本發明涉及疫苗
技術領域：
，同時涉及基因工程技術，具體涉及一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗的制備方法。
背景技術：
：禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)屬于正黏病毒科中的A型流感病毒屬，基因組由8個單股負鏈的RNA片段組成，片段1～8由大到小依次命名為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，根據其表面抗原血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同劃分亞型，迄今已發現16種HA和9種NA亞型，該病毒感染禽類從輕度上呼吸道疾病、產蛋量降低，直至急性全身致死性疾病，對公共衛生也造成了威脅。IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組全長大小約為27.4kb～27.7kb，為不分節段的單股正鏈RNA。編碼4種結構蛋白；其中，纖突蛋白(S)位于病毒粒子表層囊膜上，是構成IBV表面纖突的主要成分，能夠誘導機體產生保護性抗體及血凝抑制抗體，并能夠與細胞受體結合并引起病毒和細胞膜的融合。新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)為副粘病毒科、腮腺炎病毒屬、禽副粘病毒1型病毒，為單股負鏈不分節段的RNA病毒，基因組長約15kb，其結構為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。NDV的反向遺傳操作系統是Peeters等在1999年建立的，該技術是通過在體外構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒。該操作系統的核心是構建基因組全長感染性cDNA克隆，可通過中間過程人為加入DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工改造，如基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等，為新型疫苗的研制和開發提供了新的思路。現有技術中AIV、IBV、NDV三聯疫苗多為三種抗原的混合苗，需要分別制備三種抗原，這一方面加大了制備難度，同時，由于三種抗原均屬于全病毒抗原，因此免疫效果容易相互影響。技術實現要素：本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗的制備方法，以解決現有技術中缺乏一種上述疫苗的技術問題。本發明要解決的另一技術問題是現有技術中上述三聯疫苗的制備過程中需要分別制備三種抗原。本發明要解決的再一技術問題是現有技術中上述三聯疫苗的滴度較低。為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：將雞傳染性支氣管炎病毒S1基因插入至新城疫病毒基因組的F-HN之間，得到重組新城疫病毒rLaSota/S1，而后將禽流感病毒HA基因插入至重組新城疫病毒rLaSota/S1基因組的P-M之間，即得到重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA；利用所述重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA表達抗原，而后制備疫苗。作為優選，所述rLaSota/S1是通過以下方法制備的：1)將新城疫病毒的NP、P、L三個基因通過RT-PCR進行擴增，而后將三者分別克隆到表達質粒載體pTM1，分別得到重組質粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；2)通過特異性引物使TOPOTACloning載體線性化，利用IBV-M41株為模板，通過特異性引物擴增S1基因，得到rLaSota/S1重組亞克隆；而后將rLaSota/S1亞克隆線性化后連接到LaSota全長cDNA質粒中，將其轉化到Stbl2感受態細胞，30℃培養24小時再通過DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽性克隆，再將陽性克隆株純化，即得到重組質粒pLaSota/S1；3)在細胞板上以每孔106個的加入量鋪入HEp-2細胞，預先用MVA/T7A感染；通過轉染試劑，將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1質粒共轉染到HEp-2細胞上，轉染后6小時后去掉轉染培養基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養基；72小時，通過將轉染細胞反復凍融3次收獲重組病毒rLaSota/S1。作為優選，所述rLaSota/S1-HA是通過以下方法制備的：A)將新城疫病毒的NP、P、L三個基因通過RT-PCR進行擴增，而后將三者分別克隆到表達質粒載體pTM1，分別得到重組質粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；B)通過特異性引物使TOPOTACloning載體線性化，利用禽流感病毒為模板，通過特異性引物擴增S1基因，得到rLaSota/HA重組亞克隆；而后將rLaSota/HA重組亞克隆線性化后連接到rLaSota/S1的全長cDNA質粒中，將其轉化到Stbl2感受態細胞，30℃培養24小時再通過DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽性克隆，再將陽性克隆株純化，命名為pLaSota/S1-HA，即得到重組質粒pLaSota/S1-HA；C)在細胞板上以每孔106個的加入量鋪入HEp-2細胞，預先用MVA/T7A感染；通過轉染試劑，將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA質粒共轉染到HEp-2細胞上，轉染后6小時后去掉轉染培養基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養基；72小時，通過將轉染細胞反復凍融3次收獲重組病毒rLaSota/S1-HA。