AZ31鎂合金表面Na?MMT涂層的制備與測定方法與流程

本發明屬于醫學材料技術制備領域，尤其涉及一種az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備與測定方法。

背景技術：

鎂合金材料在工業用途中出現的化學性質活潑，易腐蝕降解等缺點，恰恰可以用來作為醫用可降解植入材料，但仍然存在降解過快的問題，怎樣使其在完成植入材料的支撐功能后再逐漸降解是醫用材料及臨床醫生關心的重點；另外，在鎂合金醫用植入材料中，能否使制備的涂層既能延緩降解又能促進骨的與生長愈合呢？本發明在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層，提高鎂合金耐蝕性基礎上，研發具有促進骨生長愈合的醫用鎂合金植入材料，減輕病人二次手術的痛苦及經濟負擔，具有現實性重要意義。蒙脫石由于其資源豐富，廉價易得，除了在醫藥領域的應用，在多個行業也應用廣泛。

探討在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層的方法。目前尚無該種礦物應用到鎂合金表面的報道，根據文獻中有關水滑石等礦物涂層的制備，經過多次試驗，反復研究，確定制備工藝為水熱法，溫度160℃，ph10.5，36h。制備出的涂層與基體結合緊密，較均勻，膜層性能相對較好，具有廣闊的研究潛力。

na-mmt涂層在az31合金表面形成的機理研究。na-mmt在酸性環境中的研究較多，在堿性條件的變化研究的較少，僅僅在放射性物質深埋后對mmt的影像中涉及到，堿性環境下，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層涂層機理較復雜，缺少相應的研究。

改進模擬體液，增加動態元素，用于研究na-mmt涂層的耐蝕性。在生物醫用材料做生物降解研究中，大多研究人員選用生理鹽水、pbs，hanks等作為模擬體液，上述液體能在一定程度上反映體液的無機鹽成分，但均不含氨基酸等有機成分，不能完全反應機體的狀況；另外浸泡實驗多采用靜置的方式，也與機體流動的體液，差距較大，數據很難反映出機體真實情況，

探討na-mmt涂層提高az31鎂合金血液相容性的機理。目前，大多數研究停留在血液相容性研究層面上，對機理研究的較少。

探討na-mmt涂層促進骨細胞貼壁生長，促進骨的生長。

目前用于人體的骨固定金屬材料為不銹鋼、鈦及鈦合金鈷基合金等，這些金屬材料在應用過程中仍然存在問題：1、金屬離子釋放造成的機體反應；2、強度及彈性模量高；3、需要二次手術。

在不斷探索過程中，鎂合金走進研究人員的視野----生物醫用降解材料。在鎂合金最初研究中，人們發現還是降解太快。存在問題：性質活躍、易腐蝕，降解快，其在體內未完成支撐使命后降解，從而導致植入失敗。此階段，鎂合金醫用材料的研究大多是圍繞提高其耐蝕性及生物相容性進行，例如增加微量元素制成合金、表面改性制備涂層。隨著醫用鎂合金的研究不斷推進，體內植入及臨床應用試驗表明，如果在延緩鎂合金降解的基礎上，能促進骨的再生，不失為兩全其美。

因此，在提高鎂合金耐蝕性基礎上，研發具有促進骨生長愈合的醫用鎂合金植入材料，具有現實性重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備與測定方法，旨在解決背景技術提及的現有技術的缺陷問題。本發明主要目標就是將自備的具有抗菌功能的na-mmt，通過水熱法負載到az31鎂合金表面，提高耐蝕性、血液相容性的同時具有促進骨的生長功能，拓展蒙脫石的應用領域，為鎂合金醫用植入材料的臨床應用奠定基礎。應用于人體的鎂合金骨植入材料主要是減緩降解速度，控制腐蝕，在骨骼修復后，逐漸降解，技術上采用水熱法制備na-mmt涂層，表面發生一定反應，結合力不強，后期在體內環境下會逐漸脫落，有利于控制鎂合金的降解。

本發明是這樣實現的，一種az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備方法，所述az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備方法包括以下步驟：

以鈣基蒙脫石(ca-mmt)為原料，采用離子交換法制備na-mmt，首先進行單因素實驗，分析氟化鈉用量、溫度、時間對na-mmt陽離子交換容的影響；然后，在單因素基礎上，利用響應面法優化工藝條件，建立響應面模型；

利用水熱法，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層。

進一步，建立響應面模型中選用二次多項式模型建立與檢驗回歸方程；回歸方程為：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²。

在單因素實驗的基礎上，使用design-expert8.0用中的box-behnken設計模式進行實驗設計，以影響鈉含量的3個因素：氟化鈉用量a、溫度b、時間c為自變量，各因素設計三因素三水平實驗。

進一步，na-mmt涂層的制備方法為：稱取5gna-mmt溶于200ml去離子水中，置于250ml錐形瓶中，在室溫下磁力攪拌0.5h，使na-mmt分散均勻；調節懸浮液ph值至10.5，80℃攪拌5h；將預處理的az31鎂合金放入水熱釜中，需保持鎂合金直立，將攪拌后懸浮液裝入水熱釜中，置于恒溫干燥箱中130℃，36h后取出，去離子水清洗，吹干；得到na-mmt涂層。

進一步，na-mmt涂層的制備方法中，在堿性環境下發生以下化學反應包括：

(1)蒙脫石發生水化反應：

al2[si4o10](oh)2+10h2o→2al(oh)3+4si(oh)4

(2)蒙脫石與naoh的反應:

al2[si4o10](oh)2+2na⁺+2oh^-→2naalsi2o6·h2o

(3)鎂合金發生水化反應：

mg+2h2o→mg(oh)2+h2↑

(4)蒙脫石與mg(oh)2的反應：

2al2[si4o10](oh)2+mg²⁺+2oh^-→mg(al2si4o12)·h2o

最后，蒙脫石硅氧四面體表面有活性的oh^-與鎂合金水化反應產生的oh^-，在水熱條件下，脫去h2o，在鎂合金表面形成氧橋，使蒙脫石與鎂合金az31緊密結合，形成na-mmt涂層。

