黃酮糖苷組合物的制作方法

本發明屬于藥物化學、藥理學與制劑領域，具體包括黃酮苷的組合物、制備、用途、制劑。

背景技術：
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黃杞葉為胡桃科黃杞屬植物黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wall.)的干燥葉。黃杞屬植物主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區，其中我國有8種，產于南方各省，我國廣東、廣西、海南、湖南、貴州等南方各省均有分布。多為喬木或灌木，資源豐富，可做園林綠化樹種。黃杞在廣西為民間藥，以樹皮和葉入藥。樹皮行氣化濕；葉可做茶飲，廣西等地已將黃杞葉代茶飲，名為羅漢茶。《廣西中藥材標準》1996年版收載，羅漢茶具有清熱解毒，生津止渴，解暑利濕的作用，可用于脾胃濕滯，胸腹脹悶，感冒發燒等癥狀。具有清熱解毒，生津止渴，解暑利濕的作用，可用于脾胃濕滯，胸腹脹悶，感冒發燒等的治療。

據文獻報道，黃杞葉中主要含有黃酮化合物，甾體類，三萜類等成分。已報道的化學成分有黃酮類化合物，黃酮醇類、二氫黃酮醇類及其苷。主要成分有花旗松素，5，7，4，-三羥基二氫黃酮，山奈酚，二氫山奈酚，槲皮素，異黃杞苷，黃杞苷，落新婦苷，異落新婦苷，山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷，5，7-二羥基色原酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，5-羥基-3，7，3′，4′-四甲氧基黃酮，槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，2-乙氧基胡桃醌，L-肌醇等。

黃杞葉中主要成分的生物學活性，以黃酮類成分的抗凝血，降脂，降糖，增強免疫力等作用最為引人注目。其主要成分之一，落新婦苷，具有多種顯著的生物活 性，包括抑制輔酶A還原酶，抑制醛糖還原酶，保護肝臟，鎮痛，消腫等。近年來有報道稱落新婦苷有顯著的選擇性免疫抑制作用，且它的選擇性作用與以往的免疫抑制劑相比具有明顯優勢，因此可以作為一種新的免疫抑制劑用于免疫相關疾病的治療。

然而，落新婦苷難溶于水，25℃時水溶解度僅為250μg/mL，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑，根據中國藥典規定屬于幾乎不溶或不溶范圍，因此落新婦苷不易被機體吸收代謝。研究表明，落新婦苷在大鼠體內的絕對生物利用度僅為0.066％，屬于口服吸收較差的化合物。目前解決的辦法為采取混懸液口服或用環糊精等輔料進行包合以提高水溶性。上述問題極大地限制了落新婦苷的藥物應用。

落新婦苷在C-2和C-3位上存在立體異構現象，分別有2(R)：3(R)(落新婦苷)、2(S)：3(S)(新落新婦苷)、2(S)：3(R)(新異落新婦苷)和2(R)：3(S)(異落新婦苷)四種順、反異構體。這四種立體異構體可以通過其查耳酮中間體而相互轉換，在自然界中同時存在。因此，本發明采用不同的提取分離工藝，將落新婦苷與其立體異構體新落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷從黃杞葉中同時提取分離出來，并篩選出水溶性良好的組合物，在此組合物的水溶液中，落新婦苷在水中的溶解度為25℃下大于8mg/mL，這大大改善了落新婦苷的水溶解性，從而提高了其生物利用度。

雖然文獻報道過關于黃杞葉對糖尿病的治療作用，但關于其作用機制并未進行深入的研究。而關于落新婦苷單體對糖尿病的作用機制，僅有涉及體外活性實驗的文獻進行過報道，例如，Haraguchi等研究發現落新婦苷及其苷元-花旗松素對醛糖還原酶及山梨糖醇的積累有抑制作用；Estrada等研究發現落新婦苷有抑制葡萄糖-6-磷酸酶作用等。但這些靶點并未成為成熟的糖尿病開發途徑。

回顧目前已經上市有明確糖尿病治療作用的口服藥物，類別主要有：磺脲類、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑、格列酮類、列汀類藥物。其中α-糖苷酶抑制劑可用于治 療II型糖尿病，其機理是延緩碳水化合物(糖的各種形式)在腸道內吸收，代表藥物是阿卡波糖(拜糖平)。雖然曾有文獻顯示黃杞葉有α-糖苷酶抑制活性，但并未對其中具體的有效成分進行詳細研究。

