絲蛋白納米粒及其應用的制作方法
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種載雷公藤甲素(tpl)或雷公藤紅素(cl)的絲蛋白納米粒及其應用。
背景技術：
胰腺癌(pc)是最具侵襲性的人類惡性腫瘤之一，其5年存活率僅為8％，其在所有被診斷的癌癥中具有2％的發病率，相對較低，但是占全世界癌癥死亡的6％。pc的化療具有很強的毒副作用，并且pc具有潛在的耐藥性，這兩個原因在許多情況下都會導致患者的不幸死亡。目前胰腺癌的標準化療藥是吉西他濱，然而其療效遠遠不能令人滿意，其中一個原因是由于復雜的腫瘤微環境，這種微環境會使到達目標癌細胞的有效藥物遞送減少。迄今為止，沒有藥物可以促使顯著延長臨床總生存期。因此，仍然需要提出對胰腺癌的新治療策略，并且迫切需要開發一些治療藥物以改善對該疾病的治療。
雷公藤甲素(tpl，結構式如下述a所示)和雷公藤紅素(cl，結構式如下述b所示)這兩種主要生物活性化合物來源于中國傳統的中草藥雷公藤，由于其獨特的二萜三環氧化物結構和廣泛的生物活性，特別是抗癌活性，吸引了人們廣泛的注意。tpl已被證明是多種類型癌癥(包括胰腺癌，乳腺癌，黑色素瘤和肺癌)的細胞周期停滯和細胞凋亡的有效誘導劑。它可以有效地減少體外胰腺癌細胞的存活率，減少體內腫瘤的生長和轉移。但是，由于其水溶性差以及嚴重的毒性，還不能將tpl和cl系統地應用于臨床。因此，迫切需要開發一種tpl和cl有效制劑以用于臨床。
有效的藥物遞送系統的設計與合成對于醫療保健至關重要。基于納米載體的藥物遞送系統(ddsc)，特別是納米顆粒，具有一些優于使用純藥的特點，如增強藥物在腫瘤靶向部位積聚的能力，克服細胞內藥物遞送以及實現控制和持續釋放以增強藥物生物利用度，使它們在藥物遞送領域產生巨大的作用。絲素蛋白(sf)是從蠶繭中再生的天然產物，被證明具有幾個獨特的性質，如生物相容性，可調節生物降解，穩定作用等，這使其成為能夠遞送一系列治療藥物的潛在藥物遞送載體材料之一。
技術實現要素：
本發明要解決雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)難溶于水、生物利用度低的技術問題，提供一種載雷公藤甲素(tpl)或雷公藤紅素(cl)的絲蛋白納米粒，該納米粒不僅克服了藥物的疏水性缺陷，而且能更有效地對抗胰腺癌細胞增殖，是游離tpl和cl藥物的2-3倍。
此外，還需要提供一種抗胰腺癌的藥物組合物，包括分別載雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)的絲蛋白納米粒(tpl-sfnps和cl-sfnps)，與單獨的tpl-sfnp或cl-sfnp相比，本發明同時含有tpl-sfnp和cl-sfnp的藥物組合物顯著增加了對人胰腺癌細胞的生長抑制，表現出了顯著的協同抗癌作用。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:
在本發明的一個方面，提供了一種絲蛋白納米粒，包含絲素蛋白和活性藥物，所述絲素蛋白負載活性藥物，該活性藥物選自雷公藤甲素或雷公藤紅素。
本發明中的絲素蛋白是一種從蠶繭中提取的天然生物大分子，被用作載體以實現雷公藤甲素和雷公藤紅素的靶向藥物遞送。本發明的實驗證明由絲素蛋白制成的空白絲蛋白納米粒對細胞無毒性，具有較高的安全性和良好的生物相容性。
本發明絲蛋白納米粒的粒徑為150～190nm；包封率為79％～89％；載藥量為52～68μg/mg。
在本發明的另一方面，提供了一種絲蛋白納米粒的制備方法，包括以下步驟：
配制絲素蛋白溶液，在攪拌條件下向該絲素蛋白溶液中逐滴加入溶解在乙醇和丙酮二元混合溶劑中的雷公藤甲素或雷公藤紅素溶液，所得懸浮液經冷凍、解凍、離心，得載雷公藤甲素或雷公藤紅素的絲蛋白納米粒。
所述二元混合溶劑與絲素蛋白溶液的體積比為1:10～50，所述絲素蛋白溶液的濃度為0.5～2.0mg/ml，所述雷公藤甲素或雷公藤紅素溶液的濃度為1.0～5.0mg/ml。
本發明的上述制備方法是采用改良的去溶劑化法制備得到具有理想粒徑的絲蛋白納米粒，選用二元溶劑丙酮和乙醇的混合物，該溶劑混合物能促進絲素蛋白的脫水，從而使絲素蛋白聚合物輕度折疊以產生小于200nm的納米粒。
在本發明的另一方面，還提供了一種上述絲蛋白納米粒在制備治療癌癥的藥物中的應用。
優選的，所述癌癥包括胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、或肺癌。
本發明的絲蛋白納米粒經實驗證明比游離藥物具有更顯著的抑制癌細胞增殖的作用，因此用于治療癌癥將更加有效。