進一步，

氟化鈉用量對na-mmt陽離子交換容的影響中隨著氟化鈉用量的增加na-mmt陽離子交換容也逐漸增加；當氟化鈉用量達到4mmol時，na-mmt陽離子交換容達到最大；當氟化鈉用量繼續增加，陽離子交換容不再繼續升高；

反應溫度對na-mmt陽離子交換容的影響中隨著溫度的升高，ca-mmt的陽離子交換容開始增加，當到達80℃時，na-mmt陽離子交換容達到最大，此后，當溫度繼續升高，陽離子交換容不再增加；

反應時間對na-mmt陽離子交換容的影響，隨著反應時間的延長，na-mmt陽離子交換容逐漸增加，當反應時間達到4h，na-mmt陽離子交換容達到最大，此后，繼續延長反應時間，陽離子交換容基本保持不變。

本發明另一目的在于提供一種az31鎂合金表面na-mmt涂層的測定方法，所述az31鎂合金表面na-mmt涂層的測定方法包括：利用電鏡、eds、xrd、ftir進行表征，分析形成機理；以dmem+10％fbs為模擬體液，利用浸泡后電鏡觀察、析氫實驗，ph測定、eis曲線及極化曲線分析na-mmt涂層耐蝕性機理；

通過溶血率、動態凝血時間、血細胞計數及血小板黏附實驗分析na-mmt涂層的體外血液相容性；采用接觸角計算表面張力，分析na-mmt涂層降低溶血率，提高鎂合金血液相容性的機理。

進一步，依據young方程由液體接觸角估算固體的表面張力；固體總表面張力近似等于固體表面張力的非極性值和極性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且與接觸角的關系見式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液體的表面張力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分別是液體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分別是固體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；測定兩個已知γ^dl和γ^pl的探測液體在固體表面的接觸角，代入式(1)，聯立方程求解可得固體γ^ds、γ^ps和固體的表面張力γs..

界面張力的計算依據owen-wendit方程,計算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)。

進一步，所述az31鎂合金表面na-mmt涂層的測定方法包括：選擇小鼠成骨細胞mc3t3進行細胞培養，采用細胞毒性試驗，評價涂層的細胞相容性及促進骨細胞生長的作用。

本發明的na-mmt涂層提高了az31鎂合金的耐蝕性，生物相容性，又促進了骨的生長，有望成為一種理想的醫用鎂合金植入材料。

本發明采用dmem+10％fbs為模擬體液，每24h更換，既能使各種離子更接近人體，又增加動態元素，更能真實地模擬體內環境，得出的數據及結論能客觀地反映體液、涂層兩者之間的相互作用。

本發明通過測定na-mmt涂層對極性、非極性溶液的接觸角，計算表面張力，分析提高了涂層對血液相容性的機理。采用體外骨細胞培養方法，分析na-mmt涂層的細胞相容性及涂層促進骨生長的機理。

本發明利用水熱法，以az31為基體，溫度160℃，ph10.5，時間36h，將na-mmt成功負載到az31鎂合金表面。na-mmt涂層電鏡下呈現mmt典型的片層狀結構；與基體結合緊密；縱切面顯示厚度約42μm；eds顯示az31鎂合金表面出現了al、si、o、mg等硅酸鹽的成分；xrd呈現mmt的特征峰。通過析氫及電化學試驗發現，na-mmt涂層耐蝕能力較好，延緩了az31鎂合金在模擬體液中的降解。

本發明對az31鎂合金表面的na-mmt涂層進行血液相容性探討。結果發現na-mmt涂層溶血率均低于5％，基體的溶血率為41.62％，大于5％；na-mmt涂層均對紅細胞、白細胞、血小板數量無明顯影響；對機體凝血無明顯影響。總之，體外實驗證明，az31鎂合金表面的na-mmt涂層均提高了az31鎂合金的血液相容性；分析其機理可能與涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關。

本發明對az31鎂合金表面的na-mmt涂層的細胞相容性進行探討。結果發現na-mmt涂層對小鼠成骨細胞mc3t3無細胞毒性作用，能促進骨細胞生長的作用。

本發明以na-mmt、氟化鈉為原料，采用液相離子交換法制備na-mmt；應用響應面法設計優化條件；采用掃描電鏡觀察na-mmt形貌；eds、xrd等分析組成及插層機理；利用水熱法，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層；研究了涂層在dmem+10％fbs溶液中的降解行為和耐腐蝕機理；采用測定溶血率、動態凝血時間，血小板粘附實驗、接觸角計算等研究涂層的血液相容性；通過細胞培養，研究na-mmt涂層的細胞相容性及促進骨生長的性能，得出以下結果

(1)以ca-mmt為原料，采用離子交換法成功制備na-mmt。

(2)采用響應面法，對na-mmt制備工藝進行優化，最佳優化條件：氟化鈉為4mmol，溫度為80℃，時間為4.5h，此時得到的na-mmt中的陽離子交換容達到112mg/g。

(3)利用水熱法，以az31為基體，溫度160℃，ph10.5，時間36h，將na-mmt成功負載到az31鎂合金表面。na-mmt涂層電鏡下呈現mmt典型的片層狀結構

(4)電化學實驗、析氫實驗、浸泡實驗中ph測定，均顯示na-mmt涂層提高了az31鎂合金的耐蝕能力，起到較好的延緩降解的效果。

(5)az31鎂合金表面的na-mmt涂層溶血率均低于5％，基體的溶血率為41.62％，大于5％；兩種涂層均對紅細胞、白細胞、血小板數量無明顯影響；對機體凝血無明顯影響。其機理可能與兩種涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關。

(6)對az31鎂合金表面的na-mmt涂層的細胞相容性研究發現na-mmt涂層對小鼠成骨細胞mc3t3無細胞毒性作用，能促進骨細胞生長的作用。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的電鏡下na-mmt涂層(a)(b),縱切面(c)(d)圖；

圖3是本發明實施例提供的na-mmt涂層的eds元素組成圖；

圖4是本發明實施例提供的az31、na-mmt涂層與na-mmt的xrd分析圖；

圖5是本發明實施例提供的為az31鎂合金及na-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液中浸泡后的宏觀形貌圖；

圖6是本發明實施例提供的az31鎂合金在dmem+10％fbs培養液中浸泡1d和3d后的

電鏡形貌圖；圖中：az31(a)(b)為1d，(c)(d)為3d；na-mmtcoating(e)(f)為1d，(g)(h)

為3d)。

圖7是本發明實施例提供的na-mmt涂層腐蝕后3d的eds譜圖分析圖；

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作詳細描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的az31鎂合金表面na-mmt涂層的制備方法，包括以下步驟：

s101：以鈣基蒙脫石(ca-mmt)為原料，以陽離子交換容為檢測指標，采用離子交換法制備na-mmt，首先進行單因素實驗，分析氟化鈉用量、溫度、時間對na-mmt陽離子交換容的影響；然后，在單因素基礎上，利用響應面法優化工藝條件，建立響應面模型。

s102：利用水熱法，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層。

下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。

1.1實驗試劑、材料與設備

1.1.1實驗試劑

實驗中所用到主要試劑見表1.1

表1.1化學試劑

1.1.2實驗材料

實驗所用基材為擠壓態az31合金，化學組成見表1.2。

表1.2實驗用的材料組成(wt％)

1.1.3實驗條件

實驗中析氫和浸泡實驗溫度通過恒溫水浴控制在36.5±1℃，電化學試驗溫度為室溫。析氫和浸泡實驗中，模擬體液為dmem溶液+10％小牛血清(fbs)，其配方見表1.3。

表1.3dmem的組成成分

1.1.4實驗設備

主要實驗設備見表1.4。

表1.4主要儀器設備

1.2材料的制備

1.2.1na-mmt的制備

1.2.1.1制備工藝

稱取ca-mmt5g，加入95ml去離子水，攪拌分散得到懸浮液；加入一定量的氟化鈉；恒溫攪拌5h；1500r/min，10min，得到白色沉淀物；反復洗滌、過濾，用0.1mol/l的na2s檢驗，直至濾液中無na⁺檢出，65℃干燥，研磨，過200目篩，即得na-mmt。

1.2.1.2陽離子交換容的測定

采用氯化銨-50％乙醇法，對蒙脫石陽離子交換容量進行測定：準確稱取烘干試樣1.0000g放于100ml燒杯中，加入20ml的50％乙醇溶液，不斷攪拌3～5min，使可溶鹽溶解。離心，棄上清，取出殘渣，放入100ml燒杯中，加入50ml的0.5mol·l^-1氯化銨-50％乙醇交換液，磁力攪拌30min；再離心，清液放入100ml容量瓶中；95％乙醇洗滌殘渣并離心兩次，每次約25ml。第一次洗液攪拌離心后，倒入已收集交換液的100ml容量瓶，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用作交換性陽離子的測試。第二次洗液攪拌離心后棄去，殘渣作陽離子交換容量的測試。將交換后的殘渣全部移入100ml錐形瓶中，加入25ml氯化鈣-甲醛混合溶液，約加入相當陽離子交換容量80％的0.1mol·l^-1的氫氧化鈉標準溶液，再加酚酞指示劑4滴，塞上橡皮塞，在振蕩器上激烈振蕩1min，繼續用0.1mol·l^-1的氫氧化鈉標準溶液滴定至穩定的粉紅色，如果3min不消失即終點。

陽離子交換容量計算公式：

cec＝c×v×100

式中：cec—陽離子交換容量，mmol/100g^-1蒙脫石；c—氫氧化鈉標準溶液濃度，mmol·l^-1；v—消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，ml。

1.2.1.3單因素分析

將5gca-mmt通過攪拌分散在95ml去離子水中得到懸浮液，分別分析氟化鈉的量、反應時間、溫度對na-mmt陽離子交換容的影響。

1.2.1.4響應面法優化工藝條件

在單因素實驗的基礎上，使用design-expert8.0用中的box-behnken設計模式進行實驗設計，以影響鈉含量的3個因素：氟化鈉的量(a)、溫度(b)、時間(c)為自變量，各因素設計三因素三水平實驗。實驗因素水平設計見表1.5，響應面實驗設計方案見表1.6。

表1.5響應面因素水平設計

表1.6響應面實驗設計方案

1.2.2az31鎂合金樣品的預處理

實驗用az31采用線切割加工成20×20×4mm和15×15×4mm的方塊。分別用360^#，600^#，800^#，1000^#，1200^#，1500^#水磨砂紙依次對樣品進行打磨，丙酮浸泡去除合金表面油污和氧化皮，然后，用無水乙醇沖洗并用吹風機吹干，備用。