因此，本發明結合從黃杞葉中獲得的含落新婦苷及其立體異構體的組合物具備良好水溶性的特點，將不同分離提取工藝獲得的組合物以及落新婦苷和黃杞苷及其立體異構體進行了體外α-糖苷酶抑制活性篩選，獲得了優選的α-糖苷酶抑制活性的組合物。同時，本發明對優選組合物進行了超高效液相-質譜分析，得到該組合物的具體有效成分及其含量比例。結果顯示優選的組合物α-糖苷酶抑制活性明顯優于阿卡波糖(拜糖平)。

本發明將篩選出的優選組合物用于STZ(鏈脲佐菌素)所致的II型糖尿病小鼠模型。結果顯示，給藥16周后對于II型糖尿病小鼠的空腹糖耐量具有顯著改善的能力，其效果優于陽性藥物阿卡波糖(拜糖平)。

一系列的實驗證明，優選的黃酮糖苷組合物具備開發為有潛力治療II型糖尿病藥物的條件。

技術實現要素：
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本發明的目的在于提供一種黃酮糖苷組合物，其特征在于，含有新落新婦苷，落新婦苷，異落新婦苷，新異落新婦苷，新黃杞苷，黃杞苷，異黃杞苷，新異黃杞苷和山奈酚-3-O-鼠李糖苷，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷及其立體異構體。

上述的黃酮糖苷組合物，其特征在于，含有新落新婦苷(20.3％)，落新婦苷(23.4％)，異落新婦苷(14.5％)，新異落新婦苷(6.1％)，新黃杞苷(7.6％)，黃杞苷(12.1％)，異黃杞苷(6.2％)，新異黃杞苷(4.8％)，山奈酚-3-O-鼠李糖苷(2.3％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷及其立體異構體 (2.7％)。本含量采用基于高效液相色譜分析的面積歸一化法計算得到，檢測器為紫外檢測器，280nm。

上述黃酮糖苷組合物，其特征在于，將黃杞葉用水提取，并采用大孔樹脂純化。

本發明的另一目的在于提供上述黃酮糖苷組合物在制備糖尿病藥物中的應用。

黃杞葉藥材中的成分含量的測定

采集廣西產胡桃科黃杞屬植物黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wall.)的葉子，自然晾干，按照下列方法測定黃杞葉中總黃酮含量和落新婦苷的含量。

1、黃杞葉總黃酮的含量測定方法(紫外分光光度計法)

對照品溶液的制備：精密稱取落新婦苷標準品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL約含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取100g干燥黃杞葉，用粉碎機磨成細粉，取黃杞葉細粉約50mg，精密稱定，置50mL索氏提取器中，用50ml甲醇水浴50度加熱回流，回流提取2小時，將提取液轉移至50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液。

紫外分光光度測定法：分別取對照品溶液和供試品溶液，以甲醇為空白，用紫外分光光度計，在280nm波長處測定吸收度，計算得到黃杞葉總黃酮百分含量(％)。

2、黃杞葉落新婦苷成分的含量測定方法(超高效液相色譜測定法)

對照品溶液制備：同紫外分光光度法。

供試品溶液的制備：同紫外分光光度法。

色譜柱：C18色譜柱(100mm×2.1mm i.d.；1.7μm)。

色譜條件：流動相A，(0.1％甲酸)；流動相B，乙腈。梯度洗脫條件：0-3min，17-20％B，3-6min，30％B。流速，0.3mL/min；進樣體積，5μL。檢測波長，280nm；柱溫箱，40℃。

含量測定：稀釋落新婦苷標準品溶液為不同濃度，分別進樣測定，并繪制標準曲線，按照峰面積計算得到黃杞葉中落新婦苷百分含量(％)。

測定結果：本品按干燥品計，含總黃酮以落新婦苷(C₂₁H₂₂O₁₁)計算。本批黃杞葉含總黃酮為34.0％，其中落新婦苷含量為3.5％。

3、不同分離純化方法制備的黃杞葉黃酮糖苷組合物的篩選以及活性比較

純化方案一、50％乙醇提取大孔樹脂純化法

黃杞葉藥材粉碎后12倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時，合并兩次的提取液，減壓濃縮，濃縮到無醇，密度為1.0-1.10(60℃)上清液上HPD100大孔樹脂柱層析吸附，上樣流速為0.3倍柱體積/小時，樹脂充分吸附后，先用水洗脫至無α-萘酚陽性反應，然后用5倍柱體積的30-50％乙醇的洗脫溶液，洗脫流速為0.8倍柱體積/小時，合并收集的洗脫溶液，減壓濃縮至無醇，干燥，粉碎過篩60目真空干燥，得到黃杞葉50％乙醇提大孔樹脂提取物。

