本發明涉及一種豬藍耳病純化疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是一種危害養豬業的病毒性傳染病，是20世紀80年代末暴發的一種新型傳染病。1987年美國首次報道了該病的發生，當時稱之為豬神秘病(Mysteryswinedisease，MSD)，主要癥狀是妊娠母豬發熱、厭食、早產、流產、死產、木乃伊胎、弱仔等。(嚴玉霖，高洪。豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術研究進展[J]。動物醫學進展，2008，29(7)：81-85)(Grebennikova T V,Clouser D F,Vorwald A C,et al.Genomiccharacterization of virulent,attenuated,and revertant passages of aNorth American porcine reproductive and respiratory syndromevirus strain[J].Virology,2004,321:383-390.)。隨后，該病迅速蔓延至歐洲養豬國家，造成了100萬頭豬的死亡，使歐美國家的養豬業蒙受了災難性的經濟損失。20世紀90年代中期該病蔓延至亞太地區。1996年，中國郭寶清等證實本病在國內的存在，并用豬巨噬細胞和Marc-145細胞成功分離了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，隨后在全國大部分省市均有報道，成為重要豬病之一。(郭寶清，陳章水，劉文興，等。從疑似PRRS流產胎兒分離PRRSV的研究[J]。中國畜禽傳染病，1996，18(2):1-4)。2006年4月，以仔豬高死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征在我國南方部分省、市暴發，給我國養豬業造成了較大的損失。2008年6月，曾報道該病在湖南部分地區暴發，呈地方流行性。2010年上半年在我國部分地區發生了以商品豬和母豬死亡率上升為主的所謂“高熱病”，甚至在有些地區商品豬的死亡率超過50％，母豬的死亡率也高達5％以上。(沈武玲，喬自林，令世鑫，等。豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究現狀[J]。動物醫學進展，2012，33(1)：117-120)。該病已在很多省市豬群流行，已成為規模化養豬場繁殖障礙的主要病因。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征列為二類動物傳染病。豬繁殖與呼吸綜合征的流行特點及其病原特性決定了該病一旦在豬群中出現，將很快通過空氣和接觸及人工授精等途徑傳播開來，特別是在規模化、集約化、現代化的高密度養豬地區，該病傳播尤為迅猛，經濟損失更為嚴重。疫苗的研究和使用是目前預防本病的最主要手段。
現有的豬藍耳病疫苗主要存在以下三個問題：1.免疫保護力不穩定，主要表現在：免疫后檢測不到中和抗體或者抗體水平很低，或者免疫期較短，只有2～3個月；2.免疫副反應大，主要是：下游生產工藝仍為傳統方法，未經純化處理，疫苗中存在一些血清和宿主細胞中的雜質及過敏性物質，而且有效抗原含量低。3.疫苗病毒含量低，現有藍耳病病毒大規模生產多采用轉瓶工藝，但生產過程中存在手工操作密集，細胞維持時間短，密度及活力低等問題，限制了產品的產量和穩定性。這對豬藍耳病的免疫防控工作帶來極大的影響。
技術實現要素：
本發明的目的是是提供一種使用Marc-145細胞系無血清生產豬藍耳病病毒液，并通過將中空纖維柱、離心、分子篩層析柱技術應用于藍耳病病毒液純化上獲得豬藍耳病純化疫苗的方法。
本發明的技術方案
1.一種豬藍耳病純化疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)細胞懸浮培養：將Marc-145細胞進行懸浮培養；
(2)接毒方法：將豬藍耳病病毒種子培養液接入以上懸浮培養的細胞中，繼續培養至收獲時，收獲培養病毒液；
(3)將收獲的病毒液采用中空纖維柱進行澄清、微濾、濃縮后，采用連續流蔗糖密度梯度離心或分子篩層析柱對濾液進行純化；
(4)采用滅活劑滅活純化的病毒液后與佐劑混合配置滅活疫苗或者將純化的病毒液與凍干保護劑混勻分裝后經凍干制成活疫苗。
