蝦青素和/或氯化鋰在制備預防和治療慢性有機磷中毒所致的認知障礙病癥的藥物中的應用的制作方法

本發明屬于藥物領域，具體涉及蝦青素和/或氯化鋰在制備預防和治療慢性有機磷中毒所致的認知障礙病癥的藥物中的應用。

背景技術：

有機磷農藥(organophosphate pesticides,OPS)是目前世界范圍內廣泛使用的殺蟲劑，具有殺蟲譜廣、藥效高、價格低廉等特點，被廣泛用于家庭和農業的防蟲抗害中。在我國，根據國家質量管理總局調查資料顯示：食品中的農藥殘留現象在我國大量存在，農作物中有機磷農藥超標率為1％-35％。2010年，河南省開封市OPS農藥殘留檢出率高達14.5％，這種長期低劑量接觸有機磷農藥嚴重危害著人類健康。正因如此，OPS殘留成為我們日常生活中農藥殘留突出的安全隱患。目前研究發現，除了傳統理論認為有機磷農藥的毒性能夠抑制膽堿酯酶的活性外，有機磷農藥的使用通過直接影響神經細胞的復制和分化，直接對腦內神經系統產生嚴重的損害，通過增加活性氧的產生，使得脂質和蛋白質產生氧化應激損傷，直接損害細胞DNA而導致炎癥反應和神經細胞凋亡的發生，從而與認知功能障礙和神經退行性疾病的發生有關。因此，開發一種能夠減輕長期有機磷殘留引起的神經毒性的藥物或功能制品具有重要意義。

蝦青素(Astaxanthin,AST)又名蝦黃質、蝦紅素，是一種脂溶性酮式類胡蘿卜素，雨生紅球藻是自然界中合成和積累蝦青素最多的微生物，蝦、蟹、魚、酵母和鳥類羽毛中同樣含有蝦青素的成分，作為微藻類的植物營養素，AST是海洋生物體內主要的類胡蘿卜素之一。蝦青素具有多種神經保護功能，包括急性神經損傷及慢性神經損傷。蝦青素的神經保護作用主要通過它所具有的抗氧化、抗炎、抑制凋亡的作用來發揮。有研究表明蝦青素能夠減少海馬可塑性損傷，通過增加齒狀回(DG)區血流速，增強成年大鼠海馬神經發生及學習記憶特別是空間學習記憶能力，并對焦慮抑郁情緒有很好的改善作用，是預防認知障礙疾病有效的天然化合物。蝦青素是一種抗氧化能力比其他β-胡蘿卜素和葉黃素高出十倍的海洋來源的化合物，其可有效通過血腦屏障阻止由神經元氧化損傷引起的神經系統退行性疾病。此外，蝦青素通過抗凋亡作用減少海馬神經元丟失，這使得新生神經元的存活得到有效保護。

目前治療化學物中毒所致的認知障礙以及慢性神經損傷的藥物主要為依達拉奉和石杉堿甲等藥物，而這些藥物大多具有藥效不夠持久，副作用較大等缺點。因此，研發新型低毒高效的針對慢性有機磷中毒致認知障礙的藥物具有重要的經濟和社會效益。國內外學者已經報道了一些關于蝦青素在防治農藥有機磷致雄性生殖毒性和致胚胎毒性的藥物中的應用方面的專利(CN201410502878.5,CN201310018433.5)，此外，蝦青素還被用于制備治療抗抑郁癥藥物和制備預防和治療腦卒中藥物中的用途(CN201210548264.1，CN200810195924.6)。也有學者報道，氯化鋰在抗脂質過度積累誘導的心肌凋亡藥物中的應用(CN201510980704.4)，在甲基苯丙胺認知障礙藥物中的應用(CN201610368414.9)等精神穩定劑類治療方面的作用，但是目前還沒有關于蝦青素聯合氯化鋰在制備預防和治療慢性有機磷中毒所致認知障礙藥物的研究和應用報道。

技術實現要素：

針對現有技術中還未有針對慢性有機磷中毒致認知功能障礙的有效藥物，本發明提供了蝦青素和/或氯化鋰在制備預防和治療慢性有機磷中毒所致的認知障礙病癥的藥物中的應用。本發明提供的蝦青素聯合氯化鋰治療對慢性有機磷中毒導致的海馬損傷具有神經保護作用，且可通過激活Akt/GSK3β/CREB信號通路來改善慢性有機磷中毒導致的認知功能障礙。

