本發明涉及一種治療飲食停滯，胃脘脹悶，納呆食少，失眠多夢，頭暈心悸，神倦乏力等癥的益生菌發酵型參術建中口服液及其制備方法，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
根據藥品標準WS-5523(B-0523)-2002中給出的制備方法制備而成的參術建中口服液，是一種具有益氣健脾，和中安神功能，適用于治療飲食停滯，胃脘脹悶，納呆食少，失眠多夢，頭暈心悸，神倦乏力等癥口服制劑。以下是WS-5523(B-0523)-2002 藥品標準中給出的配方和工藝及簡要說明：
處方：人參 50g 山楂（焦）50g 五味子20g 麥芽（炒）10g 白術（焦）10g。
制法：以上五味，將人參、山楂、麥芽、白術、五味子酌予碎斷，加水煎煮二次，第一次加5倍量水，煎煮2小時，第二次加2倍量水，煎煮1小時，分次濾過，合并濾液，濾液濃縮至相對密度為1.14-1.22（50℃），加3倍量乙醇，靜置24小時，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.16-1.24（50℃），再加4倍量乙醇，靜置24小時，濾過，回收乙醇至相對密度為1.16-1.24（50℃），再加5倍量乙醇，靜置24小時，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.16-1.24（50℃），備用。將山梨酸2g加乙醇適量溶解，濾過，備用。取蜂蜜200g加適量水溶解，加熱至85～95℃保持30分鐘，除蜜沫，濾過；加入到濃縮液中，混勻。在不斷攪拌下徐徐加入山梨酸的乙醇溶液，再加水至1000ml，混勻，分裝，即得。
功能主治：益氣健脾，和中安神。適用于飲食停滯，胃脘脹悶，納呆食少，失眠多夢，頭暈心悸，神疲乏力等癥。
用法用量：口服，一次10mL，一日2-3次。
參術建中口服液原工藝采用多次醇沉工藝，不但消耗大量乙醇，而且將處方中多糖、多肽等大分子類成分除掉，造成藥材浪費。
多糖是中藥中一類天然高分子化合物，是維持生命正常運轉的基本物質，有調節免疫系統功能、抗胃腸潰瘍功能、抗氧化以及抗衰老等作用，具有巨大開發潛力。多肽具有調節機體生理功能和為機體提供營養的雙重功效。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現行參術建中口服液采用醇沉工藝，將處方中多糖、多肽等大分子類成分除掉，造成藥材浪費的缺陷，提供一種益生菌發酵型參術建中口服液及其制備方法。
本發明的另一個目的是將原工藝中蜂蜜改為三氯蔗糖，擴大了高血糖人群使用。
本發明的技術方案如下：
一種益生菌發酵型參術建中口服液，由益生菌發酵中藥復方制得，所述中藥復方的成分及含量為：每1000ml益生菌發酵型參術建中口服液中含：人參 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麥芽10g 焦白術10g。
所述的益生菌為雙歧桿菌和乳桿菌。
所述益生菌發酵型參術建中口服液的制備方法步驟如下：
a. 取中藥復方中的人參、炒麥芽、焦白術三味藥，粉碎，過20～100目；
b. 加水浸泡0.5～1.0h，80～115℃加熱20～60min，調pH值5.5～6.5，高溫淀粉酶酶解（用量：中藥質量的0.1～0.8%），酶解至碘試液不再變藍；
c. 調整pH7.0并于110～121℃下滅菌30～60分鐘，溫度降至39℃左右時，接種預培養的體積百分比各約0.2～1.0%的一種或者兩種雙歧桿菌的菌液，常規培養約2～6小時，再接種預培養的體積百分比各約0.2～1.0%的兩種或者三種乳桿菌的菌液，然后繼續發酵12～42小時，當pH降至4.0以下時結束發酵；
d. 分離發酵液與殘渣，殘渣再用水加熱提取一遍，合并發酵液與提取液，濃縮，得濃縮液備用；
e. 取焦山楂、五味子加水浸泡、加熱提取兩次，過濾，合并濾液，調pH3～6，果膠酶酶解（用量：中藥質量的0.1～1.0%），過濾或離心，濃縮，得濃縮液備用；
