抗體的分子。

抗體和其它結合分子可以用于多種技術中，以選擇和純化表達特定細胞表面標記物的干細胞。

用于選擇和純化的技術可包括(但不限于)使用抗體涂布的磁珠進行磁力分離、親和層析法和用附接于固體基質的抗體“淘洗”、熒光活化細胞分類(FACS)。

表達特定標記物的表達升高水平Ang1的干細胞可以經由陽性免疫選擇從細胞群體選擇或純化。舉例來說，間質前驅細胞可以基于STRO-1抗體的細胞表面表達，從細胞群體分離和富集(參見例如Gronthos和Simmons 1995)。

根據本公開的分離的干細胞可以通過培養而體外擴增。如本領域技術人員所了解，干細胞可以低溫保存，解凍，并隨后通過培養而體外擴增。在一個實例中，將干細胞接種在生長培養基中，并使其附著培養容器，在37℃、20％O₂下過夜。隨后替換生長培養基并將細胞在37℃、5％O₂下再培養68至72小時。

在一個實例中，將分離的干細胞以50,000個細胞/平方厘米接種在補充血清的生長培養基中，并使其附著培養容器，在37℃、20％O₂下過夜。隨后用補充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的軟骨形成基礎培養基(CBM；Lonza,Walkersville,MD)替換生長培養基并將細胞在37℃、5％O₂下再培養68至72小時。

本領域中已知初級干細胞培養的多種其它方法。舉例來說，可以使用Gronthos和Simmons 1995中描述的方法進行初級干細胞培養。

培養的干細胞表型上不同于體內細胞。其可以表達例如CD44。

在一個實施方案中，培養的干細胞在生物學上不同于體內細胞，具有較高的再生速率。

培養的干細胞可以在施用于受試者前低溫保存。舉例來說，表達升高水平Ang1的干細胞可以在施用于受試者前低溫保存。

未遺傳修飾的細胞

如本文所用，術語“未遺傳修飾”是指沒有通過用表達或編碼Ang1的核酸轉染而修飾的細胞。為了避免引起懷疑，在本公開的上下文中，用編碼Ang1的核酸轉染的干細胞將視為經遺傳修飾。在本公開的上下文中，“未遺傳修飾”的細胞在某種程度上天然地表達Ang1。

Ang1和/或VEGF的表達

表達升高水平Ang1的干細胞未經遺傳修飾并表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的Ang1。然而，在不同的實施方案中，設想表達升高水平Ang1的干細胞可以表達至少0.2μg/10⁶個細胞、0.3μg/10⁶個細胞、0.4μg/10⁶個細胞、0.5μg/10⁶個細胞、0.6μg/10⁶個細胞、0.7μg/10⁶個細胞、0.8μg/10⁶個細胞、0.9μg/10⁶個細胞、1μg/10⁶個細胞、1.1μg/10⁶個細胞、1.2μg/10⁶個細胞、1.3μg/10⁶個細胞、1.4μg/10⁶個細胞、1.5μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.2μg/10⁶個細胞至約1.5μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.3μg/10⁶個細胞至約1.4μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.4μg/10⁶個細胞至約1.3μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.5μg/10⁶個細胞至約1.2μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.55μg/10⁶個細胞至約1.1μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.6μg/10⁶個細胞至約1.0μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.65μg/10⁶個細胞至約0.9μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.7μg/10⁶個細胞至約0.8μg/10⁶個細胞的量的Ang1。

在另一方面，表達升高水平的Ang1的未遺傳修飾的干細胞表達少于約0.01μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在另一方面，表達升高水平Ang1的未遺傳修飾的干細胞表達少于約0.05μg/10⁶個細胞的量的VEGF。然而，在不同的實施方案中，設想表達升高水平Ang1的干細胞可以表達少于約0.05μg/10⁶個細胞、0.04μg/10⁶個細胞、0.03μg/10⁶個細胞、0.02μg/10⁶個細胞、0.01μg/10⁶個細胞、0.009μg/10⁶個細胞、0.008μg/10⁶個細胞、0.007μg/10⁶個細胞、0.006μg/10⁶個細胞、0.005μg/10⁶個細胞、0.004μg/10⁶個細胞、0.003μg/10⁶個細胞、0.002μg/10⁶個細胞、0.001μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.001μg/10⁶個細胞至約0.1μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.0025μg/10⁶個細胞至約0.09μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.0075μg/10⁶個細胞至約0.08μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.01μg/10⁶個細胞至約0.07μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.02μg/10⁶個細胞至約0.06μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞表達至少0.02μg/10⁶個細胞至約0.05μg/10⁶個細胞的量的VEGF。

在干細胞的組合物或培養物中表達的細胞Ang1和/或VEGF的量可以通過本領域技術人員已知的方法測定。此類方法包括(但不限于)定量分析法，例如定量ELISA分析法。然而，應了解本公開的范圍不限于用于測定在表達升高水平Ang1的干細胞中表達的Ang1或VEGF的量或水平的任何特定方法。

在一個實例中，干細胞的組合物或培養物表達的Ang1或VEGF的水平由ELISA分析法測定。在此類分析法中，將來自干細胞培養物的細胞溶解產物添加到ELISA板的孔中。孔可以用針對Ang1或VEGF的初級抗體(單克隆或多克隆抗體)涂布。接著洗滌孔，接著與針對初級抗體的二級抗體(單克隆或多克隆抗體)接觸。二級抗體結合于適當的酶，例如辣根過氧化酶。接著可以培育孔，接著在培育期后洗滌。接著孔與結合于二級抗體的酶的適當底物(例如一種或多種色原)接觸。可以采用的色原包括(但不限于)過氧化氫和四甲基聯苯胺。添加底物后，將孔培育適當時間。培育結束后，將“中止”溶液添加到孔中以中止酶與底物的反應。接著測量樣品的光密度(OD)。樣品的光密度與含有已知量的Ang1或VEGF的樣品的光密度相關，以確定測試的干細胞培養物表達的Ang1或VEGF的量。

在另一方面，表達升高水平Ang1的未遺傳修飾的干細胞表達至少約2:1比率的Ang1:VEGF。然而，在不同的實施方案中，設想表達升高水平Ang1的干細胞可以表達至少約10:1、15:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、50:1比率的Ang1:VEGF。

本領域技術人員將顯而易見用于確定Ang1:VEGF表達比率的方法。在確定Ang1與VEGF表達比率的方法的一個實例中，Ang1和VEGF表達水平經由如以上所討論的定量ELISA定量。在此類實例中，在定量Ang1和VEGF的水平后，基于Ang1和VEGF的定量水平的比率可以表示為：(Ang1水平/VEGF水平)＝Ang1:VEGF比率。

細胞組合物

在本公開的一個實例中，干細胞呈組合物形式施用。在一個實例中，此類組合物包含藥學上可接受的載劑和/或賦形劑。

術語“載劑”和“賦形劑”是指通常用于本領域中，以促進活性化合物的存儲、施用和/或生物活性的物質組合物(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mac Publishing Company(1980))。載劑也可以減少活性化合物的任何不合需要的副作用。適合的載劑是例如穩定的，例如不能與載劑中其它成分反應。在一個實例中，在治療采用的劑量和濃度下載劑在接受者中不會產生顯著的局部或全身副作用。