1.2.3na-mmt涂層的制備

na-mmt涂層制備，稱取4gna-mmt溶于200ml去離子水中，置于250ml錐形瓶中，在室溫下磁力攪拌0.5h，使na-mmt分散均勻。調節懸浮液ph值至10.5，80℃攪拌5h。將預處理的az31鎂合金(20×20×4mm)放入水熱釜中，需保持鎂合金直立(可放入一塊聚四氟乙烯支撐)，將攪拌后懸浮液裝入水熱釜中，置于恒溫干燥箱中130℃，36h后取出，去離子水清洗，吹干，備用。

1.3涂層組織結構及成分分析

1.3.1掃描電子顯微鏡形貌觀察及能譜分析

樣品、涂層及腐蝕前后微觀形貌及截面形貌采用掃描電子顯微鏡觀察(novananosem450，usa)，實驗參數為加速電壓15kv。樣品上樣前噴金。利用掃描電鏡中附帶的能譜儀(eds)對上述樣品進行點掃描、線掃描及面掃描，分析各樣品的組成元素和含量變化。

1.3.2x射線衍射分析(xrd)

采用d/max-2500/pcx-衍射儀分析樣品及其腐蝕產物的物相組成，實驗參數為：管電流i＝40ma，管電壓u＝40kv，掃描角度范圍2θ為2-80°，掃描速度為8°/min，靶材為cu-kα(λ＝0.154060nm)靶。

1.3.3傅立葉紅外光譜分析

采用nicolet380傅立葉紅外光譜儀，測定na-mmt、na-mmt涂層及na-mmt涂層在dmem++10％fbs中腐蝕后產物的官能團。實驗參數為：波數范圍：4000-400cm^-1,分辨率：4cm^-1，背景采集：kbr壓片，采集點數：32個。

1.4涂層耐蝕性能測試

1.4.1電化學實驗

az31合金、na-mmt涂層的耐腐蝕性能主要采用電化學測量的方法電化學測試，通過由美國parstat2273電化學工作站完成。測試采用三電極體系：參比電極為飽和甘汞電極(sce)，輔助電極為鉑電極，工作電極為被測樣品。腐蝕介質為ph7.4的dmem+10％fbs溶液，實驗溫度為室溫，測試樣品面積與測試溶液體積比為1cm²/400ml。動態極化測試時，電位掃描范圍為自腐蝕電位(ec)±300mv起，掃描速度為1mv/s。電化學測試前，樣品在dmem+10％fbs溶液中浸泡5min以使開路電位盡可能穩定。電化學阻抗譜(eis)采用powersuite-powersine作為測試軟件，測試后采用zview軟件進行阻抗譜的擬合與分析。

1.4.2浸泡實驗

為進一步評價鎂合金及涂層的耐腐蝕性能和降解性能，進行體外浸泡試驗。浸泡試驗按照astm-

g31-72標準在dmem+10％fbs溶液中進行，測試過程中溶液溫度保持在36.5±1℃。浸泡一定時間后進行形貌觀察，成分分析等。

1.4.3析氫實驗

腐蝕析氫實驗采用排水集氫氣法，由酸式滴定管、玻璃漏斗和燒杯組成。浸泡樣品表面積約為12cm²，dmem+10％fbs溶液的體積約為300ml，面積/溶液比為1:25cm²/ml。由反應方程式可知，每溶解一個鎂原子就會產生一個氫氣分子，因此通過測量試樣在腐蝕過程中產生氫氣的體積就可以計算樣品的析氫腐蝕速率。

1.4.4ph值的變化

將az31合金、na-mmt涂層的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，每24h更新液體，起初浸泡24h內每隔1h測一次，后期每24h測定一次，溶液溫度保持在36.5±1℃，以時間為橫坐標，ph為縱坐標，繪制ph變化圖。

1.5體外血液相容性及機理

1.5.1溶血實驗

1.5.1.1溶血率的測定

(1)材料浸提液的制備

取2cm×2cm×0.4cm的az31合金、及na-mmt涂層各4塊，分別以0.9％nacl作為浸提液，按照iso10993-1標準(試樣表面積/浸提介質)3cm²/ml的比例，靜置于36.5±1℃恒溫培養箱中浸提90min。用細菌過濾器過濾除菌后，4℃冰箱保存備用。

(2)2％紅細胞懸液的制備

取新鮮人血4ml(本實驗室人員志愿捐獻，不存在醫學倫理爭議)，1500r/min離心10min，用膠頭滴管吸出上清液，沉淀在底部的紅細胞用0.9％nacl按上述方法洗滌3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9％nacl配成2％的混懸液(紅細胞1ml，加0.9％nacl至50ml)。

(3)溶血率計算

分別取上述三種樣品的材料浸提液7ml、與0.9％nacl(陰性對照組)和蒸餾水(陽性對照組)為對照，分別做三組平行樣。每組浸提液中加2％紅細胞懸液1ml，混勻后置36.5±1℃恒溫培養箱孵育1h，1000r/min離心10min，吸取上清，在545nm處測od值，取平均值計算溶血率。

溶血率(％)＝(實驗組od值－陰性對照組od值)/(陽性對照組od值－陰性對照組od值)×100％

1.5.1.2材料浸提液ph的變化

用ph計測量上述各浸提液浸提不同時間時的ph值。

1.5.1.3材料浸提液中鎂離子的變化

采用原子吸收光譜儀測定材料浸提液浸提不同時間的鎂離子、鋅離子的變化，方法同1.4.4。

1.5.2血細胞計數實驗

將az31合金、na-mmt涂層的az31合金分別置于10ml人抗凝血中(檸檬酸鈉抗凝)，靜置，30min后進行血細胞計數，與未接觸材料的血細胞數量進行比較。

1.5.3動態凝血時間實驗

體外動態凝血時間實驗可檢測內源性凝血因子被激活的程度,使鎂合金實驗樣品與血液接觸,測定游離血紅蛋白的光密度值,動態地觀察不同樣品對凝血時間的影響。

分別取30μl人抗凝血，滴在az31合金、na-mmt涂層表面。每組試驗設有6個間隔時間(5、20、35、50、90、130min)，每個時間3平行樣。到達預定時間后，樣品立即放入盛有15ml去離子水的燒杯中，靜置10min待未凝固的紅細胞充分溶于水中，在540nm處測溶液od值，繪制動態凝血曲線，人為定義od值0.1為出現凝血。