分別用紫外分光光度法和超高效液相法測定該提取物，總黃酮含量為84.1％，其中落新婦苷(2，56.9％)，異落新婦苷(3，4.7％)，新異落新婦苷(4，3.9％)，黃杞苷(6，23.8％)，新異黃杞苷(8，2.2％)，山奈酚-3-O-鼠李糖苷(9，3.5％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(10，0.9％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷異構體(11，4.2％)，見圖1。

純化方案二、甲醇提取大孔樹脂純化法

黃杞葉藥材切碎或粉碎后至20-60目，12倍量甲醇回流提取2次，每次2小時，合并兩次的提取液，減壓濃縮，濃縮到密度為1.0-1.2，靜置2-3h，離心，上清液上HPD100大孔樹脂柱層析吸附，上樣流速為0.3倍柱體積/小時，樹脂充分吸附后，先用水洗脫至無α-萘酚陽性反應，然后用5倍柱體積的30-50％乙醇的洗脫溶液，洗脫流速為0.8倍柱體積/小時，合并收集的洗脫溶液，減壓濃縮至無醇，干燥，粉 碎過篩60目真空干燥，得到黃杞葉甲醇提大孔樹脂純化物。

分別用紫外分光光度法和超高效液相法測定該提取物，總黃酮含量達93.6％，其中落新婦苷(2，59.8％)，異落新婦苷(3，3.1％)，新異落新婦苷(4，3.0％)，黃杞苷(6，23.6％)，新異黃杞苷(8，1.6％)，山奈酚-3-O-鼠李糖苷(9，3.6％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(10，0.7％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷異構體(11，4.7％)，見圖2。

純化方案三、水提取大孔樹脂柱純化法

將黃杞葉粉碎至20-60目，加12倍水，浸泡1-5h，100-150℃加熱回流提取2-4h，提取3次，所得提取液用四層紗布過濾，合并濾液。旋轉蒸發儀將濾液蒸干至原體積的1/10，冷凍干燥，得到棕褐色粉末狀樣品。

將水提物凍干粉用水配成1mg/mL溶液，按照1.0g粉末/mL樹脂的上樣量用弱極性或極性大孔樹脂(如：D-101、HPD-100、AB-8等)吸附，上樣流速為0.3倍柱體積/小時，樹脂充分吸附后，先用水洗脫至無α-萘酚陽性反應，然后用5倍柱體積的20％乙醇進行洗脫，最后用5倍柱體積的50％乙醇進行洗脫，洗脫流速為0.8倍柱體積/小時，收集50％乙醇的洗脫液，濃縮至無醇，冷凍干燥，粉碎過篩60目，即得。

分別用紫外分光光度法和超高效液相法測定該提取物，測得總黃酮含量達87％，其中新落新婦苷(1，20.3％)，落新婦苷(2，23.4％)，異落新婦苷(3，14.5％)，新異落新婦苷(4，6.1％)，新黃杞苷(5，7.6％)，黃杞苷(6，12.1％)，異黃杞苷(7，6.2％)，新異黃杞苷(8，4.8％)，山奈酚-3-O-鼠李糖苷(9，2.3％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(10，1.2％)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷異構體(11，1.5％)，見圖3。