適用于本公開的載劑包括通常使用的載劑，例如水、生理鹽水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩沖溶液、透明質烷和二醇是示例性液體載劑，特別是(等張時)用于溶液。適合的藥物載劑和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻谷、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。

在另一實例中，載劑是例如其中細胞生長或懸浮的培養基組合物。舉例來說，此類培養基組合物不會在其施用的受試者中誘發任何副作用。

示例性載劑和賦形劑不會不利地影響細胞的存活力和/或細胞減輕、預防或延遲代謝綜合癥和/或肥胖癥的能力。

在一個實例中，載劑或賦形劑提供緩沖活性以將細胞和/或可溶性因子維持在適合的pH值下，從而發揮生物活性，例如載劑或賦形劑是磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)。PBS代表一種有吸引力的載劑或賦形劑，因為其與細胞和因子最低限度地相互作用且允許細胞和因子快速地釋放，在這種情況下，本公開的組合物可以呈液體產生，例如通過注射直接施加到血流或組織或組織周圍或附近的區域中。

干細胞和/或其子代細胞也可以并入或埋入與接受者相容并降解成對接受者無害的產物的支架內。這些支架為待移植到受試者中的細胞提供了支持和保護。天然和/或合成的生物可降解支架是此類支架的實例。

多種不同的支架可以成功用于本公開的實施中。示例性支架包括(但不限于)生物可降解支架。天然的生物可降解支架包括膠原蛋白、纖維結合蛋白和層粘連蛋白支架。用于細胞移植支架的適合合成材料應能支持大規模細胞生長和細胞功能。此類支架也可以是可再吸收的。適合的支架包括聚乙醇酸支架，例如Vacanti等人,J.Ped.Surg.23:3-9 1988；Cima等人,Biotechnol.Bioeng.38:145 1991；Vacanti等人,Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所述；或合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一實例中，細胞可以在凝膠支架(例如來自Upjohn Company的Gelfoam)中施用。

本文所述的細胞組合物可以單獨或呈與其它細胞的混合物施用。不同類型的細胞可以在臨施用前或施用后立即與本公開的組合物混合，或其可以在施用前一起共培養一段時間。

在一個實例中，組合物包含有效量或治療或預防有效量的細胞。舉例來說，組合物包含約1×10⁵個具有升高Ang1水平的干細胞至約1×10⁷個具有升高Ang1水平的干細胞或約1×10⁶個具有升高Ang1的干細胞至約5×10⁶個具有升高Ang1的干細胞/公斤。

待施用的干細胞的確切劑量取決于多種因子，包括(但不限于)患者的年齡、體重和性別，所治療的疾病或病癥以及其程度和嚴重程度。

在一個實例中，低劑量的細胞施用于受試者。示例性劑量包括約0.1×10⁴至約0.5×10⁶個細胞/公斤之間，例如約0.1×10⁵至約0.5×10⁶個細胞/公斤之間，例如約0.5×10⁵至約0.5×10⁶個細胞/公斤之間，例如約0.1×10⁶至約0.5×10⁶個細胞/公斤之間，例如約0.2×10⁶或0.3×10⁶或0.4×10⁶個細胞/公斤。

舉例來說，可向受試者施用每公斤約0.1×10⁶、約0.2×10⁶、約0.3×10⁶、約0.4×10⁶、約0.5×10⁶個細胞。

在其它實例中，向受試者施用每公斤約0.6×10⁶、約0.7×10⁶、約0.8×10⁶、約0.9×10⁶、約1.0×10⁶、約1.1×10⁶、約1.2×10⁶、約1.3×10⁶、約1.4×10⁶個細胞。

在一個實例中，高劑量的細胞施用于受試者。示例性劑量包括至少約1.5×10⁶個細胞/公斤。舉例來說，高劑量包含約1.5×10⁶至約6×10⁶個細胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約5×10⁶個細胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約4×10⁶個細胞/公斤之間，例如約1.5×10⁶至約3×10⁶個細胞/公斤之間。舉例來說，高劑量包含約1.5×10⁶或約2×10⁶個細胞/公斤。舉例來說，高劑量包含約1.5×10⁶個細胞/公斤。舉例來說，高劑量包含約2×10⁶個細胞/公斤。舉例來說，高劑量包含約3×10⁶個細胞/公斤。

在其它實例中，向受試者施用每公斤約1.5×10⁶、約1.6×10⁶、約1.7×10⁶、約1.8×10⁶、約1.9×10⁶、約2.0×10⁶、約2.1×10⁶、約2.2×10⁶、約2.3×10⁶、約2.4×10⁶、約2.5×10⁶、約2.6×10⁶、約2.7×10⁶、約2.8×10⁶、約2.9×10⁶、約3.0×10⁶、約3.1×10⁶、約3.2×10⁶、約3.3×10⁶、約3.4×10⁶、約3.5×10⁶、約3.6×10⁶、約3.7×10⁶、約3.8×10⁶、約3.9×10⁶、約4.0×10⁶個細胞。

在其它實例中，向受試者施用每公斤約1.0×10⁸、約1.1×10⁸、約1.2×10⁸、約1.3×10⁸、約1.4×10⁸、約1.5×10⁸、約1.6×10⁸、約1.7×10⁸、約1.8×10⁸、約1.9×10⁸、約2.0×10⁸、約2.1×10⁸、約2.2×10⁸、約2.3×10⁸、約2.4×10⁸、約2.5×10⁸、約2.6×10⁸、約2.7×10⁸、約2.8×10⁸、約2.9×10⁸個細胞、約3.0×10⁸、約3.1×10⁸、約3.2×10⁸、約3.3×10⁸、約3.4×10⁸、約3.5×10⁸、約3.6×10⁸、約3.7×10⁸、約3.8×10⁸、約3.9×10⁸、約4.0×10⁸個細胞。

間質譜系前驅細胞或干細胞可占組合物細胞群體的至少約5％。在其它實例中，間質譜系前驅細胞或干細胞可占組合物細胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％。

表達CD44的干細胞可占組合物細胞群體的至少約5％。在其它實例中，表達CD44的干細胞可占組合物細胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％、至少約100％。

在一些實例中，細胞容納在一腔室內，該腔室不允許細胞離開到受試者循環中，然而，允許細胞分泌的因子進入循環。以此方式，可溶性因子可以通過允許細胞分泌因子到受試者循環中而施用于受試者。此類腔室可以同等地植入受試者中的部位以增加例如植入心臟中或心臟附近的可溶性因子的局部水平。

干細胞可以全身施用，例如通過靜脈內、動脈內或腹膜內施用。

間質譜系前驅細胞或干細胞也可以通過鼻內、肌肉內、關節內或心內施用來施用。

舉例來說，間質譜系前驅細胞或干細胞可以直接施用于疼痛或腫脹關節中。

在另一實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞經由冠狀動脈內輸注施用。舉例來說，間質譜系前驅細胞或干細胞可以施用左前降(LAD)動脈。

