艾滋病治療細胞器的制作方法

本發明涉及生物醫學領域中艾滋病治療細胞器，主要通過人工產業制備HIV敏感細胞，用于體外吞噬血漿中的游離的HIV，達到治療艾滋病的目的。

背景技術：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據世界衛生組織(WHO)和聯合國艾滋病規劃署的有關報告，自1981年美國發現首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區受到了艾滋病的嚴重威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠超過100萬。艾滋病已經成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關注的嚴重的公共衛生和社會問題。

HIV是感染人類免疫細胞的反轉錄病毒，直徑約120納米，大致呈球形，外膜是類脂包膜(來自宿主細胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結合，向內是由蛋白p17形成的球形基質(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分。

HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內某些部位的酸性環境，創造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內大量繁殖聚集。因為CD4是HIV的受體，所以經巨噬細胞內繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等)，在細胞內迅速增殖，每天產生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進入其他正常的和再生的CD4+細胞內復制，制造更多的病毒感染細胞，使外周血CD4+T細胞持續破壞、減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細胞，整個免疫系統就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失去抵抗力；HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現為長期潛伏而不表現出臨床癥狀，其基因組RNA反轉錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進入宿主細胞核內，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細胞基因組內，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數月甚至多年不復制，造成AIDS數月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結的巨噬細胞和樹突狀細胞內繁殖，這些細胞是體內的HIV貯存庫，可釋放至外周血或轉染外周血中的CD4+T細胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內轉錄復制。經大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液，然后再進入其他細胞繼續感染過程。

HIV感染后可刺激機體生產囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發揮應有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統所識別，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另一個很重要的原因是，根據抗體殺滅、清除抗原的機理，免疫性抗體與抗原結合后，要產生免疫效應，要么通過激活補體，介導ADCC效應溶解細胞性抗原，但HIV不是細胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬細胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細胞內被保護、增殖；要么抗體與抗原結合起中和作用，使失去感染力，但HIV無法被免疫系統殺滅、清除。

20世紀開始研究的血液凈化技術，是指把患者的血液引出體外并通過一種凈化裝置，除去其中某些致病物質，凈化血液，再回輸入體內，達到治療疾病的目的。早期的血液凈化常指血液透析技術，用于尿毒癥患者腎替代治療，隨著醫學的進步和血液凈化裝置的發展，在血液透析的基礎上派生出不同的血液凈化方式，如血漿置換、血液灌流、免疫吸附、血液濾過等。不同血液凈化技術的應用，大大改善了某些疑難復雜疾病的治療，主要應用血漿置換技術分離并清除大分子免疫復合物類致病因子以減輕、調節和治療某些免疫性疾病。20世紀80年代以來，浙大一院李蘭娟團隊開始運用血漿置換治療肝衰竭，取得了較好療效，并在此基礎上創立了非生物型、生物型、混合型人工肝支持系統，以及所涉及的人工肝透析器、血液濾過器、活性炭(樹脂)吸附器、生物反應器等人工肝支持系統部件的改良和創新。但未見以血液凈化技術清除HIV感染細胞及游離的HIV的報道。

目前艾滋病治療常用的抗病毒一線藥物是逆轉錄酶抑制劑，該藥不能殺滅HIV，存在個體差異、耐藥性、腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎、肝損傷等多種毒副作用，其他如HIV蛋白酶抑制劑、HIV整合酶抑制劑、細胞因子、疫苗治療、基因治療和單克隆抗體被動免疫療法等，均因為各種原因而難以普遍應用。有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑，大量培養艾滋病患者分離的T細胞后，作為自身治療性細胞回輸，但HIV也隨著HIV感染細胞的培養繁殖而在胞內增殖，增量T細胞的回輸也導致了增量HIV的回輸。