在本發明的另一方面，還提供了一種包含上述絲蛋白納米粒的抗胰腺癌的藥物制劑。
在本發明的另一方面，還提供了一種抗胰腺癌的藥物組合物，包含載雷公藤甲素的絲蛋白納米粒(tpl-sfnp)和載雷公藤紅素的絲蛋白納米粒(cl-sfnp)。
與游離的雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)兩個組合藥物相比，本發明的絲蛋白納米粒tpl-sfnp和cl-sfnp，在兩種胰腺癌細胞系中都顯示出更有效的協同增效作用。
本發明載雷公藤甲素(tpl)或雷公藤紅素(cl)的絲蛋白納米粒，不僅改善了藥物雷公藤甲素和雷公藤紅素的水溶性，而且由于較強的滲透和保留(epr)效應，進一步促進了tpl和cl被動地在癌組織中積聚，加強了對胰腺癌細胞生長的抑制。載雷公藤甲素絲蛋白納米粒(tpl-sfnps)和載雷公藤紅素絲蛋白納米粒(cl-sfnps)的聯合用藥，能顯著抑制胰腺癌細胞增殖，該抑制作用是協同而不是單純的疊加，因此，tpl-sfnps和cl-sfnps共同治療癌癥尤其是胰腺癌，具有非常好的應用前景。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
圖1是本發明實施例1通過sds-page法測定用cacl2·ch3ch2oh·h2o三元溶劑系統提取的sf的分子量范圍的結果圖；
圖2是本發明實施例2的sf和sfnps的表征圖；
圖3是本發明實施例2的blank-sfnps，tpl，tpl-sfnps，cl和cl-sfnps的ftir光譜圖；
圖4是本發明實施例2的sf，blank-sfnps，tpl-sfnps，cl-sfnps的酰胺i區ftir光譜(1700-1600cm-1)圖；
圖5是本發明實施例2的tpl-sfnps(a)以及cl-sfnp(b)在37℃，ph＝7.4和ph＝5.0的pbs中的累積釋放曲線圖；
圖6是本發明實施例3的blank-sfnps，tpl-sfnps和cl-sfnps的安全性評價圖；
圖7是本發明實施例3的用mts測定tpl，tpl-sfnps，cl，cl-sfnps對miapaca-2和panc-1細胞的抑制增殖和殺傷作用的ic50曲線圖；
圖8是本發明實施例4的使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察ritc-sfnps的細胞攝取過程，并用游離ritc的細胞攝取過程作對照的納米粒細胞內定位圖；
圖9是本發明實施例4的sfnps的細胞攝取定量測定結果圖；
圖10是本發明實施例5的不同劑量藥物抑制miapaca-2和panc-1克隆形成作用柱狀圖；
圖11是本發明實施例6tpl和cl，tpl-sfnps和cl-sfnps抗miapaca-2增殖的協同增效作用圖；
圖12是本發明實施例6tpl和cl，tpl-sfnps和cl-sfnps抗panc-1增殖的協同增效作用圖；
圖13是本發明實施例7cl-sfnps和tpl-sfnps促miapaca-2和panc-1凋亡作用圖。
具體實施方式
為了克服雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)水溶性差的缺陷，本發明研制了載雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)的絲蛋白納米粒(tpl-sfnps和cl-sfnps)，并評估其抗人胰腺癌細胞的協同增效作用。用改良的去溶劑化方法制備tpl-sfnps和cl-sfnps。兩種sfnps的表征，分別通過動態激光光譜法(dls)測粒徑和電位，透射電子顯微鏡(tem)觀察形態。通過hplc評價包封率，載藥量和藥物釋放特性。用miapaca-2和panc-1人胰腺癌細胞株研究sfnps的細胞毒性和協同增效作用，用新鮮的小鼠血液進行溶血性試驗評價載藥納米粒的生物相容性。體外藥物釋放研究顯示，在ph5(溶酶體ph)pbs中觀察到sfnps藥物快速釋放，而在ph7.4(血漿ph)的pbs中緩慢釋放。與游離的tpl(ic5011.25和11.58nm)和cl(ic500.84和1.23μm)相比，tpl-sfnps(ic503.80和4.75nm)和cl-sfnp(ic500.38和0.64μm)能更有效地對抗miapaca-2和panc-1細胞增殖，是游離藥物的2-3倍。此外，與單獨的tpl-sfnps或cl-sfnps相比，tpl-sfnps和cl-sfnps的共同治療顯著增加了對相同細胞的生長抑制。用compusyn軟件計算的幾乎所有濃度的聯合指數(ci)值都<1，這表明tpl-sfnps與cl-sfnps聯合的生長抑制作用是協同的而不是單純的疊加。