作為優選，所述表達抗原包括以下步驟：將重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA株以1:8000倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，置相對濕度60～65％，溫度33～35℃條件下孵育，收集120～144h死亡胚的尿囊液，即得到抗原溶液。作為優選，所述抗原溶液中EID50≥108.7/0.1ml。作為優選，所述制備疫苗包括以下步驟：抗原溶液滅活后作為水相，與疫苗油相以1:3的比例混合，乳化，即得到所述重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗。作為優選，所述抗原溶液滅活包括以下步驟：按0.2％(v/v)的終濃度為加入甲醛，混合后于2～8℃條件下下滅活24小時，期間每6小時攪拌1次，而后于37℃保持2小時。本發明提供了一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗的制備方法，該技術方案通過對雞新城疫病毒LaSota株的基因改造而實現。以重組NDV弱毒株rLaSota株為載體，首先將雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)S1基因插入F-HN之間，經利用反向遺傳技術構建表達S1蛋白的重組新城疫病毒rLaSota/S1,結果表明，rLaSota可作為活載體穩定表達S1蛋白。而后構建表達HA基因的重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA,即在重組新城疫病毒rLaSota/S1的P-M之間插入HA基因。對其進行免疫原性評估。結果表明通過常規滅活疫苗工藝制備出的重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗其新城疫、禽流感和傳染性支氣管炎均有較強的保護作用。該構建重組疫苗策略可增強重組子的表達，最大程度減少其位于序列后部蛋白表達損失量。該重組疫苗具有載體病毒繁殖滴度高，易于生產；免疫一次可有效預防三種動物疫病；注射簡單；填補了活載體疫苗類基因工程疫苗的空白，具有廣泛的應用前景。具體實施方式以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。實施例1(重組雞新城疫病毒的構建)1、輔助性質粒NP、P、L基因的構建將NP、P、L三個基因通過RT-PCR進行擴增，然后分別將三個基因克隆到表達質粒載體pTM1,所構建的輔助質粒經DNA序列分析鑒定，將陽性質粒命名為pTM-NP、pTM-P、pTM-L。2、表達S1蛋白的重組新城疫病毒的構建通過一對特異性引物pM-s和pM-r使和TOPOTACloning載體線性化，利用IBV-M41株為模板，用一對特異性引物S1-F和S1-R擴增S1基因，，得到rLaSota/S1重組亞克隆。最后通過In-fusionPCRCloningKit將rLaSota/S1亞克隆線性化后連接到LaSota全長cDNA質粒中，將其轉化到Stbl2感受態細胞，30℃培養24小時再通過DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽性克隆，再將陽性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit純化，命名為pLaSota/S1。3、重組rLaSota/S1病毒的拯救鋪約1*106個HEp-2細胞至每孔細胞板中，預先用MVA/T7A感染。通過轉染試劑，按說明書將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1質粒共轉染到HEp-2細胞上，轉染后6小時，去掉轉染培養基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養基。72小時，通過將轉染細胞反復凍融3次收獲重組病毒，將重組病毒命名為rLaSota/S1，在10日齡SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。4、S1蛋白表達鑒定及病毒生物學特性檢測首先通過RT-PCR方法用一對特異性引物檢查插入片段的大小，同時送測序進行序列分析。然后利用紅細胞凝集試驗、半數雞胚感染量試驗、雞胚平均死亡時間及腦內致病指數試驗和生長曲線試驗，對rLaSota/S1重組病毒的滴度及生物學特性進行分析鑒定，結果如表1所示。其結果表明，該重組病毒的雞胚平均死亡時間有所增加和腦內致病指數為0.1，以上兩項指標表明其病毒已被致弱，但對雞胚仍有較強的感染能力。表1rLaSota/S1重組病毒的滴度及致病作用檢測結果MDTICPIEID50HALaSota96h0.15109EID50/0.1ml29rLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1ml295、表達HA蛋白的重組新城疫病毒的構建此處插入的HA基因序列來自禽流感病毒H9亞型。通過一對特異性引物pNP-s和pNP-r使和TOPOTACloning載體線性化，用一對特異性引物HA1和HA2擴增HA基因，得到rLaSota/HA重組亞克隆。最后通過In-fusionPCRCloningKit將rLaSota/HA亞克隆線性化后連接到rLaSota/S1的全長cDNA質粒中，將其轉化到Stbl2感受態細胞，30℃培養24小時再通過DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽性克隆，再將陽性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit純化，命名為pLaSota/S1-HA。6、重組rLaSota/S1-HA病毒的拯救鋪約1*106個HEp-2細胞至每孔細胞板中，預先用MVA/T7A感染。