人類的吞噬細胞有大、小兩種，小吞噬細胞是外周血中的中性粒細胞，大吞噬細胞是血中的單核細胞和多種器官、組織中的巨噬細胞，兩者構成單核吞噬細胞系統。單核細胞由骨髓中的單核細胞前體發育分化而成，約占血液中白細胞總數的3％一8％，其體積較淋巴細胞略大，單核細胞在血液中僅停留12-24小時，然后進入結締組織或器官，發育成熟為巨噬細胞，巨噬細胞是單核吞噬細胞系統中高度分化、成熟的細胞類型，具有較強的吞噬功能，游走巨噬細胞大于單核細胞數倍，壽命較長，可在組織中存活幾個月，定居的巨噬細胞有不同的名稱，在肝中為枯否細胞、在腦中為小膠質細胞、在骨中為破骨細胞等，其表達Fc受體、C3b受體和CDl4，在固有免疫中發揮防御功能，也是參與適應性免疫的專職抗原提呈細胞。巨噬細胞表達的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內某些部位的酸性環境，創造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內大量繁殖聚集，轉而將HIV傳遞給CD4+T細胞。

綜上所述，巨噬細胞表達的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進入人體后，首先遭到巨噬細胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內某些部位的酸性環境，創造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內大量繁殖聚集，轉而將HIV傳遞給CD4+T細胞，最后死于CD4+T細胞大量破壞、功能喪失而致的各種疾病。

人體缺乏殺滅HIV的免疫力，體內使用的藥物療效不佳且毒副作用大，艾滋病是久攻不克的世界性難題。

技術實現要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領域的世界性難題，本發明人提出了本發明。

本發明的目的是要提供艾滋病治療細胞器；另一目的是要提供細胞器的制備及應用方法。

本發明的目的是這樣實現的：以免疫磁珠法分離出CDl4細胞，進而制備既保留原巨噬細胞特性又能無限生長的雜交瘤巨噬細胞株，選擇對HIV強吞噬性的克隆作擴增培養和保存，將由此制備的雜交瘤巨噬細胞株以高生物相容性材料包裹而制備能防止細胞及其碎片甚至HIV濾出的、能為細胞株吞噬HIV提供場所的細胞器，與血漿分離器構成體外循環，分離的血漿經細胞器濾出后，其中的HIV被巨噬細胞株吞噬清除，同時產生的抗感染巨噬細胞因子隨血漿回輸體內，從而實現既清除HIV又補充所需巨噬細胞因子的艾滋病雜交瘤技術體外新療法，比局限于在體內殺滅HIV但又難以實現的傳統療法更可行而無毒副作用。

本發明以經典的免疫磁珠分離法分離巨噬細胞，以經典的雜交瘤技術制備巨噬細胞雜交瘤細胞株，使之既保留吞噬HIV的活性，又具有無限生長的骨髓瘤細胞特性，經擴增后以高生物相容性材料包裹制成艾滋病治療細胞器，其中的巨噬細胞表達的CD4分子是艾滋病毒的受體，具有天然吞噬HIV的特性，本發明模擬巨噬細胞體內非特異性吞噬模式，當含有HIV的血漿流經細胞器時，HIV與巨噬細胞發生接觸而被吞噬，清除HIV后的血漿與血細胞匯合后回輸，能在治療中使體內HIV不斷被清除而減少直至消失，能有效阻斷新生的CD4+T細胞再被HIV感染，從而達到免疫重建的治療目的，與目前難以在體內殺滅HIV和難以有效阻斷從血漿到巨噬細胞再到CD4+T細胞的循環感染途徑，且費用昂貴，藥副作用大的常規抗逆轉錄治療相比，本發明更經濟、幾乎無藥副作用，實現了人工將HIV從體內轉移到體外而清除的治療新方法。

具體實施方式

圖1是根據本發明提出的艾滋病治療細胞器的應用示意圖。

圖2是根據本發明提出的血漿分離器的內部結構圖。

圖3是根據本發明提出的艾滋病治療細胞器的內部結構圖。

圖1中，動脈血路管(1)的一端與動脈血管相連通，另一端經肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經血漿泵(6)和循環管路(7)與兩個并聯的細胞器(8)、細胞器(9)相連，然后依次與循環管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內腔，3是血漿分離器內腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細胞，5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是可開關的閥門。

