miR?1在制備治療胃癌和乳腺癌藥物中的應用的制作方法

本發明涉及了一種miR-1在制備治療胃癌和乳腺癌藥物中的應用。

背景技術：

癌癥是最常見的致死性疾病，癌癥病人每年以超過1000萬的速度增加。腫瘤發生和發展是一個多步驟的過程，在這個過程中細胞由良性向惡性腫瘤發展。腫瘤生長和轉移的抑制是癌癥治療所面臨的主要挑戰。到現在為止，癌癥治療主要包括外科手術、輻射和化療藥物。然而，輻射和化療藥物往往也能殺死正常細胞和對患者產生毒性。

MicroRNAs(miRNAs)是一類含～22nt非編碼小RNA，由RNA聚合酶家族轉錄成pri-miRNA，pri-miRNA在dorsha和DGCR8復合物的作用下被剪切加工形成precursor miRNA，隨后在Exportin5的介導下運輸出核進入細胞質，在細胞質中在Dicer的加工下形成成熟體miRNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR堿基配對結合，以翻譯抑制或直接降解的方式，降低靶基因的表達，從而達到了轉錄后調控的作用。

近年來，miRNA已被發現在腫瘤中差異表達并且能調節腫瘤相關基因的表達，試驗和臨床研究已經證明，腫瘤中差異表達的miRNA與腫瘤發生和癌癥轉移息息相關。因此，miRNA可能成為一個癌癥治療藥物靶向的新目標。

技術實現要素：

基于上述背景技術，本發明通過實驗研究miR-1在治療癌和制備癌藥物中的應用，具體指的癌包括胃癌和乳腺癌。

所述miR-1的堿基序列為：UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU，如SEQ ID NO.1。

所述胃癌涉及的腫瘤細胞包括人胃癌細胞MGC-803、HGC-27、MKN45。

所述乳腺癌涉及的腫瘤細胞包括人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-M B-435。

本發明的有益效果體現在：

(1)miR-1能抑制胃癌細胞或乳腺癌細胞的生長，但不影響正常細胞的生長；

(2)miR-1能抑制胃癌細胞或乳腺癌細胞的遷移，粘附和入侵，但對正常細胞無影響。

(3)miR-1抑制癌細胞在活體內成瘤和轉移。

(4)miR-1能用于制備新型的癌癥治療藥物。

附圖說明

圖1為實施例1-5所涉及的在細胞中轉染miR-1后檢測細胞內miR-1的表達水平的結果。

圖2為實施例1中miR-1對胃癌細胞，胃正常細胞和乳腺癌細胞的增殖能力的影響的結果圖。圖2中A為實施例1中MTS法檢測miR-1對胃癌細胞MGC-803,HGC-27,MKN45和胃正常細胞GES-1增殖能力影響的結果圖；圖2中B為實施例1中MTS法檢測miR-1對乳腺癌細胞MDA-MB-231,MDA-MB-435增殖能力影響的結果圖。

圖3為實施例2中miR-1對胃癌細胞，胃正常細胞和乳腺癌細胞遷移能力的影響的結果圖。圖3中A為實施例2中Transwell細胞遷移實驗檢測miR-1對胃癌細胞MGC-803,HGC-27,MKN45和胃正常細胞GES-1遷移能力影響的結果圖；圖3中B為為實施例2中Transwell細胞遷移實驗檢測miR-1對乳腺癌細胞MDA-MB-231,MDA-MB-435遷移能力影響的結果圖。

圖4為實施例3中miR-1對胃癌細胞，胃正常細胞和乳腺癌細胞入侵能力的影響的結果圖。圖4中A為實施例3中Transwell細胞入侵實驗檢測miR-1對胃癌細胞MGC-803,HGC-27,MKN45和胃正常細胞GES-1入侵能力影響的結果圖；圖4中B為為實施例3中Transwell細胞入侵實驗檢測miR-1對乳腺癌細胞MDA-MB-231,MDA-MB-435入侵能力影響的結果圖。

圖5為實施例4中miR-1對胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠體內成瘤試驗后的大小示意圖。

圖6為實施例4中miR-1對胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠體內成瘤體積的曲線圖。

圖7為實施例5中活體成像觀察miR-1對乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠體內轉移區域的成像圖。