2.如權利要求1所述的一種豬藍耳病純化疫苗的制備方法，其特征在于所述Marc-145細胞進行懸浮培養的方法是：取超低溫凍存的Marc-145全懸浮適應株細胞，快速融化后加入搖瓶中培養擴大，取密度為3×105～3×106/ml的細胞接入細胞罐，得到Marc-145細胞全懸浮培養液；
3.如權利要求1所述的一種豬藍耳病純化疫苗的制備方法，其特征在于所述接毒方法是：Marc-145細胞在生物反應器中培養24～72小時，密度為6×105/ml～6×106/ml，按照體積比0.1％～1.0％接種藍耳病病毒，繼續培養至80％左右的細胞出現典型CPE時，收獲病毒液。
4.如權利要求1所述的一種豬藍耳病純化疫苗的制備方法，其特征在于所述生物反應器的培養參數為：轉速60～150r/min，病毒培養溫度為33～38℃，溶氧30％～60％，pH 7.0～7.4。
5.如權利要求1所述的一種豬藍耳病純化疫苗的制備方法，其特征在于所述Marc-145猴胚胎腎上皮細胞系(Monkey embryonic kidney epithelial cell line)全懸浮適應株，簡稱Marc145-QLS株，是由猴胚胎腎上皮貼壁細胞Marc-145株經貼壁培養階段的低血清馴化過程和低血清培養液懸浮馴化過程而獲得，已于2016年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記編號為CGMCC NO.12697。
本發明具體實施方式
1.使用搖瓶復蘇液氮凍存的Marc145細胞，等細胞生長到需要量(密度為3×105～3×106/ml時將細胞接入細胞罐，接種細胞生物反應器進行培養24～72小時，細胞增長情況符合細胞增殖要求，與搖瓶培養的細胞的增殖速度、細胞活力、平臺期接近，密度為6×105/ml～6×106/ml；
2.當細胞密度為6×105/ml～6×106/ml，按(V/V)0.1％接種藍耳病毒病種毒，等細胞活力小于70％時，取樣測定病毒滴度(TCID50/ml)繼續培養至80％左右的細胞出現典型CPE時，收獲病毒液；
3.收獲的病毒液經澄清或連續流離心除去細胞碎片等雜質，根據藍耳病毒的大小，可選用100KD分子截留值的超濾膜，對病毒液進行50～100倍濃縮后得到純化病毒液。
4.純化病毒液用0.22μm濾膜過濾后，用PBS(pH7.2)稀釋，按1:1加入凍干保護劑，混合均勻，經分裝、凍干制備成豬藍耳病凍干活疫苗；
5.純化病毒液用0.22μm濾膜過濾后，加入1/4000β丙內酯，37℃滅活3～4天，經滅活檢驗合格后，加入乳劑經乳化制備成豬藍耳病滅活乳劑苗。
以上本發明所使用的Marc145細胞為猴胚胎腎上皮細胞系(Monkey embryonic kidney epithelial cell line)全懸浮適應株，簡稱Marc145-QLS株，是由猴胚胎腎上皮貼壁細胞Marc-145株經貼壁培養階段的低血清馴化過程和低血清培養液懸浮馴化過程而獲得，該株細胞已于2016年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記編號為CGMCC NO.12697。
詳見圖1，豬藍耳病純化疫苗生產工藝流程圖。
附圖說明
圖1豬藍耳病純化疫苗生產工藝流程圖。
本發明涉及的生物材料資源信息
本發明涉及到的Marc-145為猴胚胎腎上皮細胞系(Monkey embryonic kidney epithelial cell line)全懸浮適應株，簡稱Marc145-QLS株，是由猴胚胎腎上皮貼壁細胞Marc-145株經貼壁培養階段的低血清馴化過程和低血清培養液懸浮馴化過程而獲得，該株細胞已于2016年8月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記編號為CGMCC NO.12697；Marc-145細胞為猴胚胎腎上皮細胞系MA104株的克隆株，是由美國菌種保藏中心(ATCC)引進，本發明人購自中國獸醫藥品監察所中國獸醫微生物菌種保藏管理中心；豬藍耳病純化疫苗生產和檢驗用用為：
NVDC-JXA1株，保藏信息如下：分類命名：豬繁殖與呼吸綜合征病毒，拉丁文學名：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2007年3月9日保藏編號：CGMCC No.1964。
病毒弱毒株JXA1-R株，保藏信息如下：分類命名：豬繁殖與呼吸綜合征病毒，拉丁文學名：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2008年4月29日，保藏編號：CGMCC No.2467。
