miRNA?324?5p及其激活物在制備炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌臨床標志物及治療藥物中的應用的制作方法

本發明涉及一種微小rna分子的新用途,尤其涉及mirna-324-5p的新用途，屬于生物醫學技術領域。

背景技術：

炎癥性腸病(ibd)是一類病因不明的腸道慢性非特異性炎癥，包括潰瘍性結腸炎(uc)和克羅恩病(cd)。隨著研究的深入，人們逐漸意識到ibd是導致結直腸癌的一個危險因素，并且將結直腸癌年輕化。近5年來，我國ibd患者數目是20世紀90年代同期的8倍，亟需得到廣泛關注。微小rna(microrna)是一類在轉錄后水平調控基因表達的單鏈rna，長度約為22bp。mirna通過介導mrna的降解和抑制mrna轉錄這兩種方式來調控基因的表達，研究表明mirna參與多種類型腫瘤的發生及發展過程，越來越多的研究證明mirna在結直腸腫瘤的發生發展中有重要的調控作用。dicer是mirna合成過程中重要的酶，目前科學家已經利用體內及體外dicer基因敲除的模型作為研究mirna在結直腸腫瘤發生發展中作用的有效手段。申請人利用小鼠腸粘膜上皮細胞dicer基因敲除作為工具，發現純合子(dicer^loxp/loxp&villin^cre)小鼠和雜合子(dicer^loxp/+&villin^cre)小鼠腸道均有一定程度的自發炎癥，且純合敲除小鼠要重于雜合敲除小鼠；進一步的利用aom合并dss誘導結直腸癌的模型發現，dicer缺陷的小鼠易患更嚴重的腸癌。這一結果提示dicer及其下游mirna在炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌發生中具有重要的調控作用。目前還沒有進一步研究闡釋dicer及其下游某一特異的mirna參與這個病理過程，關于mir-324-5p激活物作為一種抑制炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌藥物的用途和作為炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌診斷標志物的用途目前也尚未見報道。

技術實現要素：

發明目的：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌藥物的不足及臨床上炎癥性腸病診斷標志物的局限，通過對dicer及其下游mirna的深入研究，在mirna-324-5p原有研究的基礎上，通過大量實驗篩選，開發出mirna-324-5p新用途。

技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

本發明提供mirna-34-5p在制備炎癥性腸病臨床檢測標志物中的應用。

本發明另一個目的是提供mirna-324-5p激活物在制備治療炎癥性腸病藥物中的應用。

本發明另一個目的是提供mirna-324-5p激活物在制備治療炎癥性腸病相關結直腸癌中的應用。

一種具有治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌的藥物制劑，該藥物制劑為含有mirna-324-5p化合物的口服制劑或注射劑。

作為優選方案，以上所述的具有治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌的藥物制劑，其特征在于，所述的口服制劑為腸溶性片劑、膠囊劑、丸劑或顆粒劑。

mir-324-5p的核苷酸序列為cgcauccccuagggcauuggugu。其序列如no1。

本發明所述的mir-324-5p激活物為經過化學修飾過的mir-324-5p(cgcauccccuagggcauuggugu)序列，其序列如no2。實驗中通過腹腔注射給藥的方式將mir-324-5p激活物(agomir-324-5p)注入小鼠體內。

本發明首先采用基因芯片的方法對3對(rko、dld1、hct116)dicer基因敲除(dicer^-/-)的結直腸癌細胞系及其對照細胞系(dicer-wt)進行篩選，實驗結果表明mir-324-5p水平在dcier敲除的細胞中下降最為明顯；對野生型小鼠和腸粘膜上皮細胞dicer基因敲除小鼠的腸粘膜組織進行rt-pcr實驗，實驗結果表明隨著小鼠自發ibd癥狀的加劇，mir-324-5p的水平也顯著下降。另外，用dicer基因敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)和其同窩野生型小鼠(dicer^loxp/+)作為工具，aom合并dss誘導小鼠結直腸癌的動物模型中，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠更易患嚴重的結直腸癌。以上結果都表明mirna-324-5p水平下調和ibd及ibd相關結直腸癌的發生直接相關，因此通過mirna-324-5p激活物過表達可抑制ibd的發生及緩解其發展，也能夠成為治療ibd相關結直腸癌的有效藥物。

