本發明涉及止血凝膠技術領域，具體涉及一種聚己內酯-胎牛皮膠原纖維復合止血凝膠的制備方法。
背景技術：
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在外科和創傷手術中經常會伴隨著創面的大量出血，從而使患者面臨極大的生命危險，因此制備快速有效的止血材料一直作為醫用領域的研究熱點。傳統的止血材料存在不易攜帶和消毒保存的缺點，且止血幾乎靠機械作用，止血效果不好。近年來，人們研制出生物可吸收止血材料，其中動物皮膠原基材料作為一種生物性能良好的醫用材料，與人體具有良好的組織相容性，可生物降解且無毒副作用，同時能夠促進細胞的粘附、增殖和創口的復合；并且通過其特有的微孔結構和良好的粘附性，促進生物因子的生長擴散，誘導并促進成纖維細胞的生長，從而促進傷口的愈合。
目前，普遍的動物皮膠原提取制備方法為酸酶結合提取法，主要包括原料的預處理、脫脂、酶解消化、鹽析、離心和純化等步驟，但存在所得皮膠原純度和產率低、成本高等問題，并且會因提取過程中處理不當而使皮膠原降低或失去生物力學性能，從而影響其止血效果。針對這一問題，本公司從皮膠原的提取方法入手，并結合對提取皮膠原的改性處理以及助劑的添加制備止血凝膠材料，在低成本的基礎上提高止血效果、生物相容性、生物降解性和使用安全性。
技術實現要素：
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本發明所要解決的技術問題在于提供一種制備簡單、止血效果好且具有優異生物相容性與生物降解性的聚己內酯-胎牛皮膠原纖維復合止血凝膠的制備方法。
本發明所要解決的技術問題采用以下的技術方案來實現：
一種聚己內酯-胎牛皮膠原纖維復合止血凝膠的制備方法，包括如下步驟：
(1)胎牛皮預處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環境中冷凍5～8h，再用溫度5-10℃、質量分數5％的小蘇打與六偏磷酸鈉混合水溶液浸泡10～15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2～3次；
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2～1.5:1的比例將環丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理15～30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3～5min，然后加熱至回流狀態保溫攪拌30～60min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分攪拌后靜置分層，取水相，即得提取溶劑；
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的胎牛皮送入冷凍干燥機中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制提取溶劑中，充分分散后靜置10～15min，靜置結束后轉入球磨機中，球磨至細度小于50μm，然后加入質量分數5％的聚維酮K30與氫化蓖麻油聚氧乙烯醚混合水溶液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機對所得混合物處理10～15s，處理結束后轉入0～5℃環境中靜置3～5h，隨后加入聚丙烯酸和聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態保溫攪拌15～30min，最后過270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液；
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制膠原纖維溶液中加入聚己內酯、聚乙二醇4000和甲硫氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置1～2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理2～3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機處理10～15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫攪拌10～15min，即得改性膠原纖維溶液；
(5)止血凝膠的制備：向上述所制改性膠原纖維溶液中加入聚乙醇酸、聚卡波菲、胱氨酸和止血藥物，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
所述步驟(1)中小蘇打與六偏磷酸鈉的用量質量比為2～3:1。
所述步驟(3)中胎牛皮、提取溶劑、聚維酮K30、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚、聚丙烯酸和聚氧化乙烯的用量質量比10～15:40～50:2～3:1～2:0.5～1:0.5～1。
所述步驟(3)中聚丙烯酸使用前經過化學改性，其改性方法為：將聚丙烯酸和酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態保溫攪拌10min，再加入白藜蘆醇和乙二胺四乙酸二鈉，繼續于回流狀態下保溫攪拌30min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉入0-5℃環境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機中，干燥后所得固體經研磨制成粉末。
所述聚丙烯酸、酪氨酸、白藜蘆醇和乙二胺四乙酸二鈉的用量質量比為10～15:1～2:3～6:0.5～1。
所述步驟(4)中膠原纖維溶液、聚己內酯、聚乙二醇4000和甲硫氨酸的用量質量比25～30:3～6:1～2:0.5～1。
所述步驟(5)中改性膠原纖維溶液、聚乙醇酸、聚卡波菲、胱氨酸和止血藥物的用量質量比25～30:2～3:1～2:0.5～1:0.5～1。
所述止血藥物選自具有止血功效的化學藥物或中藥提取物。
本發明的有益效果是：本發明以可溯源純化胎牛皮為原料，提取制備膠原纖維溶液，并利用聚己內酯接枝改性所提取的膠原纖維，以及輔以多種助劑制得止血凝膠，該止血凝膠可直接覆蓋到出血位置，發揮止血效果，且止血迅速，有效減少出血量的同時促進創面的修復；同時具有優異的生物相容性和生物降解性，使用安全性高，使用后無任何毒副作用。
具體實施方式：
為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
實施例1
(1)胎牛皮預處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環境中冷凍8h，再用溫度5-10℃、質量分數5％的小蘇打與六偏磷酸鈉(小蘇打與六偏磷酸鈉的用量質量比為3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2次；
