一株蝦青素產生菌及其應用的制作方法

本發明涉及微生物及其應用領域，具體的說，本發明涉及一種能產蝦青素的副球菌及其應用的技術領域。

背景技術：

蝦青素 (astaxanthin) 是自然界中抗氧化性最強的一種含酮基類胡蘿卜素，其能有效清除細胞內的氧自由基，增強細胞再生能力，維持機體平衡和減少衰老細胞的堆積，從而保護皮膚健康，促進毛發生長，緩解運動疲勞，增強人體活力。同時還具有提高免疫力，抗腫瘤，預防心腦血管疾病，延緩衰老等保健功效。作為著色劑，將蝦青素添加到果醬、飲料、腌制品及含脂質較多的水產品、肉制品等食品中，不僅能改善產品色澤，增強食用性，還能起到保鮮和防腐的作用。

蝦青素的來源途徑主要有化學合成和生物提取兩種。化學方法合成的蝦青素不僅價格昂貴，而且由于產生的蝦青素以游離態存在，導致其穩定性和抗氧化活性都比天然蝦青素低，且生物對其吸收效果也較差，并且在體內無法轉化為天然構型，使得其著色能力和生物效價更比同濃度的天然蝦青素低的多。同時利用化學手段合成蝦青素的過程中，產生的非天然副產物將降低其生物利用安全性。因此，開發生物來源的天然蝦青素，成為當今研究的熱點。

現有資料表明，只有單細胞藻類、酵母菌和一些特殊類群的細菌才能產生蝦青素。目前蝦青素的主要生物來源是紅發夫酵母 (Phaffia rhodozyma)和雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis)，但以此生產蝦青素存在培養周期長、培養條件復雜、提取分離難度大、產量低等缺陷，且生產工藝達不到工業生產要求。

針對上述問題，我們可以從以下幾個方面去努力：(1)對已知的蝦青素產生菌進行誘變篩選和發酵優化，建立高效產生菌的種子庫，以期達到工業生產要求。(2)在識別微生物產蝦青素的功能基因的基礎上，對功能基因進行克隆與表達，構建工程菌、提高天然蝦青素的產率。(3)開發和利用新型蝦青素產生菌，并對該類特殊類群微生物的產生機理、代謝途徑進行研究。

技術實現要素：

針對國內外有關生物來源的天然蝦青素研究現狀，本發明提供一種新的蝦青素產生菌。所述的產蝦青素菌可利用dextrin、glycerol、L-arabinose、maltose、D-alanine、succinic acid，同時與該屬其他菌株的16S rRNA基因序列的最高相似性94.44%至97.18% (EzTaxon)，這些特征明顯區別于已公開報道的其他有效菌種。

本發明提供一株副球菌Paracoccus sp. SCU-M53。

本發明通過以不同的溫度、pH值、鹽濃度和培養基為富集條件，從中華劍角蝗蟲組織材料中取樣，分離純化得到多株菌，經過多級篩選確定了一株蝦青素產生菌 Paracoccus sp. SCU-M53。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：韓國典型菌種保藏中心（KCTC），保藏時間為2015年11月30日，保藏號是KCTC 42932，KCTC地址為韓國大田市儒城區韓國生物科學和生物技術研究所，郵編是305-806。該菌為好氧菌，革蘭氏陰性，細胞大小為0.4-0.6μm×0.7-1.7μm，菌落顏色為橙紅色。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，能產生吲哚。細胞主要脂肪酸為C_18:1ω7c，summed feature 7 (C_18:1ω7c/ω9t/ω12t)和C_16:0，主要呼吸醌為Q10，主要極性脂為磷脂酰乙醇胺(PE)，可利用碳源淀粉、糊精、α-D-葡萄糖、吐溫40、吐溫80、D-果糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、β-羥基丁酸、α-酮戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、溴代琥珀酸、琥珀酰胺酸、D-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘油，不能利用碳源D-阿拉伯糖、D-纖維二糖、D-半乳糖、龍膽二糖、D-乳糖、乳果糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰基-D-半乳糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、側金盞花醇、赤藻糖醇、m-肌醇、D-甘露醇、阿洛酮糖、D-山梨醇、木糖醇、丙烯三羧酸、檸檬酸、甲酸、D-乳糖酸內酯、D-葡萄糖胺酸、D-葡萄糖酸、α-羥基丁酸、γ-羥基丁酸、p-羥基苯乙酸、衣康酸、α-酮丁酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、癸二酸、溴丁二酸、葡糖醛酰胺、甘氨酰-L-天門冬氨酸、L-組氨酸、羥基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、D-絲氨酸、D,L-肉堿、γ-氨基丁酸、尿苷酸、肌苷、胸腺嘧啶核苷、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇、丙三醇、D,L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。

對該菌株Paracoccus sp. SCU-M53的形態觀察、生理生化及培養特性和化學分類均按照《常見細菌系統鑒定手冊》進行。其中碳源利用情況采用Biolog全自動細菌鑒定系統，呼吸醌組分和細胞內G+C含量采用高效液相色譜法來測定，使用2.5%戊二醛固定細胞后，在掃描電鏡下觀察該菌的形貌 (圖1)，參考菌株為Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T，用于和測試菌株SCU-M53比較。

本發明通過提取總DNA、16S rRNA基因序列的擴增和測序，根據測序結果，在NCBI上用Blast進行比對分析并構建系統發育樹，進一步對該菌的分類地位進行判斷。