下面通過具體實施例闡述本發明。
材料：
雷公藤甲素(tpl)和雷公藤紅素(cl)購自chengdubiopurifyphytochemicalsltd.(chengdu，china)。蠶繭由浙江省桐鄉桑樹絲基地(中國桐鄉)提供。截留7,000da的透析膜(mwco從viskase公司(chicago，usa)獲得。hoechst33342和3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)來自sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)。羅丹明-b-異硫氰酸酯(ritc)和膜聯蛋白v-fitc凋亡檢測試劑盒由sigmachemicals(st.louis，mo，usa)提供。hplc級乙腈和甲醇從bdhchemicals(gibbstown，nj)獲得。本發明實施例中使用的其他化學品均為分析純級，按原樣使用。除非另有說明，使用的乙醇和丙酮和其他化學品從vwr國際公司(darmstadt，德國)獲得。
dulbecco改良的eagle培養基(dmem)，胎牛血清(fbs)購自gibcobrl(carlsbad，ca，usa)。青霉素-鏈霉素，0.25％胰蛋白酶-edta和非必需氨基酸獲自美國invitrogenco。人pc細胞miapaca-2和panc-1細胞來自prabhu博士實驗室的贈品，最初獲自美國典型培養物保藏中心(atcc)(rockville，md)。
實施例1絲蛋白納米粒的制備
1.再生絲素蛋白(sf)制備、純化和分子量
將購買的桑蠶繭切成小片，并在0.02mna2co3中脫膠兩次，每次30分鐘，并用去離子水徹底沖洗。空氣干燥后，脫膠的絲素蛋白(sf)溶解在三元體系cacl2-ch3ch2oh-h2o(摩爾比為1:2:8)中，在75℃持續攪拌4小時。此外，將所得sf溶液在4500rpm下離心5分鐘。小心收集上清液，并在viskase透析膜(mwco7000da)中用去離子水透析3天以除去鹽和乙醇。在14000rpm下離心15分鐘后，使用nanodroptm2000/2000c分光光度計測定制備的絲素蛋白溶液的濃度。通過sds-page(8％分離凝膠和5％冷凝凝膠)，然后通過考馬斯亮藍r-250染色分析提取的sf的分子量范圍。最后將絲素蛋白溶液在4℃中儲存備用。
結果：sf是由5509個氨基酸組成的并且構成重鏈(391kda)和輕鏈(26kda)的生物大分子，sf分子在脫膠過程中經歷水解。sds-page(分離凝膠的濃度為8％)實驗結果顯示再生的sf是具有寬分子量分布的多肽混合物(圖1)，圖1中m是分子量標記。
2.絲蛋白納米粒的制備
以上述方法提取的具可調生物降解性能及良好生物相容性的sf為載體材料，采用改良的去溶劑化法制備載雷公藤甲素(tpl)或雷公藤紅素(cl)單藥納米粒tpl-sfnps，cl-sfnps。即用儲備溶液配置2mg/ml的sf溶液，在溫和不斷攪拌下逐滴向其中加入溶解在乙醇：丙酮(v/v＝3:2)二元溶劑中的2.5mg/mltpl溶液或2mg/mlcl溶液。將所得懸浮液在-20℃冰箱中冷凍16小時，并在溫水(40℃)下快速解凍。然后離心收集制得的納米粒(14000rpm，20min)，并且用去離子水洗滌去除雜質及游離藥物(洗滌三次)。以去離子水重懸所得納米粒沉淀，并超聲破碎儀超聲分散，隨后加入5％(w/v)海藻糖作為冷凍保護劑進行凍干干燥。凍干后的納米粒儲存在2-8℃，備用。
3.處方工藝優化的實驗設計
taguchil9正交陣列實驗設計用于優化tpl-sfnps和cl-sfnps的制劑參數。使用三因素，三級設計來研究制劑變量的相互作用和二次效應。選擇用于制劑優化的有機溶液：sf溶液，sf，tpl和cl的濃度基于初步的實驗。選擇用于配方優化的三個因子及其編碼水平示于下表1中。使用
表1用于tpl-sfnp和cl-sfnp制劑開發和優化的因子和編碼水平
處方優化的實驗設計結果：
使用l9正交陣列實驗設計(三因素，三水平)優化tpl-sfnps和cl-sfnps的制備工藝流程。選擇用于實驗設計的因素水平及結果如表2所示。參照軟件
表2tpl-sfnps和cl-sfnps制備處方工藝優化的taguchil9正交實驗設計及結果
表3由
實施例2納米顆粒表征
1.方法
1.1粒徑，zeta電位和形態