圖3中，1是細胞器，2是雜交瘤巨噬細胞株，3是進入細胞器的游離的HIV，4是HIV與雜交瘤巨噬細胞株的結合物，5是雜交瘤巨噬細胞株產生的細胞因子。

下面結合圖1、圖2和圖3，對本發明提出的艾滋病治療細胞器的實施方案作詳細的描述。

1、原代細胞來源

(1)單個核血液細胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細胞和單核巨噬細胞。具體方法是：購買血液中心的濃縮白細胞或為科研而保存的臍帶血，取2mL標本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數板上顯微鏡下計數4個大方格內的細胞(PBMC)總數。

(2)單個核組織細胞：由浙江大學組織工程研究平臺提供。實質上屬于來自脾臟的巨噬細胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉運：在論理委員會批準和患者知情同意下，取手術切除的脾臟標本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預冷4℃的無菌密封瓶內，迅速轉運至細胞培養室。②脾臟組織細胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無菌操作臺，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內的血液并保證組織的無菌。機械研磨脾臟組織，這時便有大量的組織細胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網過濾懸混有組織細胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細胞混懸液(主要含紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等)。③脾臟組織細胞混懸液中紅細胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內的裂解紅細胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細胞的存活，此時，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細胞和淋巴細胞。④脾臟組織巨噬細胞的貼壁培養：將前述混懸液作為培養細胞原液，臺盼藍染色判定活力并計數，用RPMI-1640液調整細胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調整好濃度的細胞懸液接種于玻璃培養瓶內，培養條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養2～3h，相差顯微鏡下觀察形態。貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細胞的消化：吸去培養上清液，巨噬細胞貼壁，PBS反復吹打、消化，所得細胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細胞。此外，還可以取治療或手術后廢棄的標本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。

(3)羊水、絨毛細胞：浙江大學附屬婦產科醫院生殖遺傳實驗室備用。在論理委員會批準和患者知情同意下，取實驗診斷報告后的剩余羊水、絨毛細胞，選擇對數生長期細胞留用。

2、細胞培養及巨噬細胞貼壁初步分選

按常規細胞培養，但根據細胞性質的不同，適當調整培養時間，培養條件等，一般貼壁法將單個核血液細胞(PBMC)或單個核組織細胞(巨噬細胞)置于含有RPMI-1640培養基的培養皿中，于37℃，5％CO₂的細胞培養箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h，待單個核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞(巨噬細胞以外的細胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞(主要為巨噬細胞，但還有少量其他貼壁細胞)。1000r/min離心5min，棄上清。羊水細胞、絨毛細胞培養1～7天，出現細胞生長克隆、細胞生長匯合率達到60～80％的對數生長期細胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細胞懸液，配成合適細胞濃度。

3、CD4細胞分選

采用免疫磁珠法分選CD4細胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國美天旎生物技術有限公司)；0.2％臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術服務公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(德國美天旎生物技術有限公司)。②CD4細胞免疫磁珠分選方法：細胞懸液均分至兩個1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細胞每80uLBuffer含細胞數10⁷個，每10⁷個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細胞(細胞活力檢測：細胞純化前后分別取15uL細胞懸液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞，計算200個細胞中活細胞的百分比)。此時分選的細胞主要為巨噬細胞。

4、CDl4細胞(巨噬細胞)分選

CDl4為單核細胞和巨噬細胞特有的表面標志，理論上如果從單個核組織細胞、羊水細胞及絨毛細胞中分選，則所得細胞為巨噬細胞；如果從單個核血液細胞中分選，則所得細胞包括單核細胞和巨噬細胞；但因單核細胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠不如巨噬細胞易于貼壁生長，所以在本發明的細胞貼壁培養中已基本除去，分選出來的細胞基本為巨噬細胞。