25℃下不同提取分離方法獲得的有效部位的水溶性比較

按照《中國藥典》2010版關于溶解度的測定方法，分別將上述各提取物分別研成細粉，各精密稱取1g若干份。25℃下，分別置于1ml、10ml、30ml、100ml、1000ml的容量瓶中，水加至刻度，各每隔5min強力振搖30s，觀察30min內的溶解情況，如無目視可見的的溶質顆粒或液滴時，即視為完全溶解。極易溶解系指溶質1g(ml)能在溶劑不到1ml中溶解；易溶系指溶質1g(ml)能在溶劑1～不到10ml中溶解；溶解系指溶質1g(ml)能在溶劑10～不到30ml中溶解；略溶系指溶質1g(ml)能在溶劑30～不到10Oml中溶解；微溶系指溶質1g(ml)能在溶劑100～不到1000ml中溶解；極微溶解系指溶質1g(ml)能在溶劑1000～不到10 000ml中溶解；幾乎不溶或不溶系指溶質1g(ml)在溶劑10 000ml中不能完全溶解。結果如下表1：

表1不同提取分離方法獲得組合物溶解性比較

結果顯示，三種提取物的水溶解性依次為：水提大孔樹脂提取物＞50％乙醇提大孔樹脂提取物＞甲醇提大孔樹脂提取物。

不同提取分離方法獲得的組合物α-糖苷酶體外抑制活性比較

為進一步篩選良好生物活性和較好水溶性的組合物，我們對不同提取純化方法獲得的黃杞葉黃酮糖苷組合物進行α-糖苷酶抑制活性比較，以確定優選分離純化方案。

α-糖苷酶抑制活性試驗方法：使用底物對硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷(pNPG)，由α-糖苷酶水解釋放產生對硝基苯酚，在405nm下測定吸光度。分別取80μL的50％乙醇提大孔樹脂提取物、甲醇提大孔樹脂提取物、水提大孔樹脂提取物(10μg/ml) 溶液，用0.1M磷酸鹽緩沖劑(pH 6.8)與200μL的α-糖苷酶溶液(37U/ml)混合。阿卡波糖(1mg/ml)作為陽性對照。pH 6.8下酶反應條件最優。取空白試劑，0.1磷酸鹽緩沖劑(pH 6.8)，作空白對照。混合物在96孔板中，37℃，10分鐘持續的振動發生酶催化反應。反應后，取100μL的1mM pNPG溶液加到磷酸鹽緩沖劑(pH 6.8)中，在37℃下繼續反應。用酶標儀在405nm下連續檢測120分鐘，檢測每分鐘由pNPG中釋放的對硝基苯酚。結果，獲得0-120分鐘，不同提取物以及陽性對照和空白對照溶液中α-糖苷酶活性的測量曲線，以及曲線下面積(0-120分鐘)，計算得到α-糖苷酶抑制的百分比。結果如下表2：

表2三種提取物α-糖苷酶抑制率比較

由測定結果可見，三種提取物抑制α-糖苷酶的強弱如下：水提大孔樹脂提取物＞50％乙醇提大孔樹脂提取物＞甲醇提大孔樹脂提取物，其中水提大孔樹脂提取物的α-糖苷酶抑制活性最強。對比不同提取物的超高效液相色譜圖(圖1-3)，它們的化學成分主要差別在于落新婦苷或黃杞苷的其他異構體組成比例有明顯的不同。上述結果提示落新婦苷或黃杞苷及其異構體對α-糖苷酶的抑制活性有所不同，而落新婦苷或黃杞苷及其異構體組合后對α-糖苷酶抑制活性更高。

結合水溶解性試驗，故優選水提大孔樹脂提取純化法作為黃杞葉黃酮糖苷組合物的優化提取方法，將該方法制備的組合物作為黃杞葉優選黃酮糖苷組合物。

黃杞葉優選黃酮糖苷組合物成分的分析(超高效液相色譜-質譜法、核磁共振氫譜)

在以往的文獻報道中，研究者并未對黃杞葉中抑制α-糖苷酶的活性成分進行深 入的研究，對具體的活性成分也并未闡明。本發明深入研究了具有良好α-糖苷酶抑制活性的黃杞葉優選黃酮糖苷組合物，并進行了成分分析。

超高效液相色譜-質譜法采用Waters公司的UPLC/Q-TOF-MS液質聯用儀進行分析，包括Waters UPLC液相系統和Waters XevoG2 Q-TOF質譜。色譜柱：Waters Acquity UPLC BEHC18色譜柱(100mm×2.1mmi.d.；1.7μm)。色譜條件：流動相A，(0.1％甲酸)；流動相B，乙腈。梯度洗脫條件：0-3min，17-20％B；3-6min，30％B。流速，0.3mL/min；進樣體積，5μL。檢測波長，280nm；柱溫箱，40℃。質譜數據采集采用電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，利用MS^E方法在一針進樣同時采集母離子及子離子碎片信息。質譜條件如下：毛細管電壓3.0kV；錐孔電壓40V；離子源溫度120℃；去溶劑溫度450℃，錐孔氣體流速50L/h；去溶劑化氣體流速600.0L/h；MS1和MS2掃描范圍m/z 100-1500，7min；碰撞能量25-35V。使用Waters MassLynx v4.1軟件采集并分析數據。