為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現：

本發明提供了蝦青素和/或氯化鋰在制備預防和治療慢性有機磷中毒所致的認知障礙病癥的藥物中的應用。

進一步的：所述蝦青素和氯化鋰聯合使用優于單獨使用蝦青素或氯化鋰。

進一步的：所述認知障礙病癥包括空間認知障礙、學習和記憶功能障礙以及精神焦慮抑郁障礙。

進一步的：所述蝦青素和/或氯化鋰能夠顯著改善有機磷中毒小鼠的認知功能，有助于小鼠學習和記憶能力的恢復。

進一步的：所述蝦青素和/或氯化鋰能夠顯著抑制慢性有機磷中毒引起的小鼠海馬組織損傷，減少腦組織凋亡。

進一步的：所述蝦青素以50mg/kg/day的劑量灌胃給藥8周；

或者所述蝦青素以50mg/kg/day的劑量灌胃給藥，并聯合氯化鋰以2mmol/kg/day劑量腹腔注射給藥，連用8周。

進一步的：所述蝦青素和/或氯化鋰能上調Akt/GSK3β/CREB信號通路的活化水平，抑制神經細胞凋亡，改善認知功能障礙。

進一步的：所述蝦青素以50mg/kg/day的劑量灌胃給藥，并聯合氯化鋰以2mmol/kg/day劑量腹腔注射給藥，連用8周。

進一步的：所述的有機磷為久效磷、辛硫磷、對氧磷和三唑磷。

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：本發明選取蝦青素為研究對象，在體內水平上揭示其抑制慢性有機磷中毒導致的海馬神經元損傷，改善認知功能障礙的作用。

本發明經實驗證實蝦青素聯合氯化鋰治療具有顯著的抗氧化、抑制凋亡的作用，能夠對慢性有機磷中毒導致的海馬損傷具有神經保護作用，且可通過激活Akt/GSK3β/CREB信號通路來改善慢性有機磷中毒導致的認知功能障礙，減輕小鼠的焦慮抑郁情緒，表明該試劑具有開發成新型預防和治療慢性有機磷中毒所致的癡呆的藥物的廣闊前景。

結合附圖閱讀本發明的具體實施方式后，本發明的其他特點和優點將變得更加清楚。

附圖說明

圖1表明本發明試驗中有機磷慢性中毒小鼠腦部海馬區剛果紅染色結果(400x，C圖200x)。圖1中，A：對照組；B和C模型組；D：蝦青素組；E和F：蝦青素加氯化鋰組；G和H：依達拉奉組；I氯化鋰組。

圖2表明本發明試驗中有機磷慢性中毒小鼠腦部海馬CA1區TUNEL染色結果(400x)。圖2中，A：對照組；B：模型組；C：蝦青素組；D：依達拉奉組；E：氯化鋰組；F：蝦青素加氯化鋰組。

圖3表明本發明試驗中有機磷慢性中毒小鼠腦部海馬CA1區p-PI3K免疫組化結果(400x)。圖3中，A:對照組；B：模型組；C：蝦青素組；D：依達拉奉組；E：氯化鋰組；F：蝦青素加氯化鋰組。

圖4表明本發明試驗中有機磷慢性中毒小鼠腦部海馬CA3區p-GSK3β免疫組化結果(200x)。圖4中，A:對照組；B：模型組；C：蝦青素組；D：依達拉奉組；E：氯化鋰組；F：蝦青素加氯化鋰組。

圖5表明本發明試驗中有機磷慢性中毒小鼠腦部海馬CA3區p-CREB免疫組化結果(200x)。圖5中，A：對照組；B：模型組；C：蝦青素組；D：依達拉奉組；E：氯化鋰組；F：蝦青素加氯化鋰組。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。

本發明按照國際公認的方法，評價了蝦青素聯合氯化鋰治療對慢性有機磷中毒導致的海馬損傷的神經保護作用以及改善認知功能障礙的作用。本發明采用的蝦青素采用市面銷售的產品即可。