在另一實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞經由腎內輸注施用。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞可以呈單次劑量施用。

在一些實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞可以多劑量施用。舉例來說，至少2劑、至少3劑、至少4劑、至少5劑、至少6劑、至少7劑、至少8劑、至少9劑、至少10劑。

包含表達升高水平Ang1的干細胞的組合物可以低溫保存。干細胞的低溫保存可以使用本領域中已知的慢速冷卻法或‘快速’冷凍方案進行。在一個實例中，與解凍細胞相比，低溫保存方法維持低溫保存細胞類似的表型、細胞表面標記物和生長速率。

低溫保存的組合物可以包含低溫保存溶液。低溫保存溶液的pH值通常是約6.5至8。

在一個實例中，低溫保存溶液的pH值是約7.4。

低溫保存溶液可以包含無菌的非熱性等張溶液，例如PlasmaLyte 100mL PlasmaLyte含有526mg氯化鈉USP(NaCl)；502mg葡糖酸鈉(C₆H₁₁NaO₇)；368mg三水合乙酸鈉USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg氯化鉀USP(KCl)；和30mg氯化鎂USP(MgCl₂·6H₂O)。其不含抗微生物劑。用氫氧化鈉調整pH值。pH值是7.4(6.5至8.0)。

為了促進冷凍，通常將例如二甲亞砜(DMSO)等低溫保護劑添加到低溫保存溶液。理想地，低溫保護劑應對細胞和患者來說是無毒的，非抗原性、化學惰性，在解凍后存活率高并允許在不洗滌下移植。然而，最常使用的低溫防護劑DMSO展示一定細胞毒性。羥乙基淀粉(HES)可以用作DMSO的替代品或與DMSO組合，以降低低溫保存溶液的細胞毒性。

低溫保存溶液可以包含DMSO、羥乙基淀粉、人類血清組分和其它蛋白質填充劑中的一者或多者。在一個實例中，低溫保存的溶液包含約5％人類血清白蛋白(HSA)和約10％DMSO。低溫保存溶液可以進一步包含甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一者或多者。

低溫保存的組合物可以解凍并直接施用于受試者。或者，低溫保存的組合物可以解凍并在施用前使間質譜系前驅細胞或干細胞再懸浮于替代溶液中。

表達升高水平Ang1的干細胞以有效治療動物的疾病或病癥的量施用于動物。動物可以是哺乳動物，且哺乳動物可以是靈長類動物，包括人類和非人類靈長類動物。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞施用于人類。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞施用于人類。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞施用于患有糖尿病的受試者。

在一個實例中，表達升高水平Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病的基線HbA1c值超過約7％的受試者。舉例來說，表達升高水平的Ang1的干細胞可施用于患有II型糖尿病的基線HbA1c值超過約7.1％、約7.2％、約7.3％、約7.4％、約7.5％、約7.6％、約7.7％、約7.8％、約7.9％、約8.0％、約8.1％、約8.2％、約8.3％、約8.4％、約8.5％、約8.6％、約8.7％、約8.8％、約8.9％、約9.0％的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞可施用患有II型糖尿病的基線HbA1c值大于或等于約8.0％的受試者。

本領域普通技術人員將顯而易見用于確定HbA1c值(總血紅蛋白％)的方法。用于確定HbA1c值(總血紅蛋白％)的方法的實例包括高效液體色譜法(HPLC)或免疫分析法。本領域普通技術人員也將意識到HbA1c值可以表示為其它值，例如mmol/mol。

在一個實例中，通過HPLC測定受試者HbA1c值。

在一個實例中，通過免疫分析法測定受試者HbA1c值。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病的受試者，其中受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病的受試者，其中二甲雙胍或二甲雙胍加另一口服治療劑對受試者的葡萄糖水平的控制不足。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有慢性腎病的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有糖尿病性腎病的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病和慢性腎病的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有II型糖尿病和糖尿病性腎病的受試者。

估計腎小球濾過率(eGFR)用以篩選和檢測早期腎損害和監測腎狀態。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于基線eGFR超過約35ml/min/1.73m²、約34ml/min/1.73m²、約44ml/min/1.73m²、約32ml/min/1.73m²、約31ml/min/1.73m²、約30ml/min/1.73m²、約29ml/min/1.73m²、約28ml/min/1.73m²、約27ml/min/1.73m²、約26ml/min/1.73m²、約25ml/min/1.73m²的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于具有腎功能階段3A、3B、4或5的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于具有腎功能階段3B的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于受試者

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于基線eGFR大于或等于30ml/min/1.73m²的受試者。

本領域普通技術人員將顯而易見用于估計GFR的方法并例示于下文中。可以使用肌酸酐和/或胱抑素C水平計算eGFR。

舉例來說，可以使用MDRD等式計算eGFR：

GFR(mL/min/1.73m²)＝175×(S_cr)^-1.¹⁵⁴×(Age)^-0.²⁰³×(女性0.742)×(非裔美國人1.212)

在其它實例中可以使用CKD-EPI等式計算eGFR(Levey等人Ann Intern.Med.150(9),604-12,2009)；

GFR＝141×min(S_cr/κ,1)^α×max(S_cr/κ,1)^-1.209×0.993^Age×1.018[女性]×1.159[黑人]

其中；

S_cr為血清肌酸酐，以mg/dL為單位，

κ對于女性為0.7，且對于男性為0.9，

α對于女性為-0.329，且對于男性，為-0.411，

min指示S_cr/κ或1的最小值，以及

max指示S_cr/κ或1的最大值。

eGFR也可以隨著時間推移不斷地計算和監測，以確定eGFR是下降還是提高。可以在對照組與處理組之間比較eGFR以鑒別在處理組中是否抑制eGFR的下降。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有關節炎的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有類風濕性關節炎的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有類風濕性關節炎的分類為不完全抗TNFα反應者的受試者。

在一個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有類風濕性關節炎的類風濕性關節炎生物療法失效的受試者。

在兩個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有類風濕性關節炎的兩種類風濕性關節炎生物療法失效的受試者。

在兩個實例中，表達升高水平的Ang1的干細胞施用于患有類風濕性關節炎的三種類風濕性關節炎生物療法失效的受試者。

TNF-α、IL-6、IL-17的抑制

TNF-α、IL-6和IL-17是被稱為細胞因子的化學信使。這些分子回應于多種信號從細胞釋放。在本發明的上下文中，術語‘抑制(inhibit或inhibiting)’是指例如蛋白質(例如細胞因子)等物質或過程(例如細胞分化或細胞極化)的可測量水平的減少或遏制。

因此，在一個實例中，設想施用包含表達升高水平的Ang1的干細胞的細胞組合物將降低受試者中TNF-α、IL-17和/或IL-6的可測量水平。在此實例中，抑制TNF-α、IL-17和/或IL-6從細胞釋放。

在一個實例中，本公開涉及一種監測受試者對施用表達升高水平的Ang1的干細胞的反應的方法。在此實例中，可以在施用表達升高水平的Ang1的干細胞后的一段時間內監測水平或例如細胞因子等促炎性和/或消炎標記物。