基本方法類同于CD4細胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CDl4免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，RPMI-1640培養基(Hyclone，美國)；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細胞一單核細胞結合：每1×10⁸個PBMC加入200uL偶聯CDl4抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個細胞加入1～2mL預冷緩沖液，1000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細胞懸液。(B)收集磁珠標記的單核細胞：將細胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細胞分離柱，待無液體滴下，立即將上述細胞懸液加人細胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細胞分離柱，用針柱快速推動，沖出在分離柱中與CDl4抗體一磁珠相結合的細胞，即為CDl4+的巨噬細胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養基的培養皿中，于37℃，含5％CO：的細胞培養箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國)中孵育2h。待單核細胞貼壁后，吸棄上層懸浮細胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI一1640培養基，用細胞刮刀刮下貼壁細胞。1000r/min離心5min，棄上清。②流式細胞術法：CDl4標記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調整細胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細胞懸液中加入CDl4+-FITC抗體100uL，4℃避光標記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調整細胞密度為2×107/mL。流式細胞儀分選：將制備的細胞在流式細胞儀(BD FAcsAria II，美國)上分選，根據CDl4抗體的熒光強度、細胞的相對大小以及細胞的相對顆粒性和內部結構的復雜性，收集CDl4+的細胞。

5、CDl4雜交瘤細胞株(雜交瘤巨噬細胞株)制備

(1)培養基及主要試劑：DMEM培養基、HAT、HT選擇培養基購自Sigma公司，優級胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責任有限公司；DMSO(--甲基亞砜)為國產分析純試劑。

(2)骨髓瘤細胞準備：融合前一周從液氮罐內取出一管凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應用最多的是Sp2/0細胞株，該細胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時間通常為10～15h；與人體相關的實際應用中考慮選擇同源細胞株，如上海復祥生物科技有限公司向ATCC細胞庫引進的NCI-H929人骨髓瘤細胞株)。融化后加入適量完全培養液，1000r/m離心3min；重復1次。將沉淀物移入細胞培養瓶中，加DMEM培養液，置CO2培養箱培養，3-4天進行一次傳代或擴大培養，融合前24小時內調整細胞狀態，保證融合前細胞形態良好、生長旺盛。加入適量基礎培養基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/m離心5-10min，重復洗滌細胞2次。

(3)待雜交CDl4細胞(巨噬細胞)準備：本發明分選的單核巨噬細胞以基礎培養基調整總細胞數到1×10⁸～2×10⁸用于細胞融合。以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數應高于80％為合格。

(4)細胞融合：將CDl4細胞(單核巨噬細胞)與骨髓瘤細胞以10∶1-5∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/m離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細胞無顆粒狀沉淀，重復2次。在37℃水浴中輕輕旋轉預熱離心管，取出后無菌條件下將預熱的1000μL的50％PEG3000在60s內沿管壁滴加到融合管中同時輕輕旋轉離心管，之后將預熱的25mL的基礎培養基在3-5min內也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/m離心5min，棄去上清，加入50mL HA T培養基。適當混勻后接種到96孔培養板中，置于37℃，5％的CO2培養箱中培養。

(5)具有吞噬功能的雜交瘤單核巨噬細胞株篩選：觀察96孔培養板中細胞生長情況，7-10天后僅有雜交瘤細胞能夠生長分裂，此時棄去HAT培養基，更換完全培養基。細胞克隆生長面積達到1/10個細胞孔時，去培養上清，選擇有生長狀態良好的雜交瘤細胞株的培養孔，顯微鏡下標記細胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標注的位置吸取細胞克隆到新的有完全培養基的培養孔內，然后依次倍比稀釋到后面數孔，37℃，5％CO2培養箱內培養一周左右，顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時，取細胞或培養上清檢測雜交瘤巨噬細胞(Mφ)株功能。具體方法如下：

①雜交瘤巨噬細胞株吞噬細菌功能檢測：將巨噬細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計數吞噬細菌和未吞噬細菌的巨噬細胞數比例，以吞噬細菌功能強的巨噬細胞作為備選陽性克隆株。

②雜交瘤巨噬細胞株吞噬HIV功能檢測：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與雜交瘤巨噬細胞株混合培養后，分離細胞株，PBS清洗3次，測定經裂解的吞噬細胞株吞噬HIV的功能，具體根據HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，上海啟發生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性。具體按試劑盒說明書操作。

③雜交瘤巨噬細胞株產生巨噬細胞因子檢測：以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應孔內顏色越深，陽性越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性，具體按試劑盒說明書操作。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應的調節因子發揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發揮多種免疫功能。

根據檢測結果，挑選具有較強巨噬細胞功能的培養孔中的細胞克隆重復進行下一輪稀釋培養，重復2-3輪，檢測功能穩定后取出，轉入培養瓶大量培養。

(6)雜交瘤巨噬細胞株的保存與復蘇：保存前12小時調整細胞生長狀態，取一瓶生長旺盛，形態良好的細胞，適當消化后制成細胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細胞松散，加入4℃保存的9份完全培養液和1份DMSO，分裝細胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存備用。復蘇前準備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動使細胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺內無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細胞用完全培養液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴大培養。

6、雜交瘤巨噬細胞株的擴增

即雜交瘤巨噬細胞株的產業培養。將上述細胞沉淀使用完全培養液輕輕重懸后移入培養瓶內，置37℃，5％CO2培養箱中培養。反復傳代擴增培養，直至所需的雜交瘤細胞株數量，每傳代培養陽性雜交瘤細胞株10代，檢測雜交瘤巨噬細胞株的功能，觀察是否穩定。繼續在數瓶內進行大規模產業化制備。

7、雜交瘤巨噬細胞株細胞器的制備(艾滋病治療細胞器的制備)

將本發明(上述)制備的雜交瘤巨噬細胞株，以生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低速短時離心)，取細胞沉淀裝入丙烯酸酯之類高生物相容性材料制成的圓柱形容器內，然后加滿無菌生理鹽水，使雜交瘤巨噬細胞株的濃度為80％～90％，封口，制成即時使用的艾滋病治療細胞器。細胞器內的雜交瘤巨噬細胞株具有吞噬和吸附HIV以及分泌巨噬細胞因子的功能，細胞器的外形可制成漏斗形，底徑小，頂徑大，容積為200～300ml，進出口均設有細胞篩網，進口處頂徑篩網目數為800目；出口處底徑篩網目數為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的規格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌；液體出口處設置目數為100目(相當于4微米)的細胞濾網，用以阻擋可能濾出的細胞；液體進出口與網篩之間設有緩沖區，有利于系統循環的穩定性。當經體外循環裝置分離的血漿流經細胞器時，游離的HIV被相應的雜交瘤巨噬細胞株吞噬吸附，凈化后的血漿從細胞器流出，與分離器分離的血細胞匯合后回輸體內。本發明的艾滋病治療細胞器可以委托專業商家制備。

8、血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細胞)的大小為：正常紅細胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約12μm，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μm，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變。可通過共價、接枝、聚合等方法改進材料的結構、調節表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發癥的發生。

(3)型號與規格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結構、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結構等形狀；按待分離的血細胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發明所涉及的血漿分離器用性質穩定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成分。

9、艾滋病治療細胞器的應用

按本發明中圖1的應用示意圖，連接血漿分離器和細胞器，構成體外循環裝置，具體方法如下：

(1)安裝：以無菌操作連接各部件，包括血漿分離器、細胞器及各循環管路。

(2)排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、細胞器及各循環管路，排除分離器、細胞器及其循環管道內的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。

(3)通液：將動脈血路管1接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內流液污染。

(4)抗凝：從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

(5)啟動：將靜脈管路(5)接通艾滋病患者的靜脈血管，然后打開血液泵，血流量為100～150ml/min，如圖1，當動脈血液經動脈血路管(1)進入血漿分離器(4)時，分離出來的血漿在血漿泵6的作用下經循環管路(7)到達細胞器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經循環管路(10)流出，同步向細胞器(9)灌注血漿，在細胞器(8)內的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時細胞器(9)開始放出血漿，兩個并聯的細胞器(8)、細胞器(9)交替進行。如圖2，當待分離的血液進入血漿分離器(1)的內腔(2)時，經閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿成份(5)進入分離器的外腔(6)，然后經血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細胞(4)經閥門(8)流出。如圖3，當含有HIV(3)的血漿進入細胞器(1)時，其中的HIV(3)被固定在細胞器中的雜交瘤巨噬細胞株(2)吞噬吸附，形成復合物(4)而不再往下移動，而雜交瘤巨噬細胞株產生的細胞因子(5)混合在清除了HIV后的血漿中流出細胞器后，經圖1所示的靜脈管路(5)回輸。如此直至事先設定的血漿循環量(通常為9L)，治療才宣告結束。如果配套電腦程序控制，整個治療過程均由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態，使用會更加方便、自動化和安全。

10、艾滋病治療細胞器的附加部件

圖1給出的艾滋病治療細胞器是本發明的基本構成部份，在此基礎上還可以改裝以下部件，包括動靜脈壓和空氣監測、溫度控制系統、配液系統、除氣系統、電導率監測系統、超濾監測和漏血監測等部分。

(1)動靜脈壓監測：動脈壓監測主要用以動態監測細胞器微孔的堵塞情況，另外用以監測體外循環血栓、凝固和壓力的變化。當血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會升高；靜脈壓監測用來監測管路血液回流的壓力，當分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發生堵塞時，靜脈壓就會升高。

(2)空氣監測(Air Detector)：用來監測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發生空氣栓塞而設置。當監測到有空氣氣泡時，檢測系統會驅動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發生。

總之，在本發明基本構成體系的基礎上，有望進一步研發自動化治療儀器，發展為操作的人性化、治療的個性化、設計的安全性以及模塊化、自動監測及調控、液晶顯示、自行判斷警報原因及解除信號等微電腦處理系統。

11、實驗驗證

為了解本發明的功效，設計了簡易細胞器的功效測試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經離心(1000r/min，5min)沉淀的雜交瘤巨噬細胞株至200mm刻度，接著吸取經100℃溶化后保溫在56℃備用的0.9％瓊脂糖C1-4B，達到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內細胞流出但不會阻止小分子的水和化學成份之類的物質通過。另取浙江省疾控中心等樣本庫保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡易細胞器)上端空管，待流經血沉管下層的雜交瘤巨噬細胞株層并從血沉管內流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)ELISA檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對檢測，按說明書操作，檢測范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應孔內顏色越深，陽性越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。結果如表1，濾前血漿中MIF檢測結果均為陰性(或因含量低于檢測靈敏度、血漿長期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測結果均為陽性，說明巨噬細胞雜交瘤細胞株在此過程產生了MIF細胞因子。MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應的調節因子發揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過簡易細胞器前后MIF配對檢測的同時，本發明還做了HIV-1p24的配對檢測，根據HIV-1p24抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，上海啟發生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內450nm測定吸光度(OD)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度＞0.12時被認為是陽性，檢測結果(表2)說明AIDS血漿濾過簡易細胞器后，部分HIV已被雜交瘤巨噬細胞株吞噬吸附，濾過后的血漿HIV明顯減少，經第1次濾過后，HIV清除率為20.55％，經第2次濾過后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有顯著的效果，說明隨著濾過次數的增加，HIV會被不斷地清除，從而達到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過簡易細胞器前后MIF配對檢測結果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過簡易細胞器前后p24檢測結果(p24：pg/ml)

總之，從表1和表2的結果表明，含有HIV的血漿經本發明的艾滋病治療細胞器濾過后，其中的HIV能被細胞器中的雜交瘤巨噬細胞株吸附清除，效果顯著；與此同時，雜交瘤巨噬細胞株產生了具有抗感染和免疫作用的細胞因子。實驗結果說明，本發明的艾滋病治療細胞器具有顯著的功效。