經超高效液相-質譜分析(圖4)，與文獻報道結果對比后，色譜峰1-11分別鑒定為：新落新婦苷(1，C₂₁H₂₂O₁₁)，落新婦苷(2，C₂₁H₂₂O₁₁)，異落新婦苷(3，C₂₁H₂₂O₁₁)，新異落新婦苷(4，C₂₁H₂₂O₁₁)，新黃杞苷(5，C₂₁H₂₂O₁₀)，黃杞苷(6，C₂₁H₂₂O₁₀)，異黃杞苷(7，C₂₁H₂₂O₁₀)，新異黃杞苷(8，C₂₁H₂₂O₁₀)，山奈酚-3-O-鼠李糖苷(9，C₂₁H₂₀O₁₀)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(10，C₂₈H₂₆O₁₅)，花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷異構體(11，C₂₈H₂₆O₁₅)。

通過超高效液相色譜分析，本發明涉及黃杞葉黃酮糖苷組合物，其含有如下百分比的組分(百分含量％)：1.新落新婦苷(20.3％)，2.落新婦苷(23.4％)，3.異落新婦苷(14.5％)，4.新異落新婦苷(6.1％)，5.新黃杞苷(7.6％)，6.黃杞苷(12.1％)，7.異黃杞苷(6.2％)，8.新異黃杞苷(4.8％)，9.山奈酚-3-O-鼠李糖苷(2.3％)， 10.花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷(1.2％)，11.花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷異構體(1.5％)。

核磁共振氫譜法用Varian公司Mercury Plus 500MHz核磁共振儀，在25℃下、以氘代DMSO為溶劑，采集樣品的氫譜。通過對組合物的核磁共振氫譜分析，本發明涉及黃杞葉黃酮糖苷組合物，其有如下核磁共振氫譜特征，見圖5。

本提取物中主要的化學成分為二氫黃酮苷類化合物，另有少量的黃酮苷類成分，以及微量的未知成分。其中δ8.88-12.66的區域，主要是黃酮苷類成分的酚羥基上活潑氫的信號；δ5.86-7.75的區域，主要是黃酮苷元部分的芳香氫信號；δ3.01-5.47的區域，主要是二氫黃酮苷元部分的2位和3位氫信號以及糖上的氫信號；δ0.74-1.14的區域，主要是鼠李糖上6位甲基的氫信號。核磁共振氫譜結果進一步說明，該優選組合物的化學成分組成的主要特點：落新婦苷、黃杞苷為其中主要成分、另含山奈酚-3-O-鼠李糖苷、花旗松素-3-O-(3″-O-p-(E)-沒食子酰基)-α-L-鼠李糖苷等二氫黃酮鼠李糖苷以及其立體異構體等成分。

黃杞葉水提大孔樹脂提取物中立體異構體的制備及其α-糖苷酶抑制體外活性比較

為進一步明確組合物中不同異構體生物活性的差異，我們對水提大孔樹脂純化獲得的黃杞葉黃酮糖苷組合物中立體異構體進行了分離和制備，并對其α-糖苷酶抑制體外活性進行了比較，以進一步解釋不同方法提取物活性差異的原因。

黃杞葉黃酮糖苷組合物中立體異構體的制備：采用Agilent公司的1260 Infinity液相色譜儀進行制備。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(9.4mm×250mm，5μm)。色譜條件：流動相A，(0.1％甲酸)；流動相B，乙腈。梯度洗脫條件：0-34min，17％B，34-35min，17→35％B，35-40min，35％B。流速，4.0mL/min；進樣體積，80μL。檢測波長，280nm；柱溫，40℃。制備單體經超高效液相色譜 檢測純度均大于95％。