通過轉染試劑，按說明書將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA質粒共轉染到HEp-2細胞上，轉染后6小時，去掉轉染培養基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養基。72小時，通過將轉染細胞反復凍融3次收獲重組病毒，將重組病毒命名為rLaSota/S1-HA，在10日齡SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。7、S1蛋白表達鑒定及病毒生物學特性檢測首先通過RT-PCR方法用一對特異性引物檢查插入片段的大小，同時送測序進行序列分析。然后利用半數雞胚感染量試驗、雞胚平均死亡時間及腦內致病指數試驗和生長曲線試驗，對rLaSota/S1-HA重組病毒的滴度及生物學特性進行分析鑒定，結果如表2所示。其結果表明，該重組病毒的雞胚平均死亡時間有所增加和腦內致病指數為0，以上兩項指標表明其病毒已被致弱，但對雞胚仍有較強的感染能力。表2rLaSota/S1-HA重組病毒的滴度及致病作用檢測結果MDTICPIEID50LaSota96h0.15109EID50/0.1mlrLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1mlrLaSota/S1-HA1200108.5EID50/0.1ml實施例2(重組新城疫病毒的繁殖及三聯滅活疫苗的制備)1、病毒繁殖雞胚的選用來自飼養管理良好的健康雞群所產的雞蛋，每批雞胚要經過嚴格篩選。外檢共4項：白殼、大小、破損及臟胚，內檢共9項：去除沙殼、偏氣室、游氣室、倒置胚、無精蛋、終止胚、弱胚、污染胚、裂縫胚。檢驗合格的雞胚可以作為制苗材料。將重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA株，以1:8000倍稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，置相對濕度60％～65％，溫度33～35℃條件下孵育，不必翻蛋，收集120-144h死亡胚的尿囊液，氣室向上直立，4℃冷胚24h，收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無菌剝除氣室部位囊膜殼，在收獲胚液前，應逐個檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液渾濁及有任何污染可疑者棄去不用，收獲雞胚尿囊液于滅菌容器中，測得EID50可達到108.7/0.1ml。檢測：對收獲的病毒樣品進行無菌檢驗、紅細胞凝集試驗和病毒含量測定，應無菌生長，HA效價≥9lg2，每0.1ml病毒含量應≥108.5EID50。對檢驗合格的樣品注明名稱、收獲日期、代次等。收獲的胚液滅活前置4℃保存。2、滅活滅活經濃縮檢驗合格后的兩種病毒雞胚尿囊液分別注入滅活罐，按0.2％的終濃度為加入甲醛(或其他滅活劑)溶液，邊加邊攪拌，使其充分混合，置2～8℃下滅活24小時，期間6小時攪拌1次，再取出置于37℃作用2小時。滅活完成后取樣做滅活檢驗及無菌檢驗，置2～8℃下保存過夜，保存時間應不超過7日。3、滅活檢驗取滅活的病毒液接種10日齡易感雞胚10枚，每胚0.1ml，置33～35℃培養96小時。24小時內死亡的不計數，收獲雞胚液，測定HA價，應為陰性，并盲傳1代，測定HA價，如為陰性，即滅活完全。4、二聯苗的制備取注射用白油94份，加司盤-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加熱隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。。取吐溫-804份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加入混合的滅活病毒液96份，充分振搖，至吐溫-80完全溶解為止。使油相與水相的比例為3:1乳化程序為：取油相置膠體磨內，開動電機慢速攪拌，同時分別緩慢加入水相，加完后再以10000r/min攪拌2min～5min，在終止攪拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01％以下。5、分裝、檢驗將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封，并貼上標簽。其性狀呈乳白色均勻乳狀液。劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，呈現團狀，不擴散。吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，應不出現分層現象、管底析出水相應不多于0.5ml。黏度按現行《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合規定。裝量檢查按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應符合規定。無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。實施例3(重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗的免疫效果)將60只21日齡SPF雞隨機分為2大組，其中A組30只為接種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗組，B組30只為空白對照組。免疫后14天分別肌肉注射北京株1ml(含104ELD50)、傳染性支氣管炎M41株攻毒劑量為104.0EID50、測AIV-HI抗體效價。攻毒組觀察10天，觀察其發病情況和死亡情況。采血組只測定抗體效價。具體結果如表3所示：表3二聯疫苗免疫有效性實驗結果以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 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