在一個實例中，本公開涉及一種在施用表達升高水平的Ang1的干細胞后監測受試者反應的方法，所述方法包括：評估從已經施用表達升高水平的Ang1的干細胞的受試者獲得的例如全血樣品等樣品中發炎和/或消炎標記物的水平；以及基于促炎性和/或消炎標記物的水平，確定受試者是否對施用表達升高水平的Ang1的干細胞作出反應。

在一個實例中，消炎標記物水平增加和/或發炎標記物水平下降表明受試者對施用干細胞作出反應。

在一個實例中，發炎和/或消炎標記物是細胞或細胞群體。

在一個實例中，消炎細胞數目增加和/或發炎細胞數目下降指示受試者對施用干細胞作出反應。

在一個實例中，消炎細胞是Th2細胞、Treg細胞和/或M2型巨噬細胞。

在一個實例中，發炎細胞是Th17細胞和/或M1型巨噬細胞。

熟習此項技術者可以使用多種分析法，所述分析法可以用于確定發炎細胞數目是否已經降低和/或消炎細胞數目是否已經增加。

舉例來說，可使用基于流式細胞術的技術，例如熒光激活細胞分類術(FACS)，針對細胞表面標記物的表達來評估從全血樣品分離的細胞群體。

在一個實例中，CD14+單核細胞可以從獲自施用表達升高水平的Ang1的干細胞的受試者的全血樣品純化。可針對CD16、CD163和CD206表達評估單核細胞，以鑒別M1和M2型巨噬細胞的比例。可以隨著時間推移，評估多個樣品以確定M1型巨噬細胞數目是降低還是遞降，和/或M2型巨噬細胞水平是增加還是遞增。在一個實例中，相對于從施用干細胞前的受試者獲得的樣品(例如基線或治療前參考樣品)中M1和/或M2型巨噬細胞數目，評估M1和/或M2型巨噬細胞數目。

在另一實例中，評估的發炎和/或消炎標記物是細胞因子。

在一個實例中，發炎標記物是TNF-α、IL-17和/或IL-6。

在一個實例中，消炎標記物是IL-10。

熟習此項技術者可以使用多種分析法，所述分析法可以確定TNF-α、IL-17和/或IL-6水平是否已經降低或IL-10水平是否已經增加。在一個實例中，可以使用分光光度技術，例如Immulite化學發光免疫分析法，測定TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6濃度水平。在另一實例中，可以使用Luminex平臺，使用市售試劑盒(Millipore)，測量TNF-α、IL-17、IL-10和/或IL-6濃度水平。

在一個實例中，施用包含表達升高水平的Ang1的干細胞的細胞組合物將抑制巨噬細胞的TNF-α和/或IL-6釋放。熟習此項技術者可以使用多種方法，所述方法可以確定TNF-α和/或IL-6從巨噬細胞的釋放是否減少。舉例來說，巨噬細胞可以體外培養，并暴露于包含表達升高水平Ang1的干細胞的組合物或者適合對照。一段時間后，接著可以使用以上例示的方法評估TNF-α和/或IL-6釋放。接著暴露于包含表達升高水平的Ang1的干細胞的細胞組合物的細胞中TNF-α和/或IL-6水平可以與對照細胞中TNF-α和/或IL-6水平相比，以確定TNF-α和/或IL-6水平是否降低。

已經定義巨噬細胞的兩種不同極化狀態：經典活化(M1)的巨噬細胞表型或“M1型巨噬細胞”，和替代性活化(M2)的巨噬細胞表型或M2型巨噬細胞(Gordon和Taylor.,Nat.Rev.Immunol.5:953-964,2005；Mantovani等人,Trends Immunol.23:549-555,2002)。M1型巨噬細胞具有“促炎性”細胞因子型態(例如TNF-α、IL-6、IL-1-β、IL-12、IL-23)。而M2型巨噬細胞具有“消炎”細胞因子型態(例如IL-10)。在一個實例中，設想施用包含表達升高水平的Ang1的干細胞的細胞組合物將抑制M1型巨噬細胞的細胞因子釋放。在另一實例中，設想施用包含表達升高水平的Ang1的干細胞的細胞組合物將抑制M1型巨噬細胞的TNF-α和/或IL-6釋放。熟習此項技術者可以使用多種分析法，所述分析法可以確定M1型巨噬細胞的TNF-α、IL-6和/或其它細胞因子釋放是否減少。舉例來說，在上述體外分析法中使用M1型巨噬細胞。在此實例中，可以通過從全血樣品進行免疫選擇來純化CD14+單核細胞。

增加消炎細胞產生和/或功能

在一個實例中，本公開涉及一種增加受試者中消炎細胞產生和/或功能的方法，其通過施用表達升高水平的Ang1的干細胞。

術語“消炎細胞”在本公開的上下文中用以指在受試者中引發或介導消炎反應的細胞。“消炎細胞”可以直接作用于細胞群體或目標以指導消炎反應。或者，本公開涵蓋的消炎細胞可以表達或分泌作用于特定細胞群體或目標以指導消炎反應的例如細胞因子等因子。

消炎細胞的實例包括Th2細胞、Treg細胞和/或M2型巨噬細胞。

在一個實例中，本公開涉及一種增加受試者中Th2細胞、Treg和/或M2型巨噬細胞數目的方法，其通過施用表達升高水平的Ang1的干細胞。

在一個實例中，本公開涉及一種增加受試者中M2型巨噬細胞數目的方法，其通過施用表達升高水平的Ang1的干細胞。

在一個實例中，本公開的方法增加受試者中M2型巨噬細胞數目至總單核細胞群體的至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％。

在一個實例中，本公開的方法增加受試者中M2型巨噬細胞數目至總單核細胞群體的至少約10％。

在一個實例中，本公開的方法增加受試者中M2型巨噬細胞數目至總單核細胞群體的至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％。

本領域普通技術人員容易使用此項技術中已知的多種方法確定相對于受試者的總單核細胞群體的M2-巨噬細胞％。舉例來說，M2巨噬細胞可以基于其CD14和CD16以及例如CD163和CD206等其它標記物的表達來確定。

在此實例中，可以從受試者獲得全血樣品，可以經由FACS基于CD14的表達免疫選擇細胞。接著可以針對CD16、CD163和CD206的表達評估CD14+細胞。CD14+CD16+CD163+CD206+的比例可以相對于樣品中總CD14+細胞群體計算。

在一個實例中，增加受試者中消炎細胞的產生和/或功能引起：

-受試者中IL-6水平降低；

-受試者中TNF-α水平降低；和/或

-受試者中IL-10水平增加。

在另一實例中，本公開的方法是一種促進巨噬細胞從M1極化成M2表型的方法。

舉例來說，本公開提供了一種促進有需要的受試者中M1型巨噬細胞極化成M2型巨噬細胞的方法，所述方法包括向所述受試者施用包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的血管生成素-1(Ang1)。