1.5.4血小板黏附實驗

將新鮮抗凝人血(實驗室人員捐獻)以1000r/min離心10min，即可得到富血小板血漿。分別移取20μl富血小板血漿滴于az31合金及na-mmt涂層的表面，36.5℃恒溫箱中保溫30min，然后用pbs(ph＝7.4)清洗除去樣品表面未黏附的血小板。2.5％戊二醛固定液中固定，乙醇系列梯度脫水，取出在空氣中自然干燥，噴金，掃描電鏡觀察黏附的血小板形貌。

1.5.5接觸角測定

在室溫、空氣條件下，利用躺滴法，采用德國的easy-drop型接觸角測量儀測定去離子水在樣品表面的接觸角，將2種樣品置于接觸角測量儀的樣品室，利用微量進樣器將0.6μl極性液體去離子水滴于樣品表面，接觸很短時間，立即采集液滴的圖像，利用量角法測得接觸角。每個樣品取3個平行樣品，每個平行樣測試4個不同的點，取其平均值。

1.5.6表面張力計算

依據young方程可由液體接觸角估算固體的表面張力。根據owens-wendt-kaelble觀點，固體總表面張力近似等于固體表面張力的非極性值和極性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且與接觸角的關系見式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液體的表面張力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分別是液體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分別是固體表面張力的非極性部分和極性部分(mn/m)。因此，測定兩個已知γ^dl和γ^pl的探測液體在固體表面的接觸角，代入式(1)，聯立方程求解可得固體γ^ds、γ^ps和固體的表面張力γs..

界面張力的計算依據owen-wendit方程,計算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

如表1.7實驗用液體表面張力及各分項值。

表1.7實驗用液體表面張力及各分項值

1.6細胞相容性實驗

試驗用細胞系是小鼠成骨細胞mc3t3。使用添加10％胎牛血清、10u/ml氨芐青霉素和100μg/ml硫鏈霉素的dmem培養液進行細胞。

將制備na-mmt涂層的試樣紫外照射消毒至少2h后，置于無菌培養皿中，按浸提液與試樣表面積之比為1cm2/ml的比例加入不含血清的dmem培養液，置于37℃、95％相對濕度、5％co2的培養箱中72h，1000rpm離心兩次去除合金沉淀物等，得到材料浸提液原液。使用ph計測量浸提液ph值，密封后置于4℃冰箱中保存備用。

將細胞于生長旺盛期用胰酶消化，離心后重懸完全培養液中在計數板上細胞于生長旺盛期用胰酶消化，離心后重懸完全培養液中在計數板上計數，調整細胞濃度至5×10⁴/ml，均勻接種于96孔板中，每組5個復孔，每100μl的細胞懸浮液。置于37℃、95％相對濕度、5％co2的培養箱內24h，待細胞貼壁后，棄掉培養液。陰性對照組中，加入不含浸提液的單純培養液，試驗組加入浸提液，陽性對照組，加入含10％dmso培養液，進行細胞培養。分別在1d、3d、5d三個時間點取出培養板，每孔加入10μlmc3t3，孵育3h后，使用酶標儀(bio-rad680)于450nm下測定每孔吸光度值od值，并計算細胞相對增殖度值，并計算細胞相對增殖度rgr：

rgr(％)＝實驗組值/陰性對照組值×100％(2-1)

1.7數據處理

采用spss16.0統計軟件對所得數據進行分析，采用平均值x±標準差(sd)記錄實驗結果，對實驗數據結果進行方差分析或t檢驗，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異非常顯著。

2.鈉化蒙脫石制備工藝優化及表征

蒙脫石(mmt)是一種片層狀硅酸鹽，由于其特殊的片層狀結構，帶電荷的不均勻性及較大的比表面積，在醫藥上廣泛用作乳化劑、助懸劑、增稠劑、吸附劑、緩釋載體等。天然蒙脫石層間陽離子通常是ca²⁺、na⁺、k⁺、mg²⁺，可以通過離子交換法制備h⁺、li⁺、nh⁴⁺、k⁺、cu²⁺、na+、al³⁺、fe³⁺等改性蒙脫石。我國天然蒙脫石以鈣基蒙脫石為主，存在陽離子交換容低的缺點，為改善這一缺點，常常先進行鈉化，即鈉化蒙脫石(na-mmt)，然后再進行陽離子交換。本實驗以ca-mmt為原料，將氟化鈉中的na⁺引入na-mmt的層間，制備鈉化蒙脫石(na-mmt)，并對其進行表征，以陽離子交換容為指標，采用響應面法優化工藝條件。本發明為蒙脫石作為載體制備抗菌材料的研究提供理論基礎，同時拓寬其應用領域。

2.1響應面模型優化na-mmt制備工藝

2.1.1單因素分析

2.1.1.1氟化鈉用量對na-mmt陽離子交換容的影響

氟化鈉用量對na-mmt陽離子交換容的影響中隨著氟化鈉用量的增加na-mmt陽離子交換容也逐漸增加；當氟化鈉用量達到4mmol時，na-mmt陽離子交換容達到最大；當氟化鈉用量繼續增加，陽離子交換容不再繼續升高；