α-糖苷酶抑制活性試驗方法：采用上述方法測定組合物中不同異構體的α-糖苷酶抑制活性。結果如下表3：

表3組合物中不同異構體的α-糖苷酶抑制活性(IC₅₀值)

由測定結果得，落新婦苷的α-糖苷酶抑制活性較黃杞苷強。對比落新婦苷的四個異構體中，新落新婦苷活性最強；黃杞苷的四個異構體中，新黃杞苷活性最強。而新落新婦苷和新黃杞苷在水提大孔樹脂提取物中的含量顯著高于其在50％乙醇提大孔樹脂提取物和甲醇提大孔樹脂提取物中的含量。上述結果顯示黃杞葉經水提取后落新婦苷和黃杞苷異構體的含量發生明顯變化，α-糖苷酶抑制活性最強的新落新婦苷和新黃杞苷含量明顯增加，因此，這種組合物對α-糖苷酶的抑制活性更高。結合上述實驗結果，優選水提取大孔樹脂純化法作為黃杞葉黃酮糖苷組合物的優化提取方法，將該方法制備的組合物作為黃杞葉優選黃酮糖苷組合物。

黃酮糖苷組合物對II型糖尿病模型小鼠血糖的影響

為進一步驗證黃杞葉優選黃酮糖苷組合物對II型糖尿病血糖的影響，我們對黃杞葉優選黃酮糖苷組合物進行了相關藥理學研究。本發明采用高脂飼料和鏈脲佐菌 素(STZ)聯合誘導的II型糖尿病(C57/BL6J)近交系小鼠模型來進行藥理學研究。該動物模型與人體II型糖尿病的生理體征非常相似，較之傳統的四氧嘧啶模型、單純STZ更為穩定，且采用近交系小鼠，試驗數據重現性更好，近年來成為研究II型糖尿病的動物模型的主流。本發明是國內第一次采用此動物模型研究黃杞葉中的有效成分。

1實驗材料

1.1實驗動物

雄性C57/BL6J小鼠，體重18～22g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2藥品與試劑

試液配制

陽性藥：DPP4抑制劑沙格列汀、α糖苷酶抑制劑拜糖平，均以生理鹽水配制成目標劑量。

優選黃酮糖苷組合物的制備：參見純化方案三、水提取大孔樹脂柱純化法，

優選黃酮糖苷組合物高劑量(1g/kg)的配制：將上述方法得到的提取物，420mg+14ml用生理鹽水溶解，濃度30mg/ml，備用。每天每只0.2ml/10g體重進行灌胃給藥。

優選黃酮糖苷組合物中劑量(0.5g/kg)的配制：將上述方法得到的高劑量中取 6ml，用用生理鹽水定容到12ml即可，濃度15mg/ml，備用。每天每只0.2ml/10g體重進行灌胃給藥。

優選黃酮糖苷組合物低劑量(0.25g/kg)的配制：將上述方法得到的中劑量中取4ml，用用生理鹽水定容到8ml即可，濃度7.5mg/ml，備用。每天每只0.2ml/10g體重進行灌胃給藥。

檸檬酸緩沖液：檸檬酸緩沖液配制(pH4.4)：檸檬酸2.1g，檸檬酸鈉2.94g，分別用生理鹽水溶解定量至100ml，使其濃度均為0.1mM。取上述檸檬酸溶液65.1mL，檸檬酸鈉溶液54.9mL，充分混勻，用棕色瓶存儲于4℃冰箱備用。

STZ溶液：配制用的器具要滅酶，手術器械需要高溫處理，緩沖液等高壓濕熱滅菌。

1％STZ溶液配制：在避光、低溫(冰盒里面配制)、干燥環境中把0.2g鏈脲佐菌素溶于20mL檸檬酸緩沖液中，置于冰水浴中，30min內給動物注射完畢。參考文獻STZ腹腔注射劑量為120mg/Kg，120mg/Kg÷10mL/Kg＝12mg/mL。小鼠腹腔注射量為10mL/Kg。

1.3高脂飼料配方：

高脂飼料配方組成：豬油10％、蛋黃粉10％、膽鹽0.2％、膽固醇1％，其余成分為基礎飼料。

1.4飼養管理：

動物飼養在實驗動物中心SPF級動物房，動物飼養條件：5～6只/盒，群養，飼養溫度與濕度：20～25℃，40～70％，采用12h：12h晝夜間斷照明；自由進食飲水；基礎飼料、高脂飼料均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