以上兩株病毒均購自中國動物疾病預防控制中心。
本發明的積極意義
本發明涉及一種豬藍耳病純化疫苗及其生產方法。其中還涉及Marc-145的全懸浮細胞株及其在制備豬藍耳病疫苗中的應用。制備豬藍耳病純化疫苗，包括以下步驟：1)懸浮馴化獲得Marc145的全懸浮細胞株；2)制苗用細胞的無血清懸浮培養；3)藍耳病毒的培養及收獲；4)病毒液純化；5)疫苗的配置。采用本方法制備疫苗，解決了現有疫苗抗原含量低、血清殘留和細胞殘留等問題，可有效提高疫苗免疫效力，降低過敏反應。該方法使用無血清培養基全懸浮培養Marc-145細胞生產豬藍耳病毒，配合超濾設備對病毒進行濃縮、純化，是簡單、便宜、高效的純化方法。
實施例
以下是本發明具體的實施方案，以進一步闡述本發明，但不能解釋為限制本發明的范圍。本領域技術人應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍內。
實例中所使用的生物反應器為荷蘭Applikon Biotechnology公司產品和德國賽多利斯集團產品；
實施例1
——Marc-145細胞的全懸浮培養
使用搖瓶復蘇液氮凍存的細胞，等細胞生長到需要量時，接種細胞生物反應器進行培養，
具體步驟如下：
(1)取液氮凍存的Marc145-QLS株細胞，37℃快速水浴融化后，接種到搖瓶培養基中，37℃培養，轉速設置分別為120r/min。細胞復蘇后培養3～4天按0.5×106個/ml的接種密度進行傳代擴大培養。
(2)將上述步驟(1)擴大培養的細胞稀釋至1.0×106個/ml的密度接種生物反應器，溫度27℃，pH 7.2，DO50％，轉速120r/min的條件下培養擴大。細胞增長情況符合細胞增殖要求，與搖瓶培養的細胞的增殖速度、細胞活力、平臺期接近。細胞生長情況如表1所示。
表1細胞生物反應器全懸浮培養Marc145-QLS細胞
實施例2
——Marc145-QLS細胞培養藍耳病毒弱毒株
接毒時細胞密度為2.5×106個/ml，0.1％接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株，等細胞活力小于70％時，取樣測定病毒滴度(TCID50/ml)，結果見表2。
表2不同細胞密度接種的病毒效價
實施例3
——Marc145-QLS細胞培養藍耳病毒液純化
收獲的細胞懸液經澄清或連續流離心除去細胞碎片等雜質，根據藍耳病毒的大小，可選用100KD分子截留值的超濾膜，對病毒液進行50～100倍濃縮。高倍濃縮溶液置于裝Separate6FF層析柱，用pH7.0～7.4、0.01M PBS緩沖液平衡后，進行柱層析，用紫外分光光度計A280nm檢測洗脫液，病毒流出，收集貯存于4℃，得到純化病毒液。
實施例4
——活疫苗制備
JXA1-R株純化病毒液用0.22μm濾膜過濾后，用PBS(pH7.2)稀釋，按1:1加入凍干保護劑，混合均勻，分裝到疫苗瓶中，凍干，封蓋。
實施例5
——活疫苗檢驗
(1)性狀微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
(2)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄(中國獸藥典委員會編.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部，中國農業出版社，2011年，本發明稱《中國獸藥典》)進行檢驗，均無菌生長。
(3)支原體檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無支原體生長。
(4)外源病毒檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無外源病毒污染。
(5)鑒別檢驗將疫苗按照瓶簽注明頭份稀釋成1頭份/ml，混合均勻，再稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量豬繁殖與呼吸道綜合征病毒特異性陽性血清混合，置37℃中和30分鐘后，接種已長成單層的Marc-145細胞24孔細胞培養板，每種細胞各接種12孔，每孔0.5ml。同時設不中和對照組(將疫苗按照瓶簽注明頭份稀釋成1頭份/ml，混合均勻，再稀釋至200TCID50/0.1ml，與等量培養液混合)和正常細胞對照組，各接種6孔，每孔0.5ml。每孔補加含2％新生牛血清的細胞培養液0.5ml。將細胞培養板置37℃、含5％CO2培養箱中培養，觀察96～120小時。中和組和細胞對照組未出現CPE，不中和對照組均全部出現CPE。