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2:1的比例將環丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理5min，然后加熱至回流狀態保溫攪拌60min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分攪拌后靜置分層，取水相，即得提取溶劑；
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的10份胎牛皮送入冷凍干燥機中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制40份提取溶劑中，充分分散后靜置15min，靜置結束后轉入球磨機中，球磨至細度小于50μm，然后加入質量分數5％的3份聚維酮K30與1份氫化蓖麻油聚氧乙烯醚混合水溶液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機對所得混合物處理15s，處理結束后轉入0～5℃環境中靜置5h，隨后加入0.5份聚丙烯酸和1份聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態保溫攪拌30min，最后過270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液；
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制30份膠原纖維溶液中加入5份聚己內酯、2份聚乙二醇4000和0.5份甲硫氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機處理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫攪拌15min，即得改性膠原纖維溶液；
(5)止血凝膠的制備：向上述所制25份改性膠原纖維溶液中加入2份聚乙醇酸、2份聚卡波菲、0.5份胱氨酸和1份止血藥物(止血藥物選自具有止血功效的化學藥物或中藥提取物)，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
聚丙烯酸的改性：將10份聚丙烯酸和1份酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態保溫攪拌10min，再加入3份白藜蘆醇和0.5份乙二胺四乙酸二鈉，繼續于回流狀態下保溫攪拌30min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉入0-5℃環境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機中，干燥后所得固體經研磨制成粉末。
實施例2
(1)胎牛皮預處理：以可溯源純化胎牛皮為原料，將其完全展開后用保鮮膜包裹好，并置于-5～0℃環境中冷凍5h，再用溫度5-10℃、質量分數5％的小蘇打與六偏磷酸鈉(小蘇打與六偏磷酸鈉的用量質量比為3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去離子水沖淋下用海綿刷刷洗表面2次；
(2)膠原纖維提取溶劑的制備：按照摩爾比1.2:1的比例將環丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超聲頻率40kHz、功率50W下超聲處理30min，再于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理4min，然后加熱至回流狀態保溫攪拌60min，待混合溶液自然冷卻至50-55℃后加入等重量的5-10℃去離子水，充分攪拌后靜置分層，取水相，即得提取溶劑；
(3)膠原纖維溶液的制備：將上述刷洗后的15份胎牛皮送入冷凍干燥機中，干燥至含水量為10-15％后利用碎皮機粉碎成粒度為2-3mm的顆粒，再加入上述所制50份提取溶劑中，充分分散后靜置15min，靜置結束后轉入球磨機中，球磨至細度小于50μm，然后加入質量分數5％的2份聚維酮K30與2份氫化蓖麻油聚氧乙烯醚混合水溶液，充分混合后利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機對所得混合物處理15s，處理結束后轉入0～5℃環境中靜置5h，隨后加入0.5份聚丙烯酸和0.5份聚氧化乙烯，并加熱至回流狀態保溫攪拌15～30min，最后過270目篩，所得濾液即為膠原纖維溶液；
(4)改性膠原纖維溶液的制備：向上述所制25份膠原纖維溶液中加入4份聚己內酯、1份聚乙二醇4000和0.5份甲硫氨酸，分散均勻后于35～40℃密封靜置2h，充分混合，然后于微波頻率2450MHz、功率700W下微波處理3min，再次充分混合，并利用工作頻率40Hz、功率600W的等離子表面處理機處理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷卻降溫，待溫度降至0～5℃后保溫攪拌15min，即得改性膠原纖維溶液；
(5)止血凝膠的制備：向上述所制30份改性膠原纖維溶液中加入3份聚乙醇酸、2份聚卡波菲、0.5份胱氨酸和1份止血藥物(止血藥物選自具有止血功效的化學藥物或中藥提取物)，充分混合均勻后分裝入模具中，并利用γ射線消毒滅菌，最后經包裝后于0～5℃條件下低溫保存。
聚丙烯酸的改性：將15份聚丙烯酸和2份酪氨酸加入兩倍重量份乙醇中，分散均勻后加熱至回流狀態保溫攪拌10min，再加入5份白藜蘆醇和0.5份乙二胺四乙酸二鈉，繼續于回流狀態下保溫攪拌30min，所得混合物自然冷卻至35-40℃后立即轉入0-5℃環境中靜置8h，然后送入噴霧干燥機中，干燥后所得固體經研磨制成粉末。
對實施例1和2所制備的止血凝膠進行性能測定，結果如下：
外觀：凝膠狀，表面光滑，無肉眼可見之雜質；
水分含量：≤80％(wt)；
凝膠強度：100～500g/cm2；
重金屬含量：≤10μg/g(m/m)；
脂質體：≤1％(m/m)；
灰分：≤2％(m/m)；
pH值：≥4.0；
生物降解性：體內一月內全部降解；
抗菌/抑菌性能：對大腸桿菌、金球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑菌率均≥50％；
溶血率：≤5％；
細胞毒性：細胞毒性反應不大于1級；
無菌試驗：無菌；
致敏試驗：無遲發性超敏反應；
皮內反應試驗：原發性刺激指數PII<0.4；
外源性DNA含量：外源性DNA殘留量應≤10ng/ml(m/v)
熱源：無熱源；
急性全身毒性：無急性全身毒性；
遺傳毒性：無遺傳毒性；
凝膠時間：≤30s；
止血時間：≤1min。
以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。