每天灌胃時注意觀察動物糞便，打架情況，如有打架情況及時分離出打架的小鼠。

1.5主要儀器：

血糖儀瑞迪恩HL588E型

瑞迪恩血糖試紙瑞迪恩生物科技股份有限公司

全自動血生化分析儀日立7020型

2實驗方法

表4試驗分組表

各組動物按上面方案灌胃給藥(容量為20ml/kg)，每日1次，給予SPF級別飼料喂養，共12周，實驗動物于分組前給予禁食不禁水12小時血糖監測，依據體重、血糖水平分組，給藥后第12周進行OGTT實驗。

1試驗流程

動物適應性飼養4周后，禁食16h，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。當天測定完畢后，分正常組和模型組，正常組動物飼以普通維持期鼠料，模型組飼以前述高脂飼料，同時給予模型組注射STZ，120mg/Kg。每周記錄小鼠體重一次。

第5周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。

第6周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值，確定模型成立。然后將模型組平均分成6組，正常組和模型組給予注射用水，其余給予藥物。

第8周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。

第10周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。

第12周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。

第14周，禁食12小時，尾尖針刺取血直接于血糖儀上測定血糖值。

第16周，禁食12小時，尾尖針刺取血做OGTT(其余時間點測GLU，最末一時間點眼眶采血，測定全套血生化指標)，做出曲線及曲線下面積。

2檢測指標

觀察：從實驗開始至實驗結束，每天觀察并記錄小鼠的日常情況。

體重：從開始給藥到實驗結束，每周稱量小鼠體重1次。

3實驗結果

3.1給藥后小鼠體重變化

給藥后小鼠體重變化見表5。從表5可以看出，開始給藥之后，各組動物的體重與模型組相比較其差異沒有統計學意義。但拜糖平組與黃杞低劑量組的體重增長的平均值要高于模型組，可認為具有改善II型糖尿病小鼠生存質量的趨勢。

表5給藥后小鼠體重變化(g，n＝8)

各組均與模型組相比較，p＜0.1*，p＜0.05；**，p＜0.01

3.2給藥后小鼠空腹血糖變化

給藥后小鼠的空腹血糖變化結果見表6。從表6可以看出，從第5周也就是造模 開始之后，各組小鼠空腹血糖的均值均大于正常空腹血糖值的上限7.0，可認為模型已經成立。各組動物給藥前的基礎空腹血糖值經過按照血糖水平隨機分組之后，基本一致。當給藥至第9周時，沙格列汀組和黃酮糖苷組合物低劑量組的空腹血糖值均顯著低于模型組(p＜0.05)；第10周時，中劑量組的空腹血糖值顯著低于模型組(p＜0.05)；第12周時，高劑量組的空腹血糖值顯著低于模型組(p＜0.05)；第14周時，沙格列汀組和低劑量組的空腹血糖值均再次顯著低于模型組(p＜0.05)；第16周時，低劑量組的空腹血糖值再次顯著低于模型組(p＜0.05)。可認為黃酮糖苷組合物在低劑量水平下具有改善II型糖尿病小鼠空腹血糖水平的能力。該結果提示：黃酮糖苷組合物中、低劑量水平改善II型糖尿病小鼠空腹血糖水平的能力可能與拜糖平相當，略低于沙格列汀。

表6給藥后小鼠血糖變化(mmol/L，n＝8)

各組均與模型組相比較；*，p＜0.05；**，p＜0.01

3.3給藥16周后小鼠空腹糖耐量(OGTT)的變化

給藥16周后，各組小鼠的空腹糖耐量實驗結果見表7。從表7可以看出各組動物空腹糖耐量實驗的血糖曲線下面積(AUC)與模型組相比較，除空白對照組之外，其他的差異均沒有顯著性意義。但優選黃酮糖苷組合物的三個劑量呈現一定的量效 關系，提示其可能對II型糖尿病小鼠的胰島素抵抗具有一定緩解的趨勢。拜糖平與沙格列汀則沒有體現出這種趨勢。

3.4給藥16周后小鼠血生化水平的變化

給藥16周后小鼠的血生化水平見表8。表4結果提示，本實驗所建立的II型糖尿病模型對小鼠的肝、腎功能、血脂水平均存在一定的不利影響，優選黃酮糖苷組合物和兩個陽性對照組對此均沒有體現出明顯的改善效果。