實施例1、蝦青素聯合氯化鋰治療對慢性有機磷中毒認知障礙小鼠行為學的影響

1)Morris水迷宮實驗評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠行為學影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束后應用Morris水迷宮對小鼠的記憶再現及空間記憶能力進行測試。共6天，取對照組小鼠5天內逃避潛伏期的均值為參考值，同時計算造模小鼠5天的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值，該值＞20％則認為模型成功，模型成功率90％。

模型制備成功后，蝦青素組：蝦青素以50mg/kg/day劑量給予灌胃，連續8周；依達拉奉組將依達拉奉每只給予3mg/kg腹腔注射，每日一次，連續8周；氯化鋰組將氯化鋰(Licl)每只給予2mmol/kg腹腔注射，隔日一次，連續8周。蝦青素加抑制劑組將蝦青素以50mg/kg/day劑量給予灌胃，后將氯化鋰(Licl)每只給予2mmol/kg腹腔注射，隔日一次，連續8周。

定位航行實驗結果如表1所示，5天的測試中，模型組小鼠找到水下隱蔽平臺所用時間均顯著高于對照組(P＜0.05)，這表明模型組小鼠存在學習記憶能力的損害；蝦青素組小鼠逃避潛伏期所用時間較模型組有明顯的縮短(P＜0.05)；依達拉奉組小鼠逃避潛伏期也隨時間的改變逐漸縮短，但與模型組比較無統計學差異(P＞0.05)；氯化鋰組小鼠逃避潛伏期較模型組小鼠也明顯縮短(P＜0.05)；蝦青素加氯化鋰組逃避潛伏期較模型組有較為顯著地縮短(P＜0.05)，該小組所需時間均短于其余治療組的小鼠(P＜0.05)。

表1本發明中各組小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期的比較結果(x±s，n＝8)

與對照組比較：^#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

空間探索實驗結果如表2所示，經過5天的定位航行訓練結束后將水池中的平臺取出，開始對各組小鼠進行空間探索實驗測試，記錄各組小鼠在目標象限(原平臺所在象限)停留的時間比，以及穿越平臺的次數。在目標象限停留的時間越長以及穿越平臺的次數越多，表明該小鼠空間學習記憶能力越好，反之則越差。與對照組比較，模型組小鼠目標象限停留的時間比大為縮短，穿越平臺的次數顯著減少，這提示慢性有機磷致認知障礙小鼠的空間記憶能力出現較為嚴重的損傷(P＜0.05)；與模型組相比，蝦青素治療組、依達拉奉組、氯化鋰組及蝦青素加氯化鋰組小鼠目標象限停留時間均有所增加，穿越平臺次數亦增多明顯，特別是蝦青素加氯化鋰組小鼠測試結果較模型組小鼠變化最為顯著(P＜0.05)，這表明蝦青素聯合氯化鋰抑制劑對改善由慢性有機磷中毒致認知障礙小鼠的空間學習記憶能力效果顯著。

表2本發明中各組小鼠目標象限停留時間比和穿越平臺次數的結果(x±s)

與對照組比較：^#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05.

2)高架十字迷宮實驗評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠行為學影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，應用高架十字迷宮實驗評價藥物對染毒小鼠行為學影響。將小鼠置于迷宮中央(開臂與閉臂結合處)，小鼠頭朝開臂，實驗者距離迷宮中心至少1cm。打開錄像系統，分別記錄實驗期(5min)內小鼠進入開臂和閉臂的次數和在兩臂滯留的時間，以開臂停留時間的百分比和進入開閉次數百分比反應動物的焦慮狀態。

高架十字迷宮測試結果如表3所示，模型組小鼠在開臂處停留時間的百分比、進入開臂次數百分比要顯著低于對照組(均p＜0.05)，且模型組小鼠在測試過程中出現次數較多的刻板樣重復性的焦慮動作(例如搓爪，撓頭等)，提示模型建立成功；蝦青素治療組小鼠處于開臂時間百分比、進入開臂次數百分比較模型組有明顯的增長(P＜0.05)；依達拉奉組小鼠處于開臂時間百分比較模型組無統計學差異(P＞0.05)，進入開臂次數百分比較模型組明顯縮短(P＜0.05)，但效果沒有蝦青素組明顯(P＜0.05)；氯化鋰組小鼠處于開臂時間百分比、處于開臂次數百分比較模型組有明顯的增長(P＜0.05)；蝦青素加氯化鋰組小鼠處于開臂時間百分比、進入開臂次數百分比較模型組有非常顯著性的增加(P＜0.01)，并高于其他治療組小鼠。

表3本發明中各組小鼠開臂處停留時間的百分比和進入開臂次數百分比的比較結果(x±s)

與對照組比較：^#p＜0.05；與模型組比較：^*p＜0.05^**p＜0.01.