f. 合并步驟d、步驟e得到的濃縮液，用ZTC澄清劑處理，加純化水稀釋，分裝，滅菌，即得益生菌發酵型參術建中口服液。
制備方法步驟c中所述的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌；所述的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。
制備方法步驟c中所述的接種的方式也可為同時接種預培養的體積百分比各約0.2～1.0%的一種或者兩種雙歧桿菌的菌液和預培養的體積百分比各約0.2～1.0%的兩種或者三種乳桿菌的菌液；所述發酵的時間為常規發酵16～48小時，當pH降至4.0以下時結束發酵。
為了改善口感，在步驟f用ZTC澄清劑處理之后，還添加有三氯蔗糖（100～300mg/L）。
菌種來源于中國典型培養物保藏中心（CCTCC）（中國，武漢）或中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）（中國，北京）或者從正常人的糞便或腸粘膜組織中分離得到這些細菌菌株。
一般說來，本發明的發酵型參術建中口服液的口服給藥劑量可根據原工藝制備的參術建中口服液藥材含量折算，或根據待治療的病癥或病理狀態的性質、嚴重程度、病人或動物的年齡、體重、一般健康狀態，以及病人或動物對所用藥物的敏感性、耐受性和給藥方式等因素，按照個體化的原則由臨床醫生確定。
中藥在發酵中藥過程中，微生物的生長代謝具有強大的分解轉化能力，能將許多不能直接吸收利用的大分子有效活性物質降解為小分子活性物質，小分子活性物質可通過血腦屏障，并與機體的細胞蛋白結合，從而易于機體對有效成分的吸收和利用，提高中藥的治療效果。
本發明利用酶解技術和發酵技術，通過對人體有益的腸道細菌，在體外發酵中藥。一方面，保留了中藥的水提物全成分；另一方面，體外轉化大分子物質，易于人體吸收，增強療效；并且在發酵過程中，產生豐富風味物質，改善了中藥的口感。
經動物實驗證明，本發明的益生菌發酵型參術建中口服液對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量等指標有顯著的提高和改善。經臨床驗證，對于治療飲食停滯，胃脘脹悶，納呆食少，失眠多夢，頭暈心悸，神倦乏力等癥優于原工藝制備的參術建中口服液。
具體實施方式
實施例1：益生菌發酵型參術建中口服液A的制備
按下列重量稱取各中藥成分：人參 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麥芽10g 焦白術10g。
取人參、炒麥芽、焦白術三味藥，粉碎，過20目，加10倍量水浸泡1.0小時，110℃加熱20分鐘，降溫至90℃時，調pH=6，加入高溫淀粉酶0.2g，酶解至碘試液不再變藍。
調整pH7.0并于115℃下滅菌50分鐘，溫度降至39℃左右時，接種預培養的體積百分比各約0.5%的兩歧雙歧桿菌（正常人體分離，經中國科學院微生物研究所鑒定）和青春雙歧桿菌（CGMCC 1.2190）的菌液，37℃培養約6小時后，再接種體積百分比各約0.5%的干酪乳桿菌（CGMCC 1.3113）、鼠李糖乳桿菌（CGMCC 1.2466）和德氏乳桿菌（CGMCC 1.1480）的菌液，37℃發酵16小時檢測pH值，當pH值降至4.0以下時結束發酵，離心，收集發酵液，殘渣再加水5倍量，90℃加熱提取0.5小時，離心，合并發酵液與提取液，濃縮至500ml，備用。
另取焦山楂、五味子加水浸泡1.0小時，煎煮二次（8倍量水、6倍倍量水），第一次1.5 小時，第二次為1.0 小時，過濾，合并濾液，調pH5.0，50℃加果膠酶0.3g，酶解2.0小時，離心，濃縮至300ml，備用。
合并以上兩種濃縮液，用ZTC1+1澄清劑處理，添加三氯蔗糖200mg，加純化水稀釋至1000ml，分裝，滅菌，即得益生菌發酵型參術建中口服液A。
實施例2：益生菌發酵型參術建中口服液B的制備
按下列重量稱取各中藥成分：人參 50g 焦山楂50g 五味子20g 炒麥芽10g 焦白術10g。
取人參、炒麥芽、焦白術三味藥，粉碎，過60目，加10倍量水浸泡0.5小時，100℃加熱40分鐘，降溫至80℃時，調pH=6.2，加入高溫淀粉酶0.3g，酶解至碘試液不再變藍。
調整pH7.0并于121℃下滅菌40分鐘，溫度降至39℃左右時，同時接種預培養的體積百分比各約1.0%的短雙歧桿菌（CGMCC 1.2213）的菌液，體積百分比各約0.5%的嗜酸乳桿菌（CGMCC 1.1854）、植物乳桿菌（CGMCC 1.19）的菌液，37℃發酵24小時檢測pH值，當pH值降至4.0以下時結束發酵，離心，收集發酵液，殘渣再加水5倍量，100℃加熱提取0.5小時，離心，合并發酵液與提取液，濃縮至500ml，備用。
另取焦山楂、五味子加水浸泡1.0小時，煎煮二次（8倍量水、6倍倍量水），第一次1.5 小時，第二次為1.0 小時，過濾，合并濾液，調pH4.5，50℃加果膠酶0.5g，酶解2.0小時，過濾，濃縮至300ml，備用。
合并以上兩種濃縮液，用ZTC1+1澄清劑處理，添加三氯蔗糖150mg，加純化水稀釋至1000ml，分裝，滅菌，即得益生菌發酵型參術建中口服液B。
本發明中使用的益生菌為雙歧桿菌和乳桿菌，其中雙歧桿菌是人或哺乳動物體內最重要的生理性細菌，主要分布于小腸下部和結腸內。乳桿菌是人體內分布最為廣泛的益生菌，在胃腸道中，該細菌主要分布于迥腸部。本發明選用兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、和植物乳桿菌等常見益生菌菌株，主要是基于它們在人或動物腸道內分布的總體廣泛性，以及它們生理學活性的互補性。
可以從中國典型培養物保藏中心（CCTCC）（中國，武漢）和中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）（中國，北京）購得，或者從正常人的糞便或腸粘膜組織中分離得到這些細菌菌株。
為檢測本發明的益生菌發酵型參術建中口服液與原工藝生產的參術建中口服液的功能作用，下面通過對比實驗，驗證益生菌發酵型參術建中口服液與原工藝制備的參術建中口服液，對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量的影響。并進一步通過臨床對比，驗證益生菌發酵型參術建中口服液優于原工藝制備的參術建中口服液。
實驗例1：益生菌發酵型參術建中口服液與原工藝參術建中口服液益氣健脾功能實驗
本實驗旨在利用對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量的測定，舉例描述按本發明方法制備的發酵型參術建中口服液，與原工藝制備的參術建中口服液功能作用的比較。
取實施例1、2制備的益生菌發酵型參術建中口服液與原工藝制備的參術建中口服液（三株福爾制藥有限公司生產，批號151001），分別濃縮至相同濃度（按所含藥材量折算），作為供試樣品。
取SPF 級 Wistar 大鼠，雌雄各半，3 月齡，體重(180±20)g，適應性飼養 1 周后，受試動物按體重編號，用隨機數字表法分為正常對照組、模型組、原工藝組、發酵口服液A組、發酵口服液B組，每組 10 只,雌雄各半分籠飼養。以大黃法、 力竭法及饑餓法三因素復合法復制脾氣虛證模型，共 21 d。造模同時原工藝組、發酵口服液A組、發酵口服液B組給予相應藥物灌胃給藥干預，灌胃劑量 10 g/(kg·d),灌胃容積為 1 mL/100 g ，連續 3 周；空白對照組、模型組給予同體積蒸餾水灌胃。各組均以蒸餾水、標準飼料喂養。各組大鼠于末次灌胃給藥后，禁食不禁水 24 h，測體重作記錄, 采血后斷頭處死并制備待檢標本。