在此實例中，CD14+CD16+細胞、CD14++CD16+細胞、CD14+CD16+CD163+細胞、CD14++CD16+CD163+細胞、CD14+CD16+CD206+細胞、CD14++CD16+CD206+細胞、CD14+CD16+CD163+CD206+細胞、CD14++CD16+CD163+CD206+細胞、CD14+CD163+細胞、CD14++CD163+細胞、CD14+CD206+細胞、CD14++CD206+細胞、CD14+CD163+206+細胞、CD14++CD163+CD206+細胞產生或數目增加、IL-6水平降低、TNF-α水平降低和/或IL-10水平增加可以指示已經促進M1型巨噬細胞極化成M2型巨噬細胞。

相反地，在另一實例中，本公開提供了一種抑制M2型巨噬細胞極化成M1型巨噬細胞的方法。

在另一實例中，本公開提供了一種抑制有需要的受試者中M1型巨噬細胞產生和/或功能的方法，所述方法包括向受試者施用包含未遺傳修飾的干細胞的組合物，其中所述未遺傳修飾的干細胞表達升高水平的血管生成素-1(Ang1)。

治療方法

本公開涉及一種治療發炎性疾病的方法。

如本文所用，術語“發炎性疾病”涵蓋包括(但不限于)以下的疾病：瘙癢、皮膚發炎、牛皮癬、多發性硬化、類風濕性關節炎、骨關節炎、全身性紅斑狼瘡、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroidis)、重癥肌無力、I型或II型糖尿病、糖尿病性腎病、哮喘、發炎性肺損傷、發炎性肝損傷、發炎性腎小球損傷、異位性皮炎、變應性接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎、脂溢性皮炎、休格連氏綜合癥(Sjoegren's syndrome)、角膜結膜炎、葡萄膜炎、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、關節、皮膚或肌肉發炎性疾病、急性或慢性發炎性關節炎、肌炎、髓鞘脫失病、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、間質性腎炎和慢性活動型肝炎。

在一個實例中，本公開的方法治療的發炎性疾病是糖尿病。在另一實例中，發炎性疾病是糖尿病相關病狀或癥狀。在此實例中，可以治療的癥狀包括：異常傷口愈合、與心臟病發作相關的癥狀(例如胸痛)、與中風相關的癥狀、周圍血管疾病癥狀、截肢、腎病、腎衰竭、失明、神經病、發炎、性交不能或非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

舉例來說，本公開的方法治療的發炎性疾病是類風濕性關節炎。

舉例來說，本公開的方法治療的發炎性疾病是糖尿病性視網膜病。

在一個實例中，本公開涉及一種治療糖尿病的方法。

在一個實例中，本公開涉及一種治療II型糖尿病的方法。

在一個實例中，本公開涉及一種治療糖尿病性腎病的方法。

在一個實例中，本公開涉及一種治療類風濕性關節炎的方法。

如本文所用，應了解術語“治療(treat或treatment或treating)”意指施用治療有效量的細胞。在本公開的上下文中，術語“細胞的治療有效量”是指細胞有效預防、改善或治療發炎性疾病或病癥的量。此類有效量一般將改善發炎性疾病或病癥的征象、癥狀和/或其它指示物。舉例來說，在糖尿病中，有效量的細胞可降低HbA1c值、降低例如IL-6和/或TNF-α等細胞因子水平、降低空腹胰島素和/或增加脂肪細胞因子水平。

舉例來說，在類風濕性關節炎中，有效量的細胞可以實現ACR20、ACR 50和/或ACR70、降低例如IL-6等細胞因子水平和/或降低疾病活性評分。

舉例來說，在糖尿病性腎病中，有效量的細胞可以抑制eGFR或mGFR下降、改善eGFR或mGFR和/或降低例如IL-6等細胞因子水平。

在糖尿病或其相關病狀或癥狀的上下文中，熟習此項技術者可以使用多種常規臨床分析法，所述分析法可以用于確定HbA1c值降低、空腹胰島素降低和/或脂肪細胞因子水平增加。舉例來說，血液樣品一般將從受試者獲得，接著進行免疫分析法以檢測HbA1c、胰島素和脂肪細胞因子水平。

細胞培養方法

在一個實施方案中，產生表達升高水平Ang1的干細胞的方法包括：在細胞培養基中培養干細胞群體，其中所述細胞培養基含有短效L-抗壞血酸衍生物，但不含有大量的長效L-抗壞血酸衍生物；和/或補充少于10％v/v胎牛血清。

術語“培養基(media)”或“培養基(medium)”在提及細胞培養時使用時包括細胞周圍環境的組分。設想培養基促成和/或提供足夠誘導Ang1表達的表達的條件。培養基可以是固體、液體、氣體或各相和物質的混合物。培養基可以包括液體生長培養基以及不保持細胞生長的液體介質。培養基還包括凝膠狀培養基，例如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原蛋白基質。示例性氣體培養基包括在皮式培養皿(petri dish)或其它固體或半固體支撐物上生長的細胞所暴露的氣相。術語“培養基”還指意圖用于細胞培養中，即使尚未與細胞接觸的物質。

用于產生表達升高水平Ang1的干細胞的方法中的培養基可以通過使用用于培養干細胞的培養基作為基礎培養基來制備。基礎培養基包括例如伊格爾最低必需(MEM)培養基、α改性MEM培養基和其混合培養基，且不特別限制，只要其可以用于培養干細胞即可。

此外，培養基可以含有例如脂肪酸或脂質、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、緩沖劑、無機鹽等任何組分。

細胞培養基還可以含有所有必需氨基酸且還可以含有非必需氨基酸。一般說來，氨基酸分為必需氨基酸(Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、His)和非必需氨基酸(Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg、Pro)。

抗壞血酸是多種細胞在培養時生長和分化的必需補充物。現在了解特定的抗壞血酸衍生物是“短效”的，因為其在溶液中不穩定，尤其是在中性pH值和37℃的正常細胞培養條件下。這些短效衍生物迅速氧化成乙二酸或蘇糖酸。在培養基(pH 7)中在37℃下，在24小時內氧化使這些短效抗壞血酸衍生物的水平降低大約80％-90％。因此，在多種細胞類型的常規細胞培養中，短效抗壞血酸衍生物已經替換成更穩定的“長效”抗壞血酸衍生物。

在本公開的上下文中，術語“短效”涵蓋在中性pH值和37℃的培養條件下24小時細胞培養后氧化大約80％-90％的抗壞血酸衍生物。在一個實例中，短效L-抗壞血酸衍生物是L-抗壞血酸鹽。舉例來說，在本公開的上下文中，L-抗壞血酸鈉鹽是“短效”抗壞血酸衍生物。

相比之下，術語“長效”涵蓋在中性pH值和37℃的培養條件下24小時細胞培養后未氧化大約80％-90％的抗壞血酸衍生物。在一個實例中，在本公開的上下文中，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽是“長效”抗壞血酸衍生物。長效抗壞血酸衍生物的其它實例包括四己基癸基抗壞血酸酯、抗壞血酸磷酸鎂和2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸。