圖8為實施例5中活體成像觀察miR-1對乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠體內轉移的電化學信號的曲線圖。

各個附圖中的*和**作為顯著性差異的表示，*表示差異顯著，**表示差異極顯著。

具體實施方式

下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步詳細說明。

本發明的實施例如下：

本發明以下各個實施例中的miR-1采用以下方式制備獲得：

本發明以下實施例所涉及的miR-1是由miR-1precursor導入細胞方式獲得，將miR-1precursor導入細胞中用于模擬細胞內的miR-1分子，miR-1precursor是化學修飾和優化的核酸分子，由Ambion公司設計并合成。miR-1mimic用takara試劑盒vitroTranscription T7Kit按說明書合成。

實施例1

在人胃癌細胞(MGC-803,HGC-27,MKN45)、人胃正常細胞GES-1和人乳腺癌細胞(MDA-MB-231,MDA-MB-435)中過表達miR-1后檢測細胞生長情況。胃癌細胞MGC-803和胃正常細胞GES-1在含10％體積FBS的RPMI-1640培養基中培養，胃癌細胞HGC-27在含10％體積FBS的MEM-EBSS培養基中培養，乳腺癌細胞MDA-MB-231,MDA-MB-435在含10％體積FBS的L15培養基中培養。

胃癌細胞和胃正常細胞的培養條件均為37℃，充5％CO₂；乳腺癌細胞培養條件為37℃，充100％空氣。胃癌細胞系和乳腺癌細胞系均購自中科院上海細胞庫，GES-1購自上海拜力生物科技有限公司。

取人胃癌細胞(MGC-803,HGC-27,MKN45)、胃正常細胞GES-1和乳腺癌細胞(MDA-MB-231,MDA-MB-435)，在含10％體積FBS的培養基中培養至細胞密度約為30％，30％指的是生長后細胞所占培養皿的面積。

按照RNAiMAX轉染試劑說明書轉染miR-1precursor和陰性對照RNA，六孔板每孔加7.5μl轉染試劑和7.5μl miR-1precursor(或陰性對照RNA，終濃度為30nM)。轉染48小時后，通過qRT-PCR檢測miR-1的過表達效果，并用MTS檢測細胞的生長情況。

結果見圖2，對比圖1可發現，當癌細胞中miR-1的表達水平升高時，癌細胞的生長明顯地被抑制，但胃正常細胞GES-1的生長不受影響。由此實施例通過MTS法檢測細胞的生長結果顯示miR-1能抑制胃癌細胞或乳腺癌細胞的生長，但不影響正常細胞的生長。

實施例2

在人胃癌細胞(MGC-803,HGC-27,MKN45)、胃正常細胞GES-1和乳腺癌細胞(MDA-MB-231,MDA-MB-435)中轉染miR-1precursor和陰性對照48h后檢測細胞遷移情況，轉染方法與實施例1相同。

1)細胞轉染48h后用胰酶消化，不含FBS的培養基重懸細胞，細胞計數器計算細胞數目。調整細胞濃度后加入到小室，每孔小室加入4×10⁴個/100μl無FBS培養基。

2)24孔板的下室加入600μl含10％FBS的培養基，確保下層培養基和小室之間無氣泡后將孔板放入培養箱中培養24小時。

3)吸掉上室和下室培養基，PBS洗1次。

4)4％多聚甲醛常溫固定15分鐘后PBS洗2次

5)針對小室中的細胞，用結晶紫在常溫染色15分鐘。染色結束后，吸掉染色液并用PBS洗2次。輕輕用紙巾吸干水。

6)用棉簽輕輕擦掉小室上層細胞，Nikon Ti-S顯微鏡下拍照。

結果如圖3所示，圖中可見當miR-1過表達時，胃癌細胞和乳腺癌細胞的遷移能力都明顯受到抑制，而對正常細胞而言，其遷移能力較弱，miR-1過表達后，正常細胞的遷移能力沒有顯著變化。

由此實施例2通過Transwell細胞遷移實驗檢測顯示miR-1能抑制胃癌細胞或乳腺癌細胞的遷移，但對正常細胞無影響。

實施例3

在人胃癌細胞(MGC-803,HGC-27,MKN45)、胃正常細胞GES-1和乳腺癌細胞(MDA-MB-231,MDA-MB-435)中轉染miR-1precursor和陰性對照48h后檢測細胞入侵情況，轉染方法與實施例1相同。