血清制備：股動脈取血 4 mL，靜置 2 h 后，2 000 r/min 離心 10 min，取上清,放入尖底管中 4 ℃低溫冰箱保存待測，一部分采用比色法檢測 NO、NOS,一部分采用放免法檢測 GAS。 胃、小腸組織的收集：動物處死后,迅速將近胃小彎胃組織、胃竇端小腸組織截取，稱重后分別用眼科小剪刀盡快剪碎，分別置于勻漿器中，用組織重 9 倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，后以3500 r/min離心 10 min，取上清液置 4 ℃冰箱保存，其中胃、小腸組織勻漿上清液一部分采用比色法檢測 NO、NOS,胃組織勻漿一部分采用放免法檢測 GAS。
觀察：正常對照組大鼠始終表現為反應靈敏，活動及飲食量正常,被毛濃密柔順而有光澤,糞便呈棕褐色顆粒狀。模型組大鼠多數在第 5 日即開始出現倦臥、被毛稀疏干枯；第 10 日后出現少食、怠動、消瘦、肛周污穢,部分動物出現脫肛,動作遲緩, 甚至行動歪斜,同時毛發失去正常光澤而枯槁、疏散,而后出現畏寒,成群蜷縮或拱背,并逐漸出現體重減輕,大便增多(墊料呈橘黃色)等脾虛癥狀。原工藝組大鼠第 6 日出現輕度倦臥、被毛稀疏干枯；第 13 日后出現少食、怠動、消瘦、肛周污穢,少部分動物出現脫肛,動作遲緩,大便增多等；第 16 日后上述癥狀開始減輕或消失,表現為反應較為靈敏,活動及飲食量正常,被毛疏散但有光澤,糞便部分呈顆粒狀。發酵口服液A組、發酵口服液B組大鼠第 8 日出現輕度倦臥；第 13 日后出現少食、怠動、動作遲緩，大便增多等；第 15 日后上述癥狀開始減輕或消失,表現為反應較為靈敏,活動及飲食量正常,被毛濃密柔順有光澤,糞便呈棕褐色顆粒狀。
表 1為不同制備工藝的參術建中口服液對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量的影響。
表1：各組大鼠血清及胃腸組織 NO 含量比較( x±s)
注：與正常對照組比較,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
與模型組比較,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
與原工藝組比較,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
從本實驗結果中可以看出，模型組與正常對照組各指標存在非常顯著差異（p<0.01），說明脾虛證模型組造模成功；原工藝組、發酵口服液A組、發酵口服液B組與模型組各指標存在非常顯著差異（p<0.01）或顯著性差異（p<0.05），說明原工藝與發酵制備工藝的產品均有一定的治療效果；原工藝組與發酵口服液A組、發酵口服液B組比較存在顯著差異（p<0.05），說明益生菌發酵型工藝制備的樣品比原工藝制備的樣品，對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量的影響增強。
表 2為不同制備工藝的參術建中口服液對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮合酶含量的影響。
表 2 各組大鼠血清及胃腸組織 NOS 含量比較(x±s)
注：與正常對照組比較,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
與模型組比較,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
與原工藝組比較,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
從本實驗結果中可以看出，模型組與正常對照組各指標存在非常顯著差異（p<0.01）或顯著性差異（p<0.05），說明脾虛證模型組造模成功；原工藝組、發酵口服液A組、發酵口服液B組與模型組各指標存在非常顯著差異（p<0.01）或顯著性差異（p<0.05），說明原工藝與發酵制備工藝的產品均有一定的治療效果；原工藝組與發酵口服液A組、發酵口服液B組比較存在顯著差異（p<0.05），說明益生菌發酵型工藝制備的樣品比原工藝制備的樣品，對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮合酶含量的影響增強。