將冷凍干燥的sfnp分散在去離子水(ph7.0)中。通過動態光散射檢測(nanobrookomni，brookhaveninstrumentcorp)測定np(blank-sfnp，tpl-sfnp，cl-sfnp)的平均尺寸和ζ電位(所有測量在室溫下進行三次)。通過透射電子顯微鏡(tem，h600，hitachi，japan)進行np和sf的形態學檢查。將sf稀釋并將凍干的np用去離子水重懸浮。通過將一滴稀懸浮液置于涂有碳膜的銅網上制備另外的樣品。然后在tem下觀察樣品的表面形態。
1.2紅外光譜ir吸收和β-折疊含量
使用傅立葉變換紅外分光光度計(ftir，brukervertex80v，德國)進行加載藥物的sfnp以及游離藥物的ftir光譜。還檢測了凍干的再生sf的光譜。對于每次測量，從具有4cm-1的分辨率的32次掃描產生光譜。使用peakfit4.12通過酰胺i譜帶的解卷積獲得np或再生sf中的sf的β-折疊含量。在800-2000cm-1的光譜區中獲得吸收模式的ir光譜。
1.3藥物裝載能力和包封率
通過agilent1050hplc(agilenttechnologies，paloalto，ca，usa)分析tpl-sfnps和cl-sfnp的包封率和載藥量，使用c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，agilenttechnologies，usa)進行分析，tpl和cl的流動相分別為甲醇：水(55:45，v/v)和甲醇：水(90:10，v/v)，流速為1ml/min，檢測波長分別為218nm和430nm。
對于包封率測定，在制備納米粒時收集上清液，并用0.45μm微孔濾膜過濾，通過hplc分析上清液中的游離藥物。將tpl-sfnp和cl-sfnps分散在由乙醇：丙酮(2:3，v/v)組成的二元溶劑中，超聲處理10分鐘以測定載藥量(％)。將懸浮液進一步以14000rpm離心20分鐘，收集上清液，0.45μm微孔濾膜過濾，，然后進行進樣分析。納米粒的包封率(ee)和載藥量(dl)使用以下方程計算：
ee(％)＝sfnps中的藥物量/投藥量×100％
dl(％)＝sfnps中的藥物量/sfnps總量×100％
1.4體外藥物釋放
在ph7.4和ph5的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中測定sfnps中的tpl和cl累積釋放動力學行為。將相同量的sfnps混懸在pbs中，并分別放置在加蓋的玻璃瓶中，每瓶2ml，隨后在37℃下培養箱以120轉/分鐘的振蕩速度振蕩。在預定的時間間隔(1,4,8,24,48,72,120和168小時)，取出每種制劑的三個玻璃瓶，并通過離心(14000rpm，15min)，分離納米顆粒和釋放介質，離心三次。通過hplc測定納米顆粒中殘留的tpl和cl的量。以累積藥物釋放對時間作圖得累積釋放曲線。
2.結果
2.1粒徑，zeta電位和形態
如圖2中的tem圖像所示，sfnps呈現出球形和單一分散。圖2中，a.sf的tem圖；b.blank-sfnps的tem圖；c.tpl-sfnpstem圖和制劑圖；d.cl-sfnps的tem圖和制劑圖。比例尺：200nm。tpl-sfnps和cl-sfnps的粒徑分別為166.4±4.6nm(pdi<0.3)和170.4±2.3nm(pdi<0.3)(表4)。tpl-sfnps和cl-sfnps的平均zeta分別電位為-27.2±2.0mv和-25.5±2.6mv(表1)，帶負電荷的納米顆粒具有較長的循環壽命和較小的細胞毒性，tpl-sfnps和cl-sfnps的上述zeta電位，可減少聚集并延長絲蛋白納米粒在血液中的循環時間。
表4sf，sfnps，tpl-sfnps，cl-sfnps(n＝3)的粒徑，zeta電位，包封率，載藥量和β-折疊含量
2.2紅外吸收光譜和β結構含量
tpl，cl，tpl-sfnps，cl-sfnp，sf和sfnp的ftir光譜如圖3所示。tpl-sfnps和cl-sfnps在1415cm-1和1325cm-1的tpl和cl表現出特征吸收峰，這證實了藥物成功包封到sfnp中。發現sf中的β-折疊含量為約16.8％，但在空白sfnps中其增加至35.3％。此外，tpl-sfnps和cl-sfnp中的β-折疊含量在tpl和cl存在下增加至57.7％和77.6％(表4，圖4)。這意味著tpl和cl的增加也有利于sf從無規卷曲/螺旋到β折疊的構象轉變，可能是因為tpl，cl和sf大分子之間的相互疏水作用。此外，由tpl或cl誘導的更多的β-折疊形成可能有益于它們在sfnp中的包載，從而在隨后的應用中引起緩慢的藥物釋放作用。
2.3藥物載藥量和包封效率