2.1.1.2反應溫度對na-mmt陽離子交換容的影響

反應溫度對na-mmt陽離子交換容的影響中隨著溫度的升高，ca-mmt的陽離子交換容開始增加，當到達80℃時，na-mmt陽離子交換容達到最大，此后，當溫度繼續升高，陽離子交換容不再增加。

2.1.1.3反應時間對na-mmt陽離子交換容的影響

反應時間對na-mmt陽離子交換容的影響，隨著反應時間的延長，na-mmt陽離子交換容逐漸增加，當反應時間達到4h，na-mmt陽離子交換容達到最大，此后，繼續延長反應時間，陽離子交換容基本保持不變。

2.1.2響應面模型設計與結果

線性及三次模型擬合不顯著(p>0.05)，二次模型擬合極顯著(p<0.01)，因此選用二次多項式模型。系統趨向于選擇擁有最大預測決定系數和最小預測殘差平方和的模型，即二次多項式模型。

2.1.3建立與檢驗回歸方程

應用design-expert軟件對表2.1的實驗數據進行回歸分析，得到回歸模型為：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²

對上述模型進行方差分析，結果見表2.1。

表2.1回歸模型方差分析表

2.1.4回歸方程的參數評估與因子效應分析

二次回歸模型的參數評估見表2.2，a、b、c、ac、c²達到顯著水平，a²、b²為極顯著水平，由此可見，氟化鈉的量、溫度、時間對na-mmt中陽離子交換容有顯著影響。綜合考慮各因素的影響，3個因素對na-mmt的陽離子交換容的影響次序為：氟化鈉用量＞反應溫度＞反應時間。

表2.2回歸模型系數顯著性檢驗表

2.1.5響應面交互作用分析

2.1.5.1氟化鈉的量與反應溫度的交互作用

反應時間4.5h時，氟化鈉用量、反應溫度對na-mmt的陽離子交換容的影響顯著，氟化鈉用量與溫度交互作用不顯著。固定反應時間，隨著氟化鈉用量的增加，na-mmt的陽離子交換容也增大，氟化鈉用量達4mmol左右時，陽離子交換容最高；氟化鈉用量為4mmol時，隨反應溫度升高，na-mmt中的陽離子交換容逐漸增加，80℃左右陽離子交換容最高，溫度再繼續升高，陽離子交換容不再升高，反而有所下降。分析原因可能為在一定的溫度范圍內，升高溫度加快離子交換的反應速度，通過離子交換進入到na-mmt中na⁺增加；但是，溫度繼續升高，na⁺從蒙脫石中的溶出也會相應增加；另外，na-mmt中na⁺除了離子交換的部分，還有以化學吸附的形式進入si-o四面體和al-o八面體的微孔中少量的na⁺，反應溫度升高，這部分na⁺可能出現解吸附，在洗滌過程中去除，導致陽離子交換容下降。

2.1.5.2氟化鈉用量與反應時間的交互作用

反應溫度80℃時，氟化鈉用量、時間顯著影響na-mmt的陽離子交換容，二者存在顯著的交互作用。固定反應溫度，隨反應時間增加，na-mmt的陽離子交換容逐漸增加，4.5h時陽離子交換容最高；反應時間為4.5h時，隨著氟化鈉用量的增加，na-mmt的陽離子交換容逐漸增加，4mmol左右達到最大。分析原因可能隨著反應時間的增加，蒙脫石中陽離子交換不斷增加，4.5h后ca²⁺、na⁺交換達到平衡，再增加時間，也不會使更多的na⁺進入na-mmt層間。

2.1.5.3.反應時間與溫度的交互作用時間

氟化鈉用量為4mmol時，反應時間、溫度對na-mmt的陽離子交換容有顯著影響，但二者無顯著交互作用。固定氟化鈉濃度，隨反應溫度的增加，na-mmt的陽離子交換容逐漸增加，80℃時陽離子交換容最高，當反應溫度80℃時，na-mmt中的陽離子交換容隨時間的增加而逐漸增加，4.5h時陽離子交換容最高，進一步增加反應時間，陽離子交換容不再增加，反而逐漸下降。這是因為隨著反應時間的延長，離子交換反應增加，使交換進入na-mmt中na⁺增加，繼續延長反應時間na⁺的溶出也會相應增加；另外，si-o四面體和al-o八面體的微孔中吸附少量na⁺可能出現解吸附，導致na-mmt的陽離子交換容下降。

2.2na-mmt的形貌觀察

na-mmt電鏡下形貌，離子交換前的ca-mmt，鏡下可見顆粒較大，聚集成花絮狀、團塊狀聚集體，邊緣呈圓盾狀、旋渦狀、尖角狀等形貌。na-mmt鏡下形貌，顆粒較細小，很少聚集成團塊，顆粒呈不規則形，有的邊緣也存在片層狀，旋渦狀形貌。

本發明以ca-mmt為原料，采用液相離子交換法制備na-mmt抗菌中間體；應用響應面法設計優化條件；采用掃描電鏡觀察na-mmt形貌；eds、xrd等分析組成及插層機理，得出以下結果

(1)以ca-mmt為原料，采用離子交換法成功制備na-mmt。

(2)單因素試驗分析表明，采用na-mmt5g，分別在氟化鈉用量為4mmol、溫度80℃、反應時間4h時，各自得到最高的陽離子交換容。

(3)采用響應面法，對na-mmt制備工藝進行優化，得到的回歸方程為：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²；最佳優化條件：氟化鈉為4mmol，溫度為80℃，時間為4.5h，此時得到的na-mmt的陽離子交換容達到112mg/g。