采用Sanger法對Paracoccus sp. SCU-M53的16S rRNA基因測序結果如下 (該序列已在NCBI登記，登錄號為KT634253)，全長共1441bp：

CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACCTTTCGGGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTCTCTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATACGCCCTTTGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTACTGGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGCCCGAGAGATCGGGTTTCCACTTCGGTGGCCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCCCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGTGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCCTTACGGGAGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

基于16S rRNA基因構建的系統發育樹可以看出Paracoccus sp. SCU-M53為一個單獨分支，該菌Paracoccus sp. SCU-M53與相鄰分支上親緣性最近的兩株菌Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T的16S rRNA基因序列相似度分別為96.70%和97.04%，結合表型、生理生化和基因型比較數據，表明菌Paracoccus sp. SCU-M53為副球菌屬的一個新種。

通過實施本發明的具體技術指標，可達到以下預期效果。

本發明的Paracoccus sp. SCU-M53為好氧菌，革蘭氏陰性，菌落呈橙紅色。氧化酶和過氧化氫酶陽性。最適pH生長范圍為5至9，最適生長鹽濃度為0%至1%。該菌具有堿性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，可廣泛地應用于各類生物工程酶制劑的生產領域。

附圖說明：圖1是菌株Paracoccus sp. SCU-M53掃描電子顯微鏡50000倍下照片。

下面舉實施例說明本發明，但是本發明并不限于下述實施例。

具體實施方法

實施例一：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的篩選和分離

實驗用蝗蟲樣品為中華劍角蝗 (acrida cinerea) 的成蟲，多分布于農田和菜園，于2014年5月分批次捕捉自四川省成都市大邑縣安仁鎮菜園 (北緯30°52’, 東經103°62’, 海拔495米)。用無菌水將微生物從蝗蟲體表洗脫后，采用稀釋平板法涂布至TSB、LB、高氏一號、PDA、牛肉膏蛋白胨和ISP-3培養基上培養，37^oC下培養至可見菌落出現，純化菌落后進行鑒定。

菌種描述：

好氧菌，革蘭氏陰性，菌落呈橙紅色。氧化酶和過氧化氫酶陽性。最適pH生長范圍為5至9，最適生長鹽濃度為0至1%。該菌具有堿性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，細胞主要脂肪酸為C_18:1ω7c, summed feature 7 (C_18:1ω7c/ω9t/ω12t)和C_16:0，主要呼吸醌為Q10，主要極性脂為磷脂酰乙醇胺(PE)，細胞內G+C含量為60.57%。

實施例二：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的多相分類鑒定

對該菌株Paracoccus sp. SCU-M53的碳源利用情況采用Biolog全自動細菌鑒定系統，脂肪酸成分測定采用GC-MS分析，酶學特性采用API ZYM試劑條鑒定，參考菌株為Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T。結果如下：

可利用碳源：糊精、α-D-葡萄糖、吐溫40、吐溫80、D-果糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、β-羥基丁酸、α-酮戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、溴代琥珀酸、琥珀酰胺酸、D-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘油。

具有的酶活性：堿性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶。

實施例三：16S rRNA基因測序及進化樹構建

采用SDS法提取細菌總DNA，通過PCR法擴增菌株16S rRNA基因序列，DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。到GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 數據庫將各菌株測得的16S rRNA基因部分序列提交注冊獲得序列號。再在NCBI (National Center for Biotechnology Information) 上進行BLAST比對，找到親緣關系最近的菌株。通過BioEdit將親緣性最近的相應菌株進行序列比對，然后在軟件MEGA 5.2上使用Neighbor-Joinin (N-J)法構建系統進化樹。PCR相應引物、反應體系、條件如下：引物27F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，反應體系 (25μL體系)：Mg²⁺ 2.5μL，27F 2.5μL，1492R 2.5μL，dNTP 0.75μL，H₂O 14μL，Taq酶0.25μL，反應條件95^oC預變性5min，94^oC變性45s，50^oC退火45s，72^oC延伸1min，重復35個循環，72^oC保溫10min。

實施例四：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的應用

將菌種接至TSB培養基中，30^oC培養24-48小時后于培養液中加入2-3mL歐立希氏試劑，若變紅色，則為陽性反應，表明有吲哚產生。若不變色或變色不明顯，可滴加4-5滴乙醚，仍不呈紅色，則為陰性反應。因測試菌株SCU-M53^T的反應結果為紅色，證明其有產生吲哚的能力。

實施例五：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53產蝦青素實驗

將菌種接至TSB培養基中，30^oC培養48小時后離心，收集的干細胞采用DMSO進行破壁，然后以丙酮-甲醇 (7:2, v/v) 混合溶劑進行萃取，得到的萃取上清液即可進行HPLC檢測。同樣，將蝦青素標準品溶于丙酮-甲醇 (7:2, v/v) 混合溶劑中，以甲醇-水 (95:5, v/v) 作為流動相，色譜柱為Diamonsil C₁₈柱(250mm×4.6mm, 5um)，檢測波長為470nm，通過外標法確定蝦青素的出峰時間。通過在同一保留時間出現了色譜峰，證明SCU-M53^T具有在胞內產蝦青素的能力。

CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACCTTTCGGGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTCTCTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATACGCCCTTTGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTACTGGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGCCCGAGAGATCGGGTTTCCACTTCGGTGGCCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCCCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGTGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCCTTACGGGAGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA