本發明屬于生物醫用植入物領域，具體涉及一種具有高含量BMP/RGD涂層的種植體活性表面的構建方法。
背景技術：
鈦金屬具有良好的生物相容性、力學性能和機械加工潛力等優點，目前作為牙種植材料在口腔科廣泛應用。然而，鈦本身具有生物惰性，被植入機體后，引發愈合時間長、生物活性低，誘導骨修復能力差等問題。為了提高其生物活性，目前大多采用等離子噴涂、離子濺射、電泳、微波燒結等技術改造種植體表面的微觀物理形貌和化學成分，形成具有較好生物相容性的粗糙多孔表面，并提高了種植體育骨組織的結合強度，但此類種植體與骨組織之間仍然是物理性結合，但無骨誘導性能，與周圍組織的生物相容性低，臨床上口腔種植治療的周期相當長，給患者的生活帶來諸多不便。近年來，在改造種植體表面的微觀物理形貌的基礎上，在其表面制備或涂覆生物活性分子涂層或薄膜，達到促進成骨細胞的增殖和分化來促使新骨的形成，縮短了治療周期。
骨形態發生蛋白(BMP)為高效骨誘導因子，可在骨修復早期通過誘導未分化間充質細胞和骨髓基質細胞不可逆分化為軟骨細胞和成骨細胞而誘導新骨形成。目前，將BMP作為生物活性分子引入種植體表面的研究很多，一般通過物理吸附、化學結合或者與生物相容性佳的高分子載體材料混溶后物理固定等方法固定于種植體表面，但普遍存在BMP的吸附量少，在生理條件下短時間內被快速釋放或吸收降解，因此無法在局部發揮持續剌激和誘導成骨的作用，其生物活性難以得到充分發揮。還存在與載體或種植體基體的結合強度低，應用中存在長期穩定效果差、容易脫落等問題。
技術實現要素：
鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種具有高含量BMP/RGD涂層的種植體活性表面的構建方法.
本發明的技術方案如下：
一種具有高含量BMP/RGD涂層的種植體活性表面的構建方法，包括以下步驟：
(1)將鈦金屬種植體表面用200、300、600和2000目砂紙逐級打磨，清洗，在60℃烘干；
(2)用75μm TiO2顆粒，通過噴嘴對種植體表面進行噴砂處理；
(3)將噴砂處理后的種植體置于氫氟酸與鹽酸組成的混合酸蝕劑中進行表面刻蝕處理，取出種植體超聲清洗，室溫自然干燥；
(4)表面刻蝕處理、干燥后的種植體置于60℃、5mol/L NaOH溶液孵育24-48h，用水超聲清洗后，干燥后600℃下處理1-2h；
(5)干燥處理后的種植體浸入帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液中，室溫放置10-30min，用蒸餾水清洗；
(6)蒸餾水清洗后的種植體浸入帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液中，室溫放置10-30min，用蒸餾水清洗；
(7)重復步驟(5)-(6)即可得到帶有不同層數涂層的種植體活性表面。
進一步地，在上述技術方案中，所述的帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將Ⅰ型膠原蛋白溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至4.0，加入NaCl溶解，再加入BMP，攪拌溶解，得復合涂層溶液，其中在所述復合涂層溶液中，Ⅰ型膠原蛋白濃度為1-2mg/mL，NaCl濃度為0.1-0.2M，BMP濃度為1-5mg/mL。在該復合涂層溶液中Ⅰ型膠原蛋白和BMP均帶正電荷。
進一步地，在上述技術方案中，所述的帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將HA-RGD復合材料溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至2.9，加入NaCl溶解，得HA/RGD復合涂層溶液，其中HA-RGD復合材料濃度為1-2mg/mL，NaCl的終濃度為0.1-0.2M。
進一步地，在上述技術方案中，所述的HA-RGD復合材料按照如下方法制備得到：HA和RGD分散在去離子水中形成分散液，加入EDC和NHS的混合溶液，攪拌1-4h后，透析、冷凍干燥得HA-RGD復合材料。HA-RGD復合材料可以根據本領域常規方法制備得到，即利用活化劑EDC、NHS介導的羧胺反應，使HA和RGD之間形成酰胺鍵，從而將RGD引入到HA上。
進一步地，在上述技術方案中，在步驟(2)中，所述的噴砂處理條件為：壓縮空氣壓力為0.3-0.4MPa，噴嘴離種植體表面的具體為5-10cm，噴射時間為2-10s。
進一步地，在上述技術方案中，在步驟(3)中，所述的混合酸蝕劑為47％的HF與38％的HCl按照體積比為1:1的混合液。
進一步地，在上述技術方案中，在步驟(3)中，所述的表面刻蝕處理溫度為60℃，刻蝕處理時間為10-20min。
本發明中，所述RGD是Arg-Gly-Asp的短肽序列，由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成；所述EDC·HCl為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，英文名稱：1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride；所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，英文名稱:N-Hydroxysuccinimide。
本發明的有益效果：
1.本發明通過噴砂、酸蝕和堿熱處理工藝的相結合的表面處理方法，提高材料表面的粗糙度和表面能，增強材料表面的活性，種植體與骨組織的骨整合性能。