(4)na-mmt鏡下呈現顆粒細小，很少聚集成團塊，顆粒呈不規則形，有的邊緣也存在片層狀，旋渦狀形貌。

3na-mmt涂層的耐蝕性能及降解機理

據統計，我國每年由于疾病、交通事故和運動創傷等造成的骨缺損和缺失患者人數近1000萬人，在骨修復手術過程中，骨植入材料起到至關重要的作用。目前，在臨床上常用的傳統骨科內固定材料主要有不銹鋼、鈦合金、鈷鉻鉬合金等，雖然，這些材料較廣泛地應用于臨床，但仍存在彈性模量高于人骨，多數需要二次手術等缺點。因此，發展可降解金屬生物材料已成為當前骨植入材料發展的方向，鎂合金以其具有可降解性能、良好的生物學特性及力學性能漸漸引起研究人員的關注，大量的基礎研究、體外實驗、體內植入實驗，均取得可喜的成績。但是，也要看到鎂合金作為醫用植入材料仍然存在許多問題：鎂合金植入材料在人體內含有cl^-離子體液環境中會迅速降解，使之不能維持到骨骼愈合；另外腐蝕產生的物質刺激局部組織出現炎癥反應等等。鎂合金醫用材料的這些缺點嚴重影響其應用，制約了它的發展。如何減慢鎂合金的降解速度，特別是控制其植入初期的降解，使之在體內完成使命后再逐漸降解？目前這一問題成為研究的熱點。對鎂合金表面進行改性是提高鎂合金耐腐蝕性行之有效的方法，不改變鎂合金固有的特性，通過調整改性表面的成分和結構控制其腐蝕速率。

天然蒙脫石是由兩層硅氧四面體夾一層鋁氧八面體構成的層狀硅酸鹽粘土礦物，是非金屬納米礦物，其鈉化后的蒙脫石具有分散能力好、吸附性能及離子交換能力強等優點，加之礦產資源豐富、價格低等，廣泛應用于石油化工、冶金、污水處理、農業、醫藥等行業。

本發明通過水熱法在鎂合金表面制備na-mmt涂層；電鏡觀察形貌；eds、xrd分析其組成，探討涂層形成機理；通過電化學實驗、浸泡實驗、電鏡觀察浸泡后形貌及xrd分析涂層的抗腐蝕性能及機理。本發明首次將蒙脫石應用于鎂合金表面，為鎂合金改性提供新的方法，同時拓寬了蒙脫石的應用領域。

3.1na-mmt涂層的形貌與成分分析

3.1.1na-mmt涂層的電鏡形貌及eds分析

az31鎂合金表面及截面的電鏡形貌如圖2所示。圖2.1(a)表明az31鎂合金表面完全覆蓋一層較致密的na-mmt涂層，進一步放大10萬倍，見圖2.1(b)，涂層呈現典型的mmt特征性的片層狀結構。2.1(c)(d)為az31鎂合金表面na-mmt涂層的截面圖，涂層比較致密，厚度約為42μm，與基體結合緊密，結構形態與表面一致。

圖3na-mmt涂層的eds元素組成圖，為na-mmt涂層的eds分析，表明涂層中有na、mg、si、o、al等蒙脫石的基本元素，進一步證實鎂合金表面的涂層為na-mmt涂層。

3.1.2na-mmt涂層的xrd分析

圖4為mmt粉末，鎂合金az31基體及其表面na-mmt涂層的xrd圖譜。圖4(c)顯示na-mmt粉末，在衍射角2θ為21.88°和22°處出現了屬于蒙脫石的特征峰；圖4(a)(b)顯示，na-mmt經過水熱處理的鎂合金xrd圖譜在衍射角2θ為21.88°和22°處也出現了屬于蒙脫石的特征峰。結果表明，水熱法成功地在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層。

3.1.3na-mmt涂層的紅外光譜分析

na-mmt粉末及na-mmt涂層的ftir表征，na-mmt粉末和na-mmt涂層紅外光譜圖相似，均有以下吸收帶：在高頻區na-mmt在3620cm^-1附近為羥基鍵al-o-h鍵的伸縮振動；3240cm^-1附近較寬的吸收帶為mmt層間水分子及涂層表面的吸附水的h-o-h鍵的伸縮振動與1644cm^-1附近水分子h-o-h彎曲振動相對應；由于實驗材料用的是na-mmt，1420cm^-1附近有較弱吸收峰；1089cm^-1及1038cm^-1附近為si-o-si及si-o的伸縮振動，是蒙脫石的主要吸收帶；另外在915cm^-1，850cm^-1，694cm^-1處較弱的吸收帶分別為al-oh，mg-oh，si-o-mg的彎曲振動。由此說明，經水熱法在az31鎂合金表面制備的na-mmt涂層與na-mmt粉末骨架一致，只是各個特征峰的強弱有所不同。以上結果表明，通過水熱法可以成功地在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層，沒有破壞蒙脫石的片層結構。

3.2na-mmt涂層形成機理

蒙脫石是2:1型礦物，化學式al2[si4o10](oh)2，基本結構單元就是硅氧四面體和鋁氧八面體，單元結構中的層內al³⁺，si⁴⁺等陽離子被mg²⁺，na⁺等陽離子發生部分置換時，首先會引起單元結構層內正電荷減少，必須有吸附在晶體表面和層間的可交換的陽離子來中和；另外還會引起晶層內部和晶層間的電荷不均勻，使負電荷主要集中在鋁氧八面體上，它居層間的陽離子較遠，吸引力較弱，導致al³⁺，si⁴⁺等陽離子被mg²⁺，na⁺等陽離子發生置換。na-mmt涂層的制備是在堿性環境下，通過水熱法制備，na-mmt及鎂合金在堿性環境下可能發生以下化學反應：