表 3為不同制備工藝的參術建中口服液對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織胃泌素含量的影響。
表 3 各組大鼠血清及胃組織 GAS 含量比較(x±s）
注：與正常對照組比較,*P ＜0.05,**P ＜0.01；
與模型組比較,▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；
與原工藝組比較,△P ＜0.05，△△P ＜0.01。
從本實驗結果中可以看出，模型組與正常對照組各指標存在非常顯著差異（p<0.01），說明脾虛證模型組造模成功；原工藝組、發酵口服液A組、發酵口服液B組與模型組各指標存在非常顯著差異（p<0.01）或顯著性差異（p<0.05），說明原工藝與發酵制備工藝的產品均有一定的治療效果；原工藝組與發酵口服液A組、發酵口服液B組比較存在顯著差異（p<0.05），說明益生菌發酵型工藝制備的樣品比原工藝制備的樣品，對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織胃泌素含量的影響增強。
實驗結果表明，本發明的益生菌發酵型參術建中口服液比原工藝制備的參術建中口服液，對脾氣虛證大鼠血清及胃腸組織一氧化氮含量、一氧化氮合酶含量、胃泌素含量等指標有不同程度的提高和改善，且兩者有顯著性差異。
一氧化氮合酶(NOS)廣泛分布于胃腸道，其產物一氧化氮(NO)是非腎上腺素能非膽堿能神經的抑制性遞質，廣泛參與胃腸生理功能。NO 不僅在神經傳導、胃腸保護中起重要作用，而且參與多種病理發生的信號轉導。胃泌素(GAS)屬胃腸激素，分布于中樞神經系統和胃腸道黏膜組織，在外周作為激素調節胃的運動功能，屬興奮胃腸運動的腦腸肽之一。
脾虛證作為一種全身性的病理狀態存在著胃腸道運動功能紊亂，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化學消化能力低下，胃排空加速，小腸吸收功能下降；同時胃腸道內分泌及激素異常,餐后血清 GAS 明顯降低，G 細胞合成分泌功能減弱，出現如飲食停滯、胃脘脹悶、納呆食少、神倦乏力等癥狀均為胃腸道生理功能紊亂所致，故本實驗以脾氣虛證大鼠為對象，研究一氧化氮信號通路及 GAS 表達水平在脾氣虛證中的變化以及不同制備工藝的參術建中口服液的干預效應，比較不同制備工藝的參術建中口服液治療脾氣虛證的效果。
動物實驗證明，按照本發明的方法制備的發酵型參術建中口服液，功效優于原工藝制備的參術建中口服液。
實驗例2：臨床驗證
試驗藥物：實施例1制備的益生菌發酵型參術建中口服液A與原工藝制備的參術建中口服液（三株福爾制藥有限公司生產，批號151001）
用法用量：口服，一次10mL，一日3次。21天為一個療程，一個療程為一個周期觀察各項指標。
1、觀測指標：飲食停滯，胃脘脹悶，納呆食少，失眠多夢，頭暈心悸，神倦乏力等。
2、單項癥狀療效判定
痊愈：癥狀消失；顯效：癥狀明顯減輕，癥狀減少2個等級（+++→+）； 有效：癥狀好轉，癥狀減少1 個等級（+++→++或++→+)；無效：癥狀無改善。
3、結果
全部病例均為門診患者，實際入組病例120例，其中男58例，女62 例；病例分組，按照檢查結果，病情及中醫證候相似者平均分配在發酵型組與原工藝組中，盡量使病例有可對比性，并且高血糖患者分配在發酵型組。
臨床療效：見表4、5
表4 益生菌發酵型參術建中口服液A治療前后中醫癥候療效
表5 原工藝制備的參術建中口服液治療前后中醫癥候療效
從表4、5所示結果可以看出，本發明提供的發酵型參術建中口服液療效顯著，與原工藝制備的參術建中口服液比較療效明顯提高。說明本發明所涉及的制備方法提高了參術建中口服液的臨床療效。