藥物包載能力是藥物遞送中的關鍵因素。為了獲得高載藥量以滿足治療需要，本發明使用優化的處方工藝制備了載藥sfnps。制備的tpl-sfnps和cl-sfnps載藥量分別有57.0±4.7μg/mg和63.5±3.8μg/mg的，包封率有81.8±2.8％和87.0±1.1％(表4)。
2.4體外藥物釋放曲線
用兩種不同ph值的pbs研究tpl-sfnps和cl-sfnps的累積藥物釋放特征。ph7.4與正常細胞的細胞外生理ph相當，而ph5與癌細胞的溶酶體ph相當。結果如圖5a和5b所示。兩種藥物在ph7.4時可從納米粒中逐漸緩慢釋放，表明將藥物包裹在sfnp中可以顯著延長其在血漿中的循環時間。但是在整個早期時間點(1至24小時)和7天釋放期，用ph5.0的pbs溫育時藥物釋放明顯更快，累積tpl和cl釋放量在24小時內為可達53％和55％，7天累積總釋放量約為95％和80％，與ph7.4中的82％和65％相比具有更快釋放模式，表明sfnp可以作為藥物的溶酶體遞送平臺。
本發明的絲蛋白納米粒可以在生理ph下以緩慢和持續的方式釋放藥物，而在較低的細胞內ph下快速釋放。在低ph下絲蛋白失去其整體酸性，加上其這個表面負凈電荷，這都導致藥物快速釋放。ph依賴性藥物釋放也可歸因于絲蛋白納米粒內藥物的有效包裹及負載。
實施例3空白sfnps和載藥sfnps的安全性評價
1.體外溶血性測定
在體外對sfnp、載藥的sfnps進行溶血性測定以考察其生物相容性。簡言之，將0.2ml的3.8％檸檬酸鈉與新鮮的4ml小鼠血混合，隨后在3,000rpm離心10min，收集沉淀并將其懸浮在37℃pbs(ph7.4)中洗滌3次，最終得到5％(v/v)的rcb懸浮液。將10mg/ml懸浮的nps(blank-sfnps，tpl-sfnps和cl-sfnps)在pbs中與rbc一起溫育。用0.1％tritonx-100和pbs加入到rbcs溶液中分別用作陽性和陰性對照。所有樣品在室溫下溫育2小時。然后，將樣品離心5min，小心收集100μl上清液，并轉移至96孔板，以微量平板讀數器檢測血紅蛋白的含量。根據以下等式計算溶血百分比：
溶血(％)＝[光學密度(y)—陰性對照光密度(c)]*100/[(陽性對照光密度—陰性對照光密度)。
結果：如圖6a所示，與顯示最高毒性可破壞溶液中存在的100％rbc陽性對照tritonx-100相比，用作陰性對照的pbs組，幾乎沒有引起溶血。與pbs類似，sfnps和載藥的sfnps在的高濃度(10mg/ml)下不引起小鼠紅細胞的任何溶血。
2.采用mts法進行細胞存活力/細胞毒性檢測
通過mts法測定空白絲蛋白納米粒blank-sfnps對人胰腺癌細胞miapaca-2和panc-1，以及正常細胞hek293和hgf-1的細胞毒性。使用濃度范圍為0.125mg/ml至1mg/ml的blank-sfnps來檢測。將系列濃度blank-sfnps分別加入預先孵育的四種細胞中，繼續孵育72小時后，去除培養基，然后加入100μl含有20％mts和1％吩嗪硫酸甲酯(pms)的無血清培養基，并孵育1小時。通過微量板讀數器(μquanttm，儀器公司)在490nm測量每個孔的吸光度。將未加藥物處理細胞的細胞存活率設定為100％，無細胞的孔的作為調零孔。通過prism軟件(sandiego，ca)分析ic50值。每個實驗進行至少三次。
通過mts法測定藥物及載藥納米粒對人胰腺癌細胞miapaca-2和panc-1的細胞毒性。將系列濃度的tpl，cl，tpl-sfnps和cl-sfnp分別加入預先孵育的miapaca-2和panc-1細胞中，同法測定ic50值。
結果：blank-sfnps對胰腺癌細胞miapaca-2和panc-1，正常細胞hek293和hgf-1都沒有顯著的抑制作用(圖6b)，表明單獨的sfnps不影響所研究濃度中的任何可定量的毒性，空白sfnps在體外具有較高的安全性和良好的生物相容性。
在圖6中，a.tpl-sfnps，cl-sfnps及其組合在新鮮小鼠血液中的生物相容性。tritonx-100和pbs分別用作陽性對照和陰性對照。b.使用mts測定的blank-sfnps在miapaca-2，panc-1，hek-293和hgf-1細胞系中的細胞毒性。(平均值±sd，n＝5；*：p<0.05，**：p<0.01)。
載藥的sfnps的體外細胞毒性檢測結果：