在一個實例中，用于產生表達升高水平Ang1的干細胞的方法中的細胞培養基補充短效抗壞血酸衍生物。舉例來說，細胞培養基可以含有至少約0.005g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有至少約0.01g/L的短效抗壞血酸衍生物。舉例來說，細胞培養基可以含有至少約0.02g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有至少約0.03g/L的短效抗壞血酸衍生物。舉例來說，細胞培養基可以含有至少約0.04g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有至少約0.05g/L的短效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有至少約0.06g/L的短效抗壞血酸衍生物。在此實施方案的一個實例中，細胞培養基補充L-抗壞血酸鈉鹽。

在另一實例中，細胞培養基含有短效抗壞血酸衍生物，但不含有大量的長效抗壞血酸衍生物。舉例來說，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過0.04g/L的長效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過0.03g/L的長效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過0.02g/L的長效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過0.01g/L的長效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不超過0.005g/L的長效抗壞血酸衍生物。在另一實例中，細胞培養基可以含有短效抗壞血酸衍生物，但不含長效抗壞血酸衍生物。

在另一實例中，細胞培養基含有L-抗壞血酸鈉鹽，但不含有大量的L-抗壞血酸-2-磷酸鹽。

用于產生表達升高水平Ang1的干細胞的方法中的細胞培養基可以是含血清的培養基或無血清的培養基。

培養基可以含有或不含有血清替換品。血清替換品可以是例如白蛋白(例如富含脂質的白蛋白)、轉鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇或3'-硫醇甘油或適當含有血清同等物的替換品。此類血清替換品可以例如通過國際公布WO 93/30679中描述的方法制備，且也可以使用市售產品。

在一個實例中，用于產生表達升高水平Ang1的干細胞的方法中的細胞培養基補充至少約9％v/v、至少約8％v/v、至少約7％v/v、至少約6％v/v、至少約5％v/v、至少約4％v/v、至少約3％v/v、至少約2％v/v、至少約1％v/v FCS。還設想在本公開的上下文中術語胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)可以互換使用。

在一個實施方案中，細胞培養基補充非胎兒血清。設想培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v非胎兒血清。

舉例來說，培養基可以補充哺乳動物非胎兒血清。

舉例來說，培養基可以補充人類非胎兒血清。

舉例來說，培養基可以補充新生血清。設想培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v新生血清。

在一個實施方案中，細胞培養基補充哺乳動物新生血清。

舉例來說，培養基可以補充新生牛血清(NBCS)。設想培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v NBCS。

在一個實施方案中，細胞培養基補充人類新生血清。

舉例來說，細胞培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v人類新生血清。舉例來說，人類新生血清從臍帶血“臍帶血”獲得。

在一個實施方案中，培養基補充成年血清。設想培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v成年血清。

在一個實施方案中，細胞培養基補充哺乳動物成年血清。

舉例來說，細胞培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v哺乳動物成年血清。

舉例來說，細胞培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v成年牛血清。

在一個實施方案中，細胞培養基補充成人血清。

舉例來說，細胞培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v成人血清。

舉例來說，細胞培養基可以補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v人類AB血清。

在一個實例中，細胞培養基補充至少約3％人類AB血清。

在一個實施方案中，培養基補充FCS與NBCS的混合物。

舉例來說，培養基可以補充FCS與NBCS的混合物，使得FCS:NBCS比率為至少約0.4:1、至少約0.5:1、至少約0.6:1、至少約0.7:1、至少約0.8:1、至少約0.9:1、至少約1:1、至少約1.5:1、至少約2:1。

舉例來說，設想FCS與NBCS的混合物可以占細胞培養基的至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％、至少約10％、至少約11％、至少約12％、至少約13％、至少約14％、至少約15％、至少約16％、至少約17％、至少約18％、至少約19％、至少約20％、至少約21％、至少約22％、至少約23％、至少約24％、至少約25％v/v。然而，在此實例中，細胞培養基補充至少約1％v/v、至少約2％v/v、至少約3％v/v、至少約4％v/v、至少約5％v/v、至少約6％v/v、至少約7％v/v、至少約8％v/v、至少約9％v/v，但少于10％v/v FCS。

在一個實施方案中，細胞培養基無FCS血清。

在一個實施方案中，細胞培養基無胎兒血清。

在一個實施方案中，細胞培養基補充非胎兒血清。

在一個實施方案中，細胞培養基無胎兒血清且補充非胎兒血清。

在另一個實施方案中，細胞培養基補充一種或多種選自由以下組成的組的刺激因子：1α,25-二羥基維生素D3(1,25D)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和基質衍生因子1α(SDF-1α)。在另一個實施方案中，細胞也可以在足夠支持細胞生長的量的至少一種細胞因子存在下培養。

在另一個實施方案中，細胞在足夠支持細胞生長的量的血小板細胞溶解產物存在下培養。舉例來說，細胞可以在足夠支持細胞生長的量的人類血小板細胞溶解產物中培養。

在一個實例中，細胞用足夠支持細胞生長的量的人類AB血清和人類血小板細胞溶解產物培養。

本領域普通技術人員還可以使用以下例示的方法產生表達升高水平的Ang1的干細胞。

分析細胞的治療/預防潛能

本領域技術人員將顯而易見用于測定表達升高水平Ang1的干細胞治療或預防或延遲病癥發作或進展的能力的方法。舉例來說，可以評估干細胞增加Ang1水平的能力。

在一個實例中，測試表達至少0.1μg/10⁶個細胞的量的Ang1的未遺傳修飾的干細胞在體外和/或體內增加Ang1表達的能力。在這些實例中，在施用表達升高水平Ang1的干細胞后評估細胞或組織的Ang1表達的發展。

熟練技工從上述將顯而易見，本公開還提供了一種鑒別或分離細胞用于治療、預防或延遲病癥的方法，所述方法包括：

(i)向罹患相關病癥的受試者施用表達升高水平Ang1的干細胞并評估受試者的病癥的癥狀；

(ii)將(i)中受試者病癥的癥狀與罹患病癥的尚未施用干細胞的對照受試者的病癥癥狀或活性比較，其中與對照受試者比較，測試受試者中癥狀的改善表明干細胞治療所述病癥。細胞可以是本文根據任何實例所述的任何細胞。

實施例

實施例1：通過選擇STRO-3⁺細胞進行MPC免疫選擇

骨髓(BM)是從健康的正常成年志愿者(20-35歲)收獲。簡單地說，從髂后嵴吸出40ml BM到含有肝素鋰抗凝劑的管中。

如先前描述(Zannettino等人Blood,92:2613-2628,1998)，通過使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行密度梯度分離來制備骨髓單核細胞(BMMNC)。在400×g下在4℃下離心30分鐘后，用移液管去除血沉棕黃層，并在由含有5％胎牛血清(FCS,CSL Limited,Victoria,Australia)的漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)構成的“HHF”中洗滌三次。