2.通過表面處理，種植體基底表面覆蓋了大量的鈦羥基，通過氫鍵的作用能夠結合聚陽離子電解質，本發明先引入帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP-2復合涂層，然后再引入帶帶負電荷的HA/RGD涂層，通過重復交替引入的方法，大幅提高了涂層中BMP和RGD的載荷量，且涂層主要依靠陽離子與陰離子相互之間的靜電引力，在種植體固體表面形成有序排列的分子涂層，BMP和RGD在涂層中的穩定性高，種植體植入后隨著各涂層的降解緩慢持續釋放，促進了細胞的附著、增殖和分化，促進成骨，促進種植體與周圍骨組織的早期骨愈合。
3.BMP-2在酸性條件下比較穩定，溶入PH值為4.0的Ⅰ型膠原蛋白電解質溶液中不會使BMP-2的活性喪失。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用試劑等均可從化學公司購買。
下述實施例使用的HA-RGD復合材料按照如下方法制備得到：將HA和RGD分散在去離子水中形成分散液，其中HA羧基和RGD的質量比為10:1；加入EDC和NHS至溶液中的濃度分別為5mg/mL和2mg/mL，攪拌2h后，透析、冷凍干燥得HA-RGD復合材料。
實施例1
具有高含量BMP/RGD涂層的種植體活性表面，按照如下方法制備得到：
(1)將鈦金屬種植體表面用200、300、600和2000目砂紙逐級打磨，清洗，在60℃烘干；
(2)用75μmTiO2顆粒，通過噴嘴對種植體表面進行噴砂處理，所述的噴砂處理條件為：壓縮空氣壓力為0.3-0.4MPa，噴嘴離種植體表面的距離為5cm，噴射時間為2s；
(3)將噴砂處理后的種植體置于氫氟酸與鹽酸組成的混合酸蝕劑中進行表面刻蝕處理，刻蝕處理溫度為60℃，刻蝕處理時間為10min，取出種植體超聲清洗，室溫自然干燥；其中混合酸蝕劑為47％的HF與38％的HCl按體積比1:1的混合物；
(4)將進行表面刻蝕處理、干燥后的種植體置于60℃、5mol/L NaOH溶液孵育24h，用水超聲清洗后，干燥后600℃下處理1h；
(5)將干燥處理后的種植體浸入帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液中，室溫放置10min，用蒸餾水清洗；
(6)在步驟(5)中蒸餾水清洗后的種植體浸入帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液中，室溫放置10min，用蒸餾水清洗；
(7)重復步驟(5)-(6)10次，得到帶有10層Ⅰ型膠原蛋白/BMP-HA涂層的種植體活性表面。
所述的帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將Ⅰ型膠原蛋白溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至4.0，加入NaCl溶解，再加入BMP，攪拌溶解，得復合涂層溶液，其中在所述復合涂層溶液中Ⅰ型膠原蛋白濃度為1mg/mL，NaCl濃度為0.15M，BMP濃度為1mg/mL。
所述的帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將HA-RGD復合材料溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至2.9，加入NaCl溶解，得HA/RGD復合涂層溶液，其中HA-RGD復合材料濃度為1mg/mL，NaCl的終濃度為0.15M。
實施例2
具有高含量BMP/RGD涂層的種植體活性表面，按照如下方法制備得到：
(1)將鈦金屬種植體表面用200、300、600和2000目砂紙逐級打磨，清洗，在60℃烘干；
(2)用75μmTiO2顆粒，通過噴嘴對種植體表面進行噴砂處理，所述的噴砂處理條件為：壓縮空氣壓力為0.3-0.4MPa，噴嘴離種植體表面的距離為8cm，噴射時間為10s；
(3)將噴砂處理后的種植體置于氫氟酸與鹽酸組成的混合酸蝕劑中進行表面刻蝕處理，刻蝕處理溫度為60℃，刻蝕處理時間為10min，取出種植體超聲清洗，室溫自然干燥；其中混合酸蝕劑為47％的HF與38％的HCl按體積比1:1的混合物；
(4)將進行表面刻蝕處理后的種植體置于60℃、5mol/L NaOH溶液孵育48h，用水超聲清洗后，干燥后600℃下處理1.5h；
(5)將干燥處理后的種植體浸入帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液中，室溫放置30min，用蒸餾水清洗；
(6)在步驟(5)中蒸餾水清洗后的種植體浸入帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液中，室溫放置30min，用蒸餾水清洗；
(7)重復步驟(5)-(6)5次，得到帶有5層Ⅰ型膠原蛋白/BMP-HA涂層的種植體活性表面。
所述的帶正電荷的Ⅰ型膠原蛋白/BMP復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將Ⅰ型膠原蛋白溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至4.0，加入NaCl溶解，再加入BMP，攪拌溶解，得復合涂層溶液，其中在所述復合涂層溶液中Ⅰ型膠原蛋白濃度為2mg/mL，NaCl濃度為0.15M，BMP濃度為5mg/mL。
所述的帶負電荷的HA/RGD復合涂層溶液按照如下方法制備得到：將HA-RGD復合材料溶解于去離子水中，用HCl調整pH值至2.9，加入NaCl溶解，得HA/RGD復合涂層溶液，其中HA-RGD復合材料濃度為2mg/mL，NaCl的終濃度為0.5M。