1)從-20℃冰箱取含入侵小室的24孔板(invasion chamber,corning)，常溫放置一會兒至常溫。入侵小室的上層包裹了一層基質膠，

2)向入侵小室內加入200μl預熱的不含FBS基礎培養基，在細胞培養箱放置2小時。使用前吸干小室內的液體。

3)細胞處理一定時間段后用胰酶消化，不含FBS的培養基重懸細胞，細胞計數器計算細胞數目。調整細胞濃度，每孔小室加入1×10⁵個/100μl無FBS培養基。

4)24孔板的下室加入600μl含10％FBS的培養基，確保下層培養基和小室之間無氣泡后將孔板放入培養箱中培養24小時。

5)吸掉上室和下室培養基，PBS洗1次。

6)4％多聚甲醛常溫固定15分鐘后PBS洗2次

7)針對小室中的細胞，結晶紫常溫染色15分鐘。染色結束后，吸掉染色液并用PBS洗2次。輕輕用紙巾吸干水。

8)用棉簽輕輕擦掉小室上層細胞，Nikon Ti-S顯微鏡下拍照。

結果如圖4所示，圖中可見當miR-1過表達時，胃癌細胞和乳腺癌細胞的入侵能力都明顯受到抑制，而對正常細胞而言，其入侵能力較弱，miR-1過表達后，正常細胞的入侵能力沒有顯著變化。

由此實施例3進一步通過Transwell細胞入侵實驗檢測顯示miR-1能抑制胃癌細胞或乳腺癌細胞的遷移，但對正常細胞無影響。

實施例4

在人胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞MDA-MB-231中轉染miR-1precursor和陰性對照48h，轉染方法與實施例1相同。

1)胰酶消化轉染后的癌細胞，300x g離心收集細胞，PBS清洗一次，再次離心收集。

2)用無菌生理鹽水重懸細胞，使細胞濃度為1×10⁷個/ml。

3)用1mL注射器吸100μL注射到雌性裸鼠(4-6周)背部皮下部位。

4)一周后開始觀察并記錄裸鼠的成瘤情況，腫瘤體積＝0.52×長徑×短徑×短徑。

結果如圖5和圖6所示，圖中可見胃癌細胞MGC-803和乳腺癌細胞MDA-MB-231在裸鼠皮下形成的瘤塊中，miR-1過表達組瘤塊的生長速度顯著地低于對照組。

由此活體成瘤實驗顯示miR-1顯著地抑制了癌細胞在裸鼠體內成瘤的能力。

實施例5

1.整合了luciferase基因的乳腺癌細胞轉染miR-1precursor或陰性對照序列。

2.48小時后用胰酶消化，300x g離心收集細胞，PBS清洗一次，再次離心收集。

3.無菌生理鹽水重懸細胞，使細胞濃度為2×10⁵個/ml。

4.用1mL注射器吸100μL尾靜脈注射至雌性裸鼠(4-6周)體內。

5.三天后，接種對照細胞的裸鼠分為兩組，一組每隔三天注射一次200nMmiR-1mimic，另一組注射等體積的無菌生理鹽水。

6.一周后開始通過活體成像觀察癌細胞轉移情況：

1)用生理鹽水溶解化學發光底物D-luciferin，使用濃度為30mg/kg。

2)每只裸鼠(約20g)腹腔注射100μl底物，10分鐘后進行異氟烷麻醉。

3)小鼠經過麻醉后放入成像暗箱平臺，用IVIS Spectrum CT Preclinical In Vivo Imaging System進行成像。

4)裸鼠每隔1周進行一次活體成像，至8周左右停止成像。統計8周以內的化學發光信號值。

結果如圖7和圖8所示，圖中可見miR-1過表達組(miR-1mimic和miR-1 precursor)乳腺癌細胞的轉移能力明顯低于對照組。

由此活體肺轉移實驗顯示說明了miR-1抑制乳腺癌細胞在裸鼠體內轉移。

本發明涉及的RNA序列如下：

SEQ ID NO.1：miR-1堿基序列

來源：人工合成

序列：UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 。