隨后通過如先前描述的磁性活化細胞分類(Gronthos等人,Journal of Cell Science116:1827-1835,2003；Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995)來分離STRO-3⁺(或TNAP⁺)細胞。簡單地說，大約1-3×10⁸BMMNC在由含10％(v/v)正常兔血清的HHF組成的阻斷緩沖液中在冰上培育20分鐘。將細胞與200μl 10μg/ml STRO-3mAb于阻斷緩沖液中的溶液一起在冰上培育1小時。隨后細胞在HHF中通過在400×g下離心洗滌兩次。添加HHF緩沖液中山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)的1/50稀釋液并將細胞在冰上培育1小時。將細胞在MACS緩沖液(補充1％BSA、5mM EDTA和0.01％疊氮化鈉的無Ca²⁺和Mn²⁺的PBS)中如上洗滌兩次并再懸浮于0.9ml最終體積的MACS緩沖液中。

將100μl抗生蛋白鏈菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加到細胞懸浮液中并在冰上培育15分鐘。將細胞懸浮液洗滌兩次并再懸浮于0.5ml MACS緩沖液中，且隨后負載到微型MACS柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，且用0.5ml MACS緩沖液洗滌三次，以收回不結合STRO-3mAb(以寄存編號PTA-7282于2005年12月19日寄存在美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)-參見國際公布WO 2006/108229)的細胞。添加另外1ml MACS緩沖液后，將柱從磁體去除并通過正壓分離TNAP⁺細胞。來自各洗脫份的細胞的等分試樣可以用抗生蛋白鏈菌素-FITC染色，并通過流式細胞術評估純度。

以此方式分離的MPC是STRO-1^亮MPC。

實施例2：起始培養基-過程A

具有厄爾平衡鹽(Earle’s balanced salt)的伊格爾氏最低必需培養基(MEM)的α改性通常稱為伊格爾氏αMEM，其含有非必需氨基酸、丙酮酸鈉和其它維生素。這些改性首次描述用于生長雜交小鼠和倉鼠細胞(Stanners等人,Nat New Biol.,230,52-54,1971)。

適于培養初級干細胞的伊格爾氏αMEM培養基可以從多種來源獲得，包括Life Technologies和Sigma。

建立初級干細胞培養物的詳細方法，包括用于例示過程中的所需生長因子，描述于Gronthos和Simmons,Blood,85,929-940,1995中。

在過程A中，補充10％胎牛血清、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(100μM)、地塞米松(10-7M)和/或無機磷酸鹽(3mM)的伊格爾氏αMEM培養基用于培養干細胞。

實施例3：改性培養基-過程B

在過程B中，通過以下，來改性用于過程A的伊格爾氏αMEM培養基(改性αMEM)：

-將長效抗壞血酸衍生物L-抗壞血酸-2-磷酸鹽替換成短效抗壞血酸衍生物L-抗壞血酸鈉(50mg/L)；

-FCS從10％v/v減少到5％v/v；

-補充非胎兒血清(5％v/v)。

表1：過程A與B之間的差異概述

實施例4：細胞培養

間質前驅細胞(MPC)是從單個供體獲得并在低溫保存后存儲。

一般地說，細胞培養涉及以下步驟：

將低溫保存的MPC解凍，以10,000個細胞/平方厘米接種，并在起始培養基(過程A；n＝3)或者改性培養基(過程B；n＝3)中在20％O₂、37℃下生長到90％匯合。

為了產生條件培養基，將生長培養基替換成補充FCS的EBM-2基礎培養基(Lonza)，體積是200μl培養基/平方厘米。將細胞再培養3天，接著收集培養基并離心，以去除任何細胞，并將所得上清液收集且存儲在-80℃下。

使用Luminex平臺，使用市售試劑盒(Millipore)測量生長因子濃度。

細胞培養后，評估MPC生長動力學(參見圖1-3)。在細胞培養過程A和B后，未觀測到細胞生長、MPC倍增時間或群體倍增時間顯著變化。

MPC還根據其細胞標記物STRO-1、CC9和STRO-4以及促血管生成生長因子Ang1和VEGF的表達水平進行表征。

在細胞培養過程A和B后，MPC中STRO-1、CC9和STRO-4水平是可比的。

然而，培養過程B：

-增加Ang1水平；

-減少VEGF水平；

-Ang1:VEGF比率與以前證明特別有效地加強血管形成的Ang1:VEGF比率一致。

在過程A或B中培養的MPC的條件培養基中Ang1和VEGF的水平(μg/10⁶個細胞)的測量展示于表2中。

表2：從單個供體(三個復制品)中獲得的MPC在過程A和B后的表征

實施例5：改性培養條件-過程C和D

為了控制長效抗壞血酸衍生物L-抗壞血酸-2-磷酸鹽替換成短效抗壞血酸衍生物L-抗壞血酸鈉，來自3個不同供體的MPC連續在α-MEM+10％FCS+50mg/L L-抗壞血酸鈉(過程C)或α-MEM+3％人類AB血清+50mg/L L-抗壞血酸鈉(過程D)+生長因子(例如PDGF和EGF)中增殖。

在過程C和D中細胞培養后評估Ang1和VEGF水平。在過程C或D中培養的MPC的條件培養基中Ang1和VEGF的水平(ug/10⁶個細胞)展示于表3中。

與過程C比較，培養過程D：

-增加Ang1水平；

-減少VEGF水平；

-增加Ang1:VEGF比率。

與過程A比較，過程C和D使Ang1的表達水平逐漸增加。此表明短效抗壞血酸衍生物和非胎兒血清的存在各獨立地增加Ang1表達且對增加Ang1表達一起展現協同效應。

表3：來自3個不同供體(三個復制品)的MPC在過程C和D后的表征

實例6：促炎性M1單核細胞極化成M2表型

從全血免疫選擇CD14+單核細胞。基于CD16表達表征單核細胞群體。5.2％細胞展現M2型巨噬細胞的表型特性(CD14⁺CD16⁺)(圖4)。

CD14+單核細胞與表達升高水平的Ang1的MPC共培養七天。從兩種獨立的供體(#023和#009)獲得MPC。

三天共培養后，針對以下，評估細胞：

-CD14、CD16表達；以及

-回應于脂多糖(LPS)的TNF-α分泌。添加1ng/ml LPS，歷時24小時(+輸送抑制劑，最終5小時)。

共培養引起：

-產生展現M2型巨噬細胞的表型特性的巨噬細胞(CD14⁺CD16⁺CD163⁺CD206⁺)(圖4)；

-預防巨噬細胞在發炎驅動下(LPS)分泌TNFα(圖5)。

共培養7天后，針對IL-10回應于LPS的分泌，評估細胞。添加1ng/ml LPS，歷時24小時(+輸送抑制劑，最終5小時)。通過細胞內流式細胞術分析IL-10表達。通過與MPC在LPS存在下共培養，增強巨噬細胞產生IL-10(圖6)。

這些數據表明表達升高水平的Ang1的MPC促進M2型巨噬細胞產生(圖7)。

表達升高水平的Ang1的干細胞與單獨或與TNF-α組合的遞增水平的IL-1β一起培養，以評估這些細胞因子對PGE2分泌的作用。

觀測到IL-1β和TNF-α對PGE2表達的累加效應(圖8)。

PGE2促進Th17細胞分化成Th2和TReg細胞以及M1型巨噬細胞極化成M2型巨噬細胞(圖7)。在患有例如II型糖尿病等發炎性疾病的受試者中觀測到升高的IL-1和TNF-α水平。