表7給藥16周小鼠空腹糖耐量的結果(AUC，n＝8)

各組均與模型組相比較；*，p＜0.05；**，p＜0.01

表8第16周小鼠血生化變化(n＝8)

各組均與模型組相比較；*，p＜0.05；**，p＜0.01

4藥理實驗結論

優選黃酮糖苷組合物對于II型糖尿病小鼠的空腹血糖表現出一定的降低活性；給藥16周后對于II型糖尿病小鼠的空腹糖耐量具有顯著改善的活性，其效果優于陽 性受試物。以上結果提示，本發明的優選黃酮糖苷組合物可以作為一個有潛力的改善II型糖尿病的藥物。

經過上述研究，結果表明黃杞葉黃酮糖苷組合物可以作為一個有潛力的改善II型糖尿病的藥物。結合黃酮糖苷組合物的良好的水溶性，本發明將其制備成口服制劑，方便患者長期使用。經過研究，結果表明黃杞葉黃酮糖苷組合物可以作為一個有潛力的改善糖尿病的藥品、食品、保健食品或膳食補充劑。

附圖說明

圖1、黃杞葉50％乙醇提大孔樹脂提取物的超高效液相色譜圖

圖2、黃杞葉甲醇提大孔樹脂提取物的超高效液相色譜圖

圖3、黃杞葉水提大孔樹脂提取物的超高效液相色譜圖

圖4、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物1的高分辨質譜圖

圖5、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物2的高分辨質譜圖

圖6、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物3的高分辨質譜圖

圖7、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物4的高分辨質譜圖

圖8、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物5的高分辨質譜圖

圖9、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物6的高分辨質譜圖

圖10、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物7的高分辨質譜圖

圖11、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物8的高分辨質譜圖

圖12、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物9的高分辨質譜圖

圖13、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物10的高分辨質譜圖

圖14、黃杞葉黃酮糖苷組合物中化合物11的高分辨質譜圖

圖15、黃杞葉黃酮糖苷組合物的¹H-NMR圖譜

具體實施方式

經過上述研究，結果表明結合黃酮糖苷組合物的良好的水溶性，本發明將其制備成口服制劑，方便患者長期使用，黃杞葉黃酮糖苷組合物可以作為一個有潛力的改善II型糖尿病的藥物或者食品以及保健食品。。以下實施例用于闡述本發明而不是限制本發明。

實施例1

黃酮糖苷組合物15g；微晶纖維素75g；95％乙醇50ml；羥丙基纖維素15g；25％淀粉漿120ml；硬酸鎂5g，制粒，50℃真空干燥，30-100目篩整粒，壓成片劑；

實施例2

黃酮糖苷組合物15g；微晶纖維素75g；95％乙醇50ml；羥丙基纖維素15g；20％淀粉漿120ml；硬酸鎂5g，制粒，50℃真空干燥，60-100目篩整粒，灌膠囊；

實施例3

黃酮糖苷組合物15g；糊精20g；乳糖10g，25％淀粉漿120ml；糖粉20g；100目篩制粒，50℃干燥，14目篩整粒，分裝成袋；

實施例4

將黃酮糖苷組合物先制備成磷脂復合物，研細后過80目篩，并加入1％微晶纖維素和10％乳糖后過60目篩充分混勻，加入一定量的潤濕劑制成軟材，經擠出-滾圓造粒機制得濕微丸，在50℃條件下烘12h即可得干燥微丸。

實施例5

黃酮糖苷組合物15.0g；加入2.0g谷氨酸，加入10.0g甘露醇，加入純凈水，加熱溶解，稀釋至500ml，過濾、濾液超濾，分裝，得到口服液。

實施例6

黃酮糖苷組合物15g；50％乙醇50ml；糊精20g；乳糖10g，25％淀粉漿120ml；100目篩制速溶固體飲料顆粒，50℃干燥，14目篩整粒，分裝成袋。

實施例7

黃酮糖苷組合物15.0g；加入0.5g檸檬酸，加入1.0g麥乳精，加入10.0g甘露醇，加入純凈水，加熱溶解，稀釋至500ml，過濾、濾液超濾，分裝，得到可口的保健飲料。