3)明暗箱實驗評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠行為學影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，應用明暗箱實驗評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠行為學影響。

明暗箱實驗測試結果如表4所示，模型組小鼠在明箱區域停留時間的百分比、穿箱的頻率均非常顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.05)，且模型組小鼠在測試過程中出現次數較多的刻板樣重復性的焦慮動作(例如搓爪，撓頭等)；與模型組相比，蝦青素治療組、氯化鋰組小鼠在明箱區域停留時間的百分比、穿箱的頻率均存在明顯的增長(P＜0.05，P＜0.05)，氯化鋰治療組優于蝦青素組；依達拉奉組小鼠在明箱區域停留時間的百分比較模型組小鼠無統計學意義(P＞0.05)；蝦青素加氯化鋰組小鼠在明箱區域停留時間的百分比、穿箱的頻率較模型組有非常顯著性的增加(P＜0.01，P＜0.01)，并高于其他治療組小鼠。

表4本發明中各組小鼠明箱區域停留時間的百分比和穿箱頻率的比較結果(x±s)

與對照組比較：#p＜0.05；與模型組比較：^*p＜0.05^**p＜0.01.

綜上，Morris水迷宮實驗、高架十字迷宮實驗和明暗箱實驗的結果表明，蝦青素聯合氯化鋰治療能夠顯著改善有機磷中毒小鼠的認知功能，有助于小鼠學習和記憶能力的恢復。

實施例2、蝦青素聯合氯化鋰治療對慢性有機磷中毒認知障礙小鼠海馬組織形態學的影響

1)剛果紅染色評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠海馬損傷的影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，打開頭顱取海馬組織進行石蠟切片制作，并應用剛果紅染色評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠海馬損傷的影響。

剛果紅染色結果如圖1所示，對照組小鼠海馬切片未見橘紅色淀粉樣沉積，海馬齒狀回背側細胞帶排列整齊；模型組小鼠海馬組織內及鄰近區域血管內皮可見橘紅色淀粉樣沉積，齒狀回區出現較為明顯的條帶狀橘紅色沉淀，而海馬組織錐體細胞并未見淀粉樣沉積，這提示低劑量接觸有機磷農藥所導致的淀粉樣沉積損傷較輕，還未出現較大面積斑塊樣沉淀；蝦青素組、蝦青素加氯化鋰組小鼠海馬組織內血管內皮橘紅色淀粉樣沉積明顯減輕，分析是由于蝦青素可增加腦血流量，這使得血管內皮的淀粉樣沉積減輕；依達拉奉組與氯化鋰組并未見明顯的改善作用。

2)TUNEL法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠腦組織凋亡的影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，打開頭顱取海馬組織進行石蠟切片制作，并應用TUNEL法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠腦組織凋亡的影響。

TUNEL染色結果如圖2所示，對照組小鼠腦組織海馬CA1區凋亡細胞少或無，與對照組比較，模型組、蝦青素組、依達拉奉組、氯化鋰組、蝦青素加氯化鋰組可見不同程度的凋亡細胞(P＜0.05)；與模型組比較，蝦青素組、依達拉奉組、蝦青素加氯化鋰組小鼠海馬組織凋亡細胞比較有統計學意義(P＜0.05)，氯化鋰組相比差異無統計學意義(P＞0.05)；蝦青素組與依達拉奉組比較存在統計學意義(P＜0.05)；蝦青素組與蝦青素加氯化鋰組比較無統計學差異(P＞0.05)，這表明，蝦青素與依達拉奉均可減少慢性有機磷中毒致認知障礙小鼠海馬區的細胞凋亡，蝦青素治療效果優于依達拉奉治療組，氯化鋰對慢性有機磷中毒致認知障礙小鼠海馬區神經細胞凋亡的改善不明顯。