因此，回應于TNFα和IL1β，PGE2從表達升高水平的Ang1的干細胞分泌增加表明表達升高水平的Ang1的干細胞可以增加患有發炎性疾病的受試者中消炎細胞產生。具體地說，表達升高水平的Ang1的干細胞可以：

-通過促進M1型巨噬細胞極化成M2型巨噬細胞，增加M2型巨噬細胞產生；和/或

-通過促進Th17細胞分化增加Th2和Treg產生。

實例7：膠原蛋白誘發的關節炎的綿羊模型

表達升高水平的Ang1的干細胞施用于類風濕性關節炎的綿羊模型(Thorpe等人Clinical&Exp.Rheumatology,10:143-150(1992))。模型特征在于類風濕性關節炎的全身性和關節發炎表現。

1.5×10⁸個低溫保存的綿羊MPC經由頸靜脈靜脈內施用。

在兩周內評估IL-17和IL-10水平。促炎性和消炎細胞因子水平的變化展示在(圖9)中。

還在建立疾病后期(第42天)時施用表達升高水平的Ang1的干細胞。施用干細胞引起關節中發炎細胞因子的水平降低(圖10)。

實例8：糖尿病中干細胞施用

3劑間質前驅細胞(MPC)的單一靜脈內輸注與注射安慰劑對照的患有二甲雙胍或二甲雙胍加另一種口服藥劑控制不足的2型糖尿病的人類受試者比較。在12周內評估基線HbA1c、IL-6、TNF-α、空腹胰島素、脂肪細胞因子、骨鈣蛋白和hsCRP的變化。

受試者分成3組(圖11)：

組1：MPC劑量1(0.3×10⁶個細胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

組2：MPC劑量1(1.0×10⁶個細胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

組3：MPC劑量1(2.0×10⁶個細胞/公斤)[n＝15]或安慰劑[n＝5]

與安慰劑對照受試者中HbA1c略微增加比較，在MPC治療的受試者中，HbA1c略微降低(表4)。在第8周，與安慰劑對比，在組2中觀測到更大程度的HbA1c減少(表4)。在基線HbA1c值≥8％的受試者中觀測到更大程度的HbA1c減少的趨勢(圖15)。在第12周45名受試者中的八名(17.8％)實現目標HbA1c(<7.0％)(圖16)。

與安慰劑對照受試者比較，在MPC治療的受試者中觀測到空腹胰島素和脂肪細胞因子水平改善的趨勢(圖12)。與安慰劑對照受試者比較，在MPC治療的受試者中TNF-α和IL-6水平降低，在組3中觀測到最顯著的降低(圖13)。組3中，TNF-α(圖13)和IL-6(圖14)自基線的變化分別是-0.26pg/ml和-0.47pg/ml(圖13)。

表4：

隨訪獲得的基線HbA1c(％)和自基線的變化的概述。

值是與安慰劑的最小平方平均差(SE)

實例9：類風濕性關節炎中干細胞施用

單次靜脈內輸注2劑間質前驅細胞(MPC)與注射安慰劑對照的患有類風濕性關節炎的分類為不完全抗TNFα反應者的人類受試者或多達2種其它生物制劑失效的那些受試者相比。

試驗中包括的48名受試者是：+RF/抗CCP；>4個腫脹/觸痛關節；ESR/CRP>ULN。

受試者分成兩組：

組1：MPC劑量(1.0×10⁶個細胞/公斤)[n＝16]或安慰劑[n＝8]

組2：MPC劑量(2.0×10⁶個細胞/公斤)[n＝16]或安慰劑[n＝8]

輸注三個月后評估的終點包括：

-TNFα；IL-6(圖17)、IL-17；RANKL；MMP-1、MMP-3、MMP-9；TIMP-1、TIMP-2、TIMP-4和骨鈣蛋白水平。在第0、1、2、4、6、8和10周評估水平；

-ACR 20(圖18)/50(圖19)/70(圖20)；

-ACR核心組(圖21；圖22)；

-癥狀緩解(疾病活性評分(DAS28(CRP))<2.6)(圖23)；

-疾病活性評分自基線的變化(DAS28)；ESR/CRP；HAQ-DI(圖24)；SF-36(癥狀緩解DAS28(CRP)<2.6)；反應DAS28(CRP)<3.2；圖23)。

-在第6和第12個月手/腕x射線。

沒有與組1相關的治療相關嚴重不良事件(SAE)。在3個月內看到早期和持續功效。

在第1-12周，在組1中，與安慰劑比較，IL-6水平從基線減少(圖17)。

數據證明可高于其它生物制劑的約20％潛在癥狀緩解率(圖23)。

組1的十二周主要終點揭露了比安慰劑改善的反應的一致趨勢。

跟蹤中期分析證明作用在反應者中隨著時間推移持久。

組2進行更高單次劑量的測試。

實例10：糖尿病性腎病中干細胞施用

單次靜脈內輸注2劑間質前驅細胞(MPC)與注射安慰劑對照的患有2型糖尿病和中度至重度慢性腎病的人類受試者相比，所述人類受試者進行針對糖尿病性腎病的ACEi或ARB療法的穩定方案。

受試者分成兩組：

組1：MPC劑量1(1.5×10⁸個細胞/公斤)[n＝10]或安慰劑[n＝5]

組2：MPC劑量1(3.0×10⁸個細胞/公斤)[n＝10]或安慰劑[n＝5]

輸注后3個月和6個月評估的終點：

-測量GFR(mGFR[99Tc DTPA])(圖25)、估計GFR(eGFR[MDRD])(圖25)、IL-6(圖26)；和血清肌酸酐水平；

-IL-6與血清肌酸酐水平之間的相關性(圖27)。

在初始24周的研究時期內，相對于安慰劑，在MPC治療的受試者中，觀測到通過測量與估計GFR，保護或改善腎功能的趨勢：

-兩種MPC劑量的治療作用類似；

-在基線eGFR>30ml/min/1.73m²的受試者中MPC的治療作用更顯著(圖28)；

-在基線IL-6水平超過中位數的受試者中MPC的治療作用更顯著；

-基線IL-6水平與血清肌酸酐的MPC相關的改善之間顯著相關(圖27)；

-在MPC組中，對比安慰劑，第12周血清IL-6水平存在劑量依賴性變化(圖26)。

本領域技術人員應了解，在不脫離如廣泛描述的本公開的精神或范圍下，可對如特定實施方案中所示的公開內容進行許多改變和/或修改。因此，本發明的實施方案在各個方面都被認為是例示性而非限制性的。

本申請主張于2014年6月10日提出的AU 2014901294和2014年6月13日提出的AU 2014902257的優先權，其公開內容以引用的方式并入本文中。

本文中論述和/或提及的所有公布都整體并入本文中。

已經包括在本說明書內的文獻、法案、材料、裝置、論文等的任何論述都僅僅是為了提供本公開的背景。并不因為任何或所有這些內容在本申請的每個權利要求的優先權日前已存在而承認其形成現有技術基礎的一部分，或是與本公開有關的領域中的公知常識。