本發明應用dss誘導的小鼠結腸炎動物模型模擬人炎癥性腸病模型，用野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer基因敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)作為工具；通過腹腔注射mir-324-5p激活物的方式提高局部mir-324-5p的水平。實驗結果表明mir-324-5p過表達后，dss誘導的dicer^loxp/+&villin^cre小鼠腸粘膜損傷顯著下降，腸粘膜屏障完整性升高，炎性細胞浸潤顯著減少，炎癥性腸病的癥狀得到顯著緩解，表明mir-324-5p激活物可提高腸粘膜完整性，發揮很好的抑制ibd的功效，因此對炎癥性腸病相關結直腸癌的預防及治療都有一定的作用。

有益效果：本發明通過大量實驗研究篩選，實驗結果表明mirna-324-5p在炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結直腸癌發生發展中的重要作用。mir-324-5p下降伴隨著腸粘膜屏障損傷以及粘膜上皮細胞大量脫落，炎性細胞浸潤顯著增加，腸道炎癥顯著加劇；在持續的炎癥刺激下，患者易患結直腸腫瘤。因此，通過mirna-324-5p激活物來提高局部的mir-324-5p水平，能顯著緩解腸道炎癥，進而預防與治療ibd及ibd相關結直腸腫瘤。因此mir-324-5p激活物可作為制備防治炎癥性腸病及炎癥腸病相關結直腸癌的藥物，同時mir-324-5p也可作為炎癥性腸病及的臨床檢測標志物。

附圖說明

圖1是dicer在3對結直腸癌dicer敲除細胞系中mrna水平的柱狀圖。

圖2是mirna-324-5p在3對結直腸癌dicer敲除細胞系中mrna水平的柱狀圖。

圖3是dicer基因敲除小鼠腸粘膜上皮細胞中dicer基因mrna水平的柱狀圖。

圖4是mir-324-5p在dicer基因敲除小鼠腸粘膜上皮細胞中mrna水平的柱狀圖。

圖5是野生型小鼠(dicer^loxp/+)和腸粘膜上皮細胞dicer敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)在aom合并dss誘導小鼠結直腸癌模型的模式圖以及小鼠處死后腸腫瘤的照片。

圖6是圖5中所述動物模型中腫瘤最大徑總和的數據統計圖(n＝8)。

圖7是圖5中所述動物模型中結腸的重量/長度的比值的統計圖(n＝8)。

圖8是圖5中所述動物模型中每只小鼠結腸腫瘤數目的統計圖(n＝8)

圖9是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導小鼠結腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動物模型處死后的結腸照片圖。

圖10是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導小鼠結腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動物模型中將小鼠結腸稱重及測量長度，計算結腸重量與長度比值的柱狀圖。

圖11是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導小鼠結腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動物模型，小鼠結腸組織he染色的結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

實施例1mir-324-5p作為炎癥性腸病診斷標志物的實驗

1.體外結直腸腫瘤細胞的培養：

3種野生型結直腸癌細胞(rko、dld1、hct116)及其對應的dicer基因敲除的細胞(dicer^-/-)培養在含10％fbs的1640培養基中，置于37℃、5％co2培養箱中生長，至對數生長期用于試驗；細胞生長至融合度大于80％時，進行傳代：pbs緩沖液洗2遍，胰酶體積約覆蓋細胞表面，37℃培養箱作用1min，顯微鏡明場下觀察，可見細胞收縮邊緣清晰時，棄去消化液，加入完全培養基終止消化，用移液器吹打瓶壁上的細胞制成單細胞懸液，接種到新的培養皿內培養。

2.小鼠的培育及觀察

小鼠飼養條件保持在溫度22-28℃，相對濕度40％-60％，噪音<60db，日夜溫差為2℃，晝夜交替各為12h。飲用水為高壓滅菌純凈水，每周換水3次，鼠籠及墊料每周更換。應用含有loxp序列的dicer^loxp/loxp小鼠與含有腸粘膜上皮特定啟動子villin驅動的cre重組酶小鼠進行數代的雜交。每天對比觀察野生型小鼠(dicer^loxp/+)、dicer雜合缺失型小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)和dicer純和缺失型小鼠(dicer^loxp/loxp&villin^cre)的進食、飲水及活動等日常狀態，定期記錄小鼠體重、生存時間。

3.rna提取

細胞的rna直接收取細胞后按照trizol法抽提總rna。小鼠原代腸粘膜上皮細胞的分離需要將小鼠結腸取出后置于冰pbs中清洗數次，將腸剪成長度為2-3mm長度的片段后放入螯合緩沖液(27mm檸檬酸鈉、5mmna2po4、96mmnacl、8mmkh2po4、1.5mmkcl、0.5mmdtt、55mm山梨醇、44mm蔗糖、6mmedta、5mmegta、ph7.3)中4℃劇烈搖晃45min；用100μm細胞過濾器去除組織碎片，細胞懸液1500rpm離心后得到腸上皮細胞；然后按照trizol法提取總rna。測定濃度后取1μg總rna進行反轉錄，得到的cdna產物稀釋10倍用于rt-pcr的模板。