總之，剛果紅染色和TUNEL染色法結果表明蝦青素聯合氯化鋰治療能夠顯著抑制慢性有機磷中毒引起的小鼠海馬組織損傷，減少腦組織凋亡。

實施例3、蝦青素聯合氯化鋰治療對慢性有機磷中毒認知障礙小鼠Akt/GSK3β/CREB信號通路活化水平的影響

1)免疫組化染色法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠Akt/GSK3β/CREB信號通路活化水平的影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，打開頭顱取海馬組織進行石蠟切片制作，并應用免疫組化染色法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠Akt/GSK3β/CREB信號通路活化水平的影響。

免疫組化染色結果如圖3-圖5所示，圖3的p-PI3K免疫組織化學的結果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬CA1區神經元邊界不清且陽性細胞著色淺，平均光密度值比較差異有統計學意義(p＜0.05)；與模型組相比，蝦青素組、氯化鋰組、蝦青素加氯化鋰組p-PI3K的表達均升高(P＜0.05)，依達拉奉組與模型組比較也有升高，但差別無統計學意義(P＞0.05)。

圖4的p-GSK3β免疫組織化學結果表明，與對照組比較，模型組腦組織海馬內p-GSK3β陽性染色較淡，胞體較小，陽性細胞顯著減少，平均光密度值比較差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，蝦青素組、氯化鋰組、蝦青素加氯化鋰組p-GSK3β的表達均升高(P＜0.05)，依達拉奉組與模型組比較也有升高，但差別無統計學意義(P＞0.05)。

圖5的p-CREB免疫組織化學結果表明，與對照組比較，模型組小鼠陽性細胞顯著減少，p-CREB表達受到顯著抑制(P＜0.05)；與模型組相比，蝦青素組、依達拉奉組、氯化鋰組、蝦青素加氯化鋰組p-CREB的表達均升高(P＜0.05)。

表5各組小鼠海馬組織內p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β及p-CREB相對于β-actin的表達量

與對照組比較：^#p＜0.05；與模型組比較：^*p＜0.05.

2)Western blot法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠Akt/GSK3β/CREB信號通路活化水平的影響

小鼠采用皮下注射染毒方法建立慢性有機磷中毒動物模型。染毒結束并應用各種藥物處理8周之后，取海馬組織勻漿后取上清液，利用Western blot法評價蝦青素聯合氯化鋰治療對染毒小鼠Akt/GSK3β/CREB信號通路活化水平的影響。Western blot結果表明，與對照組相比，模型組小鼠p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β、p-CREB表達水平顯著降低，灰度值分析差異具有統計學意義(均P＜0.05)；與模型組相比，蝦青素組、氯化鋰組和蝦青素加氯化鋰組小鼠海馬組織內p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β、p-CREB的表達水平顯著提高，灰度值分析差異具有統計學意義(P＜0.05)，且蝦青素組與蝦青素加氯化鋰組p-PI3K、p-Akt、p-CREB的表達水平高于氯化鋰組小鼠(P＜0.05)；依達拉奉組的表達水平與模型組灰度值比較無統計學差異(P＞0.05)。

總之，免疫組化和western blot的結果提示蝦青素聯合氯化鋰治療可以上調Akt/GSK3β/CREB信號通路的活化水平，從而抑制神經細胞凋亡，改善認知功能障礙。

綜上所述，本實驗結果證實蝦青素聯合氯化鋰治療具有顯著的抗氧化、抑制凋亡的作用，能夠對慢性有機磷中毒導致的海馬損傷具有保護作用，且可通過激活Akt/GSK3β/CREB信號通路來改善認知功能障礙，減輕小鼠的焦慮抑郁情緒，顯示蝦青素聯合氯化鋰治療具有較好的抗慢性有機磷中毒致認知障礙活性。

本發明的蝦青素來源于海洋蝦蟹外殼或藻類，具有資源豐富、成本低廉和安全性高等諸多優點，并且在體內水平上證明其具有較好的抗慢性有機磷中毒致認知障礙的活性，為該類藥物的開發提供了新的途徑。

以上實施例僅用于說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。