如圖7a-7d所示。tpl，cl，tpl-sfnps和cl-sfnps的抑制胰腺癌細胞增殖作用中都表現出劑量的依賴性，然而，與tpc和cl相比，tpl-sfnps和cl-sfnps具有較低的ic50值，證明tpl-sfnps和cl-sfnps具有較強的抗胰腺癌作用。tpl對miapaca-2作用的ic50值是11.58μm。但是對于tpl-sfnps的ic50值則顯著降低至3.8μm，與游離藥物相比約減少了3倍(圖7a)。類似地，對于panc-1細胞，游離tpl和tpl-sfnps的ic50值分別為11.25μm和4.57μm(圖7b)。對于cl-sfnps也觀察到了類似的趨勢。對于miapaca-2細胞，游離cl的ic50值為1.32μm，而對于cl-sfnps，ic50值降低至0.65μm，與游離藥物相比約減少2倍(圖7c)。同樣，對于panc-1細胞，游離cl和cl-sfnps的ic50值分別為0.83μm和0.38μm(圖7d)。因此，圖7結果表明，當相同量的藥物包裹在sfnps中時，跟游離藥物相比，tpl-sfnps和cl-sfnps可顯著增強抗胰腺癌作用。
在圖7中，a.tpl和tpl-sfnps對miapaca-2細胞系中的ic50曲線；b.tpl和tpl-sfnps對panc-1細胞系的ic50曲線；c.cl和cl-sfnps對miapaca-2細胞的ic50曲線；d.cl和cl-sfnps對panc-1細胞的ic50曲線。
實施例4體外細胞攝取
1.細胞培養
將胰腺癌細胞paca-2，panc-1，hek293和hgf-1在37℃，加濕，5％co2環境中，用含有10％胎牛血清的dmem或emem培養基單層培養至70-80％。每隔一天補充培養基，在匯合度達到70-80％后對細胞進行繼代培養。
2.體外細胞攝取
2.1采用激光共聚焦顯微鏡進行細胞內定位成像
為了研究sfnps的細胞攝取，使用實施例1提到的制備載藥納米粒的相同方法制備熒光標記物rtic的納米粒(rtic-sfnps)。將miapaca-2和panc-1細胞(5×104個細胞/孔)接種在置于6孔板中的無菌蓋玻片上，并在37℃，5％co2下，于含有10％胎牛血清的dmem培養基中孵育過夜。然后加入游離rtic和rtic-sfnps(在培養基中濃度為0.5μm)作用5min，30min和60min(未處理的細胞用作對照)。然后，用pbs洗滌細胞三次，隨后用4％β-甲醛固定15min，并再次用pbs洗滌三次。細胞核用hoechst33342染色并用pbs洗滌三次，然后使用leicatcssp2共聚焦顯微鏡對細胞成像，并使用leica共聚焦軟件分析圖像。
2.2通過流式細胞術測定細胞攝取
采用流式細胞術定量分析miapa-ca-2和panc-1對sfnps的攝取。將5×104個細胞/孔接種在12孔板中并孵育24小時。然后加入游離rtic和rtic-sfnps(培養基中濃度為0.5μm)，孵育5min，30min和60min，并用溫熱的(37℃)磷酸鹽緩沖液(d-pbs)洗滌兩次，胰蛋白酶消化細胞，用冰冷的d-pbs洗滌。最后將細胞重懸浮于500μl冰冷的d-pbs中，并在黑暗中于冰上放置10分鐘。通過bectondickinsonfacscalibur流式細胞儀(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)分析樣品。
3.體外細胞攝取結果
3.1納米粒的細胞內定位
以人胰腺癌細胞panc-1和miapaca-2為研究對象，采用激光共聚焦掃描儀和熒光標記法，驗證了絲蛋白納米粒sfnps的細胞攝取，使用激發紅光的ritc標記sfnps，使用具有藍色熒光的hoechst33342標記細胞核。分別將ritc，ritc-sfnps加入到panc-1和miapaca-2細胞中，作用5min，30min和60min。結果顯示ritc-sfnps以時間依賴性方式被兩種細胞系有效吸收，且在孵育60min后主要分布在細胞質或核周區域中(圖8a和8b)。與30min和60min時的ritc作用組相比，ritc-sfnps能顯著更快地被內吞，表明包裹在sfnps中的藥物可以被癌細胞有效吸收，使得所載藥物能夠同時在細胞內釋放。進入細胞的納米粒內化過程可以被認為是結合(吸附)過程，其中的納米粒通過內吞作用被內化。41，42一旦納米顆粒被內吞，首先它們會在核膜周圍的細胞質中被發現。盡管孵育的納米粒具有陰性表面，但它們大部分被細胞內化并且在囊狀運輸期間保持穩定。還觀察到兩個細胞系在實驗期間保持存活，這支持先前的結果，單獨的絲素蛋白納米顆粒不導致任何可測量的毒性。
在圖8中，a.miapaca-2，孵育時間為5min，30min和60min；b.panc-1，孵育時間為5min，30min和60min。放大倍數：×40。
3.2通過流式細胞術(fcm)測定sfnps的細胞攝取