4.采用rt-pcr進行mirna定量分析

mirna的定量分析采用特異性的莖環結構反轉錄引物進行反轉錄后再進行定量pcr檢測。購買銳博生物公司(中國、廣州)的特異mir-324-5p頸環引物試劑盒進行實驗(bulge-loop^tmmirnaqrt-pcrprimersets)。

如圖1和圖2所示，采用rt-pcr的mirna定量分析結果表明，mirna-324-5p在dicer基因敲除的細胞中顯著降低；如圖3和圖4所示，取野生小鼠、dicer雜合敲除小鼠和dicer純合敲除小鼠腸粘膜細胞進行mirna的rt-pcr實驗，結果顯示隨著dicer基因敲除程度的增加，mir-324-5p的水平顯著降低。以上結果表明隨著小鼠腸ibd的加劇，mir-324-5p作為dicer下游特異的mirna會顯著下降，因此mir-324-5p可作為炎癥性腸病臨床檢測標志物。

5.aom合并dss誘導小鼠結腸癌的動物模型

隨機選取6-8周dicer^loxp/+&villin^cre小鼠及同窩dicer^loxp/+小鼠，按注射濃度為10mg/kg氧化偶氮甲烷(aom)于第1、22、53天分三次腹腔注射于小鼠體內，同時在第1、4、7周自由飲用含2％葡聚糖硫酸鈉(dss)的蒸餾水，第10周處死小鼠。如圖5所示，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠結腸上肉眼所見腫瘤顯著多于dicer^loxp/+小鼠；圖6對腫瘤最大徑的總和進行統計，表明dicer^loxp/+&villin^cre小鼠上腫瘤顯著大于dicer^loxp/+小鼠；圖7對兩組小鼠結腸重量/長度的比值進行統計(側面反映腫瘤重量)，結果顯示dicer^loxp/+&villin^cre小鼠顯著高于dicer^loxp/+小鼠；圖8對兩組小鼠上腫瘤的數目進行統計，發現dicer^loxp/+&villin^cre小鼠顯著多于dicer^loxp/+小鼠。以上結果表明dicer缺失的小鼠易患更嚴重的結腸癌，而mir-324-5p作為dicer基因下游特異的mirna，其下降也會導致ibd相關腸癌的發生。

實施例2mirna-324-5p激活物治療炎癥性腸病的動物實驗

1.實驗分組：

選用6-8周、雄性野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer雜合敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)各自隨機分為三組：對照飲水組(水)，dss誘導組(dss)，dss誘導同時mir-324-5p激活物腹腔注射組(dss+agomir-324-5p)。

2.實驗方法：

將分子量為dss(mw：36000-50000)溶于飲用水，配成3％dss溶液。同窩野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer雜合敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)小鼠分別自由飲用蒸餾水和含3％dss的蒸餾水。在第2天時進行腹腔注射濃度為10nm的agomir-324-5p或其對照200μl/只，每天觀察小鼠進食、飲水及活動等日常狀態，并記錄小鼠體重。第7天處死小鼠觀察。

3.實驗結果

dss誘導結腸炎后，mirna-324-5p激活物干預治療組小鼠體重比未干預的dicer^loxp/+&villin-cre小鼠體重顯著回升，具有明顯差異(p＜0.05)。

如圖9為小鼠處死后結腸的拍照圖，結果顯示dss誘導下dicer^loxp/+小鼠和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠的結腸長度都顯著減少；當腹腔注射agomir-324-5p后，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠的結腸長度出現回升。

如圖10為小鼠結腸重量與長度(g/cm)比值的統計柱狀圖，結果顯示agomir-324-5p干預后能夠顯著降低這個比值，表明干預后的炎癥性腸病癥狀得到明顯減輕，具有明顯差異(p＜0.05)。

如圖11為小鼠結腸組織石蠟切片的he染色結果，結果顯示dss誘導下dicer^loxp/+&villin^cre小鼠腸粘膜上皮細胞大量脫落，炎性細胞浸潤加劇，粘膜上皮失去原有組織形態，粘膜屏障消失；當用mirna-324-5p激活物agomir-324-5p干預后，粘膜上皮細胞形態得到很好的恢復，炎癥程度減輕。

并且實驗過程中，未見有明顯不良反應，有望開發成新一代安全有效，防治炎癥性腸病及炎癥性腸病相關結腸癌的新藥。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理和構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。