(1)蒙脫石發生水化反應：

al2[si4o10](oh)2+10h2o→2al(oh)3+4si(oh)4

(2)蒙脫石與naoh的反應:

al2[si4o10](oh)2+2na⁺+2oh^-→2naalsi2o6·h2o

(3)鎂合金發生水化反應：

mg+2h2o→mg(oh)2+h2↑

(4)蒙脫石與mg(oh)2的反應：

2al2[si4o10](oh)2+mg²⁺+2oh^-→mg(al2si4o12)·h2o

最終，蒙脫石硅氧四面體表面有活性的oh^-與鎂合金水化反應產生的oh^-，在水熱條件下，脫去h2o，在鎂合金表面形成氧橋，使蒙脫石與鎂合金az31緊密結合，形成na-mmt涂層。

3.3na-mmt涂層的耐蝕性能

選用模擬體液為dmem+10％fbs培養液，相對于當前研究所用較多的hank's液和sbf等，主要成分是無機鹽離子和葡萄糖，而dmem在上述基礎上增加了多種氨基酸，另外血清中含血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素等成分，更貼近人體內環境，以此作為腐蝕介質分析az31基體和na-mmt涂層的抗腐蝕性能，對今后鎂合金的體內植入等應用性研究更有參考價值。

3.3.1na-mmt涂層的電化學分析

利用電化學分析技術對az31鎂合金及na-mmt涂層在體外模擬腐蝕體系中腐蝕速率進行分析，評估其作為體內可吸收降解醫用植入材料的可行性。

3.3.1.1極化曲線

極化曲線反應了電極電位與極化電流或電流密度之間的關系。腐蝕電位(ecoor)的大小反映了材料全面腐蝕反應發生的難易程度：電位越高，耐蝕性越好。腐蝕電流(icorr)大小反映了腐蝕進行的快慢以及腐蝕發生的程度。腐蝕電流越小，則腐蝕速率越小，耐蝕性越好。az31鎂合金基體和na-mmt涂層在dmem+10％fbs培養液中36.5℃時的極化曲線圖表明，az31鎂合金基體的表現最差，腐蝕電位小于na-mmt涂層。表3.1為az31鎂合金及na-mmt涂層的自腐蝕電位，腐蝕電流密度，由表可知，na-mmt涂層的az31鎂合金基體腐蝕電流密度比az31基體提高了2個數量級，腐蝕速度下降明顯。na-mmt涂層可以明顯提高az31鎂合金的耐蝕性。

表3.1az31基體及na-mmt涂層的自腐蝕電位，腐蝕電流密度

3.3.1.2交流阻抗譜測試

通過交流阻抗法(eis)對na-mmt涂層的性耐蝕進行了進一步分析，結果表明，na-mmt涂層在高頻區的容抗弧直徑遠高于az31鎂合金基體，因此其阻抗值na-mmt涂層＞az31，由此表明na-mmt涂層極大地提高了az31鎂合金基體的耐蝕性，能更有效地防止各種離子向鎂合金基體的擴散、滲透，從而降低az31鎂合金基體的腐蝕速率。

3.3.2na-mmt涂層浸泡中的析氫變化

az31鎂合金基體及na-mmt涂層在dmem+10％fbs液體中的析氫速率中可以發現，na-mmt涂層的腐蝕速度明顯低于az31鎂合金基體本身，前24haz31產生氫氣的速度較快，平均析氫率約0.07ml·cm^-2·h^-1，而na-mmt涂層產生氫氣很少，析氫率較為穩定，平均0.01ml·cm^-2·h^-1，可見na-mmt涂層的存在提高了az31鎂合金的抗腐蝕能力。

3.3.3na-mmt涂層浸泡時ph變化

az31鎂合金基體及na-mmt涂層在dmem+10％fbs液體浸泡時ph變化可知，同條件下，az31基體在dmem++10％fbs溶液浸泡前5h，ph升高速度快，然后緩慢升高，浸泡24h后ph升高至8.9左右；而na-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液浸泡后ph緩慢增加，24h后ph升高至7.82。由此可以看出，na-mmt涂層對az31鎂合金基體起到了較好的保護作用，減緩了腐蝕。由于體外模擬實驗是不流動的環境，而體內體液及血液是不斷更新的，因此在模擬體液不流動條件下中ph升高至7.82，推導至體內流動環境，機體是可以通過腎臟、呼吸等調節代償體液的酸堿變化，對機體不會產生太大的影響。

3.4na-mmt涂層腐蝕后形貌及成分分析

3.4.1na-mmt涂層腐蝕后宏觀形貌

圖5為az31鎂合金及na-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液中浸泡后的宏觀形貌。通過az31鎂合金浸泡后宏觀形貌可以發現，az31在dmem+10％fbs溶液中浸泡1d即出現明顯腐蝕，3d出現較淺的腐蝕坑，浸泡20d腐蝕坑明顯加深；na-mmt涂層在dmem+10％fbs溶液中浸泡不同時間后的宏觀形貌，可以看出1d、3d、5d的na-mmt涂層完整，第10d開始出現涂層有小部分脫落，但脫落后露出的az31基體光滑，浸泡20d涂層脫落逐漸加重，涂層脫落后的az31表面粗糙，鎂合金邊緣出現少量腐蝕坑，較淺。

由此可見na-mmt涂層在dmem+10％fbs腐蝕介質中對az31鎂合金起到一定的保護作用，在浸泡初期可以達到減緩腐蝕的目的，但隨著時間的推移，涂層會逐漸脫落，使az31鎂合金暴露在液體中，進而被逐漸腐蝕。分析原因可能與涂層的性能有關，na-mmt