結果如圖9所示，與panc-1細胞作用5min，30min和60min后，與游離ritc相比，ritc-sfnps顯示出明顯較高的熒光強度，約增加了2倍的熒光強度(圖9b、9d)。與游離ritc作用細胞相比，ritc-sfnps作用的miapaca-2細胞在熒光強度上也顯示出顯著的差異(圖9a、9c)，但其強度沒有在panc-1細胞系中看到的那樣顯著。
在圖9中，a和c：miapaca-2，孵育時間為5min，30min和60min；b和d：panc-1，孵育時間為5min，30min和60min；平均值±sd，n＝5；*：p<0.05，**：p<0.01。
實施例5克隆形成抑制測定
1.方法
克隆形成抑制測定用于測定tpl-sfnps和cl-sfnps對胰腺癌細胞的生長抑制作用。將1×103miapaca-2和panc-1細胞/孔接種在6孔板中。在第三天，用不同濃度的cl和cl-sfnp(cl：0.5-0.45μm)，tpl和tpl-sfnps(tpl：0.3-3.0nm)加入到細胞中，并繼續孵育4天，移除藥物，并加入新鮮培養基，再孵育7天。然后，用冰冷的甲醇和乙酸(3:1，v/v)混合物固定細胞，并孵育15分鐘。最后，用0.5％結晶紫對菌落進行染色。在顯微鏡下手動計數超過50個細胞的菌落定義為形成克隆，使用graphpadprism軟件進行數據分析。未加藥處理的細胞用作對照組。
2.結果
克隆形成測定或集落形成測定是基于單個細胞生長成集落的能力的體外細胞活性測定。通過細胞生長抑制測定tpl，cl，tpl-sfnps和cl-sfnps的抗癌活性。未經處理的miapaca-2和panc-1細胞產生大的集落，tpl，cl，tpl-sfnps和cl-sfnps作用的細胞顯示出克隆形成的劑量依賴性抑制。與游離的tpl和cl(圖10a，10b和10c，10d)相比，相同劑量下的tpl-sfnps和cl-sfnps在0.15和0.45μm濃度時分別顯示出更高的抑制克隆形成作用，miapaca-2和panc-1癌細胞形成的集落顯著減少。這表明在將tpl和cl包裹在sfnps中后表現出優異的抗癌活性。跟miapaca-2相比，panc-1細胞對藥物作用更敏感。在0.45μm的劑量下，miapaca-2的克隆抑制率為70％，而panc-1細胞的克隆抑制率高達90％。然而，兩種細胞系對tpl-sfnps都較敏感，并且在3.0nm劑量下約95％的集落被抑制(圖10a和10b)。總之，tpl-sfnps和cl-sfnps的快速內化和持續藥物釋放可以顯著增強相同劑量下的雷公藤紅素和雷公藤甲素的抗癌作用。
在圖10中，a.tpl和tpl-sfnps對miapaca-2的克隆形成抑制作用；b.tpl和tpl-sfnps對panc-1的克隆形成抑制作用；c.cl和cl-sfnps對miapaca-2的克隆形成抑制作用在；d.cl和cl-sfnps對panc-1的克隆形成抑制作用(平均值±sd，n＝3；*：p<0.05，**：p<0.01)。
實施例6tpl-sfnps和cl-sfnps的協同作用
1.聯合指數值的測定
為了評估tpl和cl，tpl-sfnps和cl-sfnp的協同增效作用，將各種濃度的藥物和載藥的sfnps加入預孵育的miapaca-2和panc-1細胞，作用72小時。基于compusyn軟件以及在實施例3中獲得的ic50值，將實驗設計為恒定組合比(表5)，并且用實施例3中描述的相同的mts測定方法測定細胞存活率，并通過compusyn軟件分析，計算得到聯合指數值(combinationindex，ci)。計算組合指數的公式為ci＝(d)1/(dx)1+(d)2/(dx)2，其中(dx)1和(dx)2表示純藥或藥物制劑，(d)1和(d)2是分別產生組合中相同作用所必需的純藥或載藥的sfnps的劑量。聯合指數值(ci)<1，＝1和>1分別表示協同作用，疊加作用和拮抗作用，ci越小表示協同增效作用越強。
表5用于聯合用藥分析的tpl和cl劑量范圍和組合設計
2.結果：tpl-sfnps和cl-sfnps的協同作用