(6)安全檢驗用4～6周齡健康易感仔豬5頭，每頭肌肉接種疫苗10頭份，觀察14日，與接種前相比仔豬精神、食欲、體溫無明顯變化。
(7)效力檢驗下列方法任擇其一。
1)PRRSV病毒含量測定用含2％新生牛血清的培養液將疫苗稀釋至1頭份/ml，作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6 4個稀釋度，分別接種已長成單層的Marc-145細胞96孔微量細胞培養板，每個稀釋度接種8孔，每孔100μl，同時設不接毒對照8孔。每孔補加含2％新生牛血清的細胞培養液100μl。置37℃、含5％CO2培養箱中培養，觀察96～120小時，記錄CPE孔數。按Reed-Muench法計算TCID50，每頭份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。
2)免疫攻毒法用4～6周齡健康易感仔豬10頭，隨機分為2組，每組5頭。一組各肌肉注射疫苗1頭份，另一組不接種疫苗。免疫28日后，將5頭免疫仔豬，連同條件相同的5頭對照仔豬，各肌肉注射強毒株3ml(含104.5TCID50/ml)，連續觀察21日，對照仔豬全發病，免疫仔豬至少保護4頭。
(8)真空度測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，均符合規定。
(9)剩余水分測定按《中國獸藥典》附錄進行測定，均符合規定。
實施例6
——Marc145-QLS細胞培養藍耳病毒
接毒時細胞密度為2.5×106個/ml，0.1％接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXA1株，等細胞活力小于70％時，取樣測定病毒滴度(TCID50/ml)。
實施例7
——病毒液滅活
NVDC-JXA1株純化病毒液用0.22μm濾膜過濾后，加入1/4000β丙內酯，37℃滅活3～4天，貯存于4℃備用。將滅活病毒原液接種Marc-145細胞，35～37℃培養，觀察14天應無細胞病變，將培養物再接種Marc-145貼壁細胞傳代第二代，仍無細胞病變。
實施例8
——滅活疫苗制備
(1)油乳劑按94％白油加6％司本-80和2％硬脂酸鋁配制而成。
(2)配苗及分裝滅活后的純化毒液用PBS(pH7.2)稀釋，加20％吐溫-80為水相，使用膠體磨按3份油相和7份水相的比例配苗。在慢速攪拌的1份油相中緩慢加入1份水相，再以8000r/min充分乳化，形成油包水乳劑。再將3份油包水乳劑緩慢加入2份水相中，再以8000r/min充分乳化，形成水包油包水(W/O/W)的雙相油乳劑苗。
實施例9
——滅活疫苗檢測
(1)性狀
1)外觀乳白色乳劑。
2)劑型為水包油包水型，用吸管取少量疫苗于冷水中，第1滴呈云霧狀擴散，其余不擴散。
3)粘度用1ml吸管吸取乳劑苗1ml，垂直放出0.4ml所需的時間均在2秒以內。
4)穩定性將疫苗置試管內，3000r/min離心15min，有分層。置室溫1周逐漸分為二層乳狀液，在4～10℃保存不破乳。
(2)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均無菌生長。
(3)安全檢驗用4～6周齡健康敏感仔豬5頭，各肌肉注射疫苗5ml。逐日觀察14日，應無不良反應。若有體溫反應，應不超過正常體溫1℃，稽留期不超過24小時。
(4)效力檢驗用4～6周齡健康易感仔豬10頭，隨機分為2組，每組5頭。一組各肌肉注射疫苗1頭份，21日后，再以同樣方式注射疫苗1頭份，另一組不接種疫苗。28日后，將5頭免疫仔豬，連同條件相同的5頭對照仔豬，各肌肉注射強毒株3ml(含104.5TCID50/ml)，連續觀察21日，對照仔豬全發病，免疫仔豬至少保護4頭。
實施例10
——安全檢驗
分別采用實施例5方法(6)安全檢驗和實施例8方法(3)安全檢驗方法對豬藍耳病純化疫苗，進行安全檢驗，結果見表3。
表3安全檢驗結果
實施例11
——效力檢驗
分別采用實施例5方法(7)-2)免疫攻毒法效力檢驗和實施例8方法(4)效力檢驗方法對豬藍耳病純化疫苗，進行效力檢驗，結果見表4。攻毒用強毒株為NVDC-JXA1株。
表4效力檢驗結果