用mts法研究tpl和cl或tpl-sfnps和cl-sfnps對miapaca-2和panc-1細胞抑制增殖作用。在確定單獨劑量反應曲線，并得到各自的ic50值后，選擇藥物組合濃度的范圍，用以評價使用藥物組合對胰腺癌細胞的抑制增殖作用。結果發現，與單獨作用(圖11a1和11b1，圖12a1和12b1)相比，當tpl(10和20nm)和cl(0.8和1.6μm)聯合作用時，兩種細胞系的細胞存活率都明顯降低。聯合指數ci值高于0.5(圖11a2和11a3，圖12a2和12a3)，表明tpl和cl的游離藥物組合可以在某些濃度下協同抑制胰腺癌細胞生長。此外，發現當用兩種不同的納米粒tpl-sfnps和cl-sfnps共同作用于兩種細胞時，細胞存活率顯著降低。在用tpl濃度為2.25,4.5和9nm的tpl-sfnp和cl濃度為0.25,0.5和1μm的cl-sfnps共同處理后，與tpl-sfnps和cl-sfnps單獨治療相比，miapaca-2細胞系的存活率顯著降低(圖11b1)。對于panc-1細胞，甚至在低劑量的tpl(1.125,2.25,4.5和9nm)和cl(0.125,0.25,0.5和1μm)(圖12b1)中也觀察到相同的納米粒聯合增效作用。總之，與單獨的納米粒和游離藥物以及它們的聯合作用相比，用cl-sfnp和tpl-sfnp聯合作用時，對癌細胞的毒性顯著增加。此外，使用compusyn軟件來鑒定藥物聯合作用的協同效應(compusyn軟件廣泛用于預測在體外和體內具有獨立作用機制的多種藥物的聯合作用產生的加和作用和協同作用效果)。用compusyn軟件計算得到，用于納米粒聯合作用的所有濃度組的聯合指數值(ci)均小于1，并且在某些組合中ci值低于0.5，這表明cl-sfnp和tpl-sfnp在特定癌細胞中的生長抑制效應是協同的而不是單純加和(圖11b2和11b3，圖12b2和12b3)。
在圖11中，tpl和cl的聯合作用：使用mts法測得的細胞存活率(a1)和用compusyn軟件分析得到的聯合指數(ci)值(a2)以及聯合指數圖(a3)。tpl-sfnps和cl-sfnps的聯合作用：使用mts法測得的細胞存活率(b1)和用compusyn軟件分析得到的聯合指數(ci)值(b2)以及聯合指數圖(b3)。
在圖12中，tpl和cl的聯合作用：使用mts法測得的細胞存活率(a1)和用compusyn軟件分析得到的聯合指數(ci)值(a2)以及聯合指數圖(a3)。tpl-sfnps和cl-sfnps的聯合作用：使用mts法測得的細胞存活率(b1)和用compusyn軟件分析得到的聯合指數(ci)值(b2)以及聯合指數圖(b3)。
實施例7tpl-sfnps和cl-sfnps的促凋亡作用
1.凋亡測定
使用annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡測定。將5×104miapaca-2和panc-1細胞接種于24孔板中，并孵育24小時，加入tpl(4.5nm)，cl(0.5μm)，tpl+cl和tpl-sfnp，cl-sfnp，tpl-sfnp+cl-sfnp(載相同量tpl和cl)作用48小時。然后，用冰冷的pbs洗滌細胞兩次，胰蛋白酶消化，離心，然后重懸于冷的結合緩沖液中。得到500μl的該細胞懸液，加入5μlannexinv-fitc和10μlpropidiumiodide(pi)溶液，置于冰上于黑暗中孵育10min。孵育后，通過bectondickinsonfacscalibur流式細胞儀(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)分析樣品。測試重復三次。
2.tpl-sfnps和cl-sfnps的促凋亡作用
經tpl和cl作用的miapaca-2細胞早期凋亡率分別為8.2％和11.4％，而它們聯合作用時總凋亡率可達30.0％，表現出了明顯的協同作用(圖13a和13b)。當tpl和cl單獨用于panc-1細胞時，觀察到的凋亡率分別為17.0％和14.0％，而聯合作用時為25.5％。單獨的tpl-sfnps和cl-sfnps作用組與等劑量的游離cl和tpl作用組相比凋亡明顯增加，作用于miapaca-2細胞時，凋亡率分別為24.0％和25.2％，而當以相同濃度聯合作用時，miapaca-2細胞的總凋亡率顯著提高(58.6％)(圖13a和13b)。聯合作用時，在panc-1細胞中發現同樣的趨勢(圖13c和13d)。總之，本實施例的實驗證實tpl和cl的納米粒聯合應用，能有效促進癌細胞的凋亡，再次證明了tpl-sfnps和cl-sfnp的聯合增效作用。
在圖13中，a-b.單獨和聯合tpl和cl，單獨和聯合使用cl-sfnp和tpl-sfnp(含同等劑量的tpl和cl)的促miapaca-2細胞凋亡作用。c-d.單獨和聯合tpl和cl，單獨和聯合使用cl-sfnp和tpl-sfnp(含同等劑量的tpl和cl)的促panc-1細胞凋亡作用(平均值±sd，n＝3；*：p<0.05，**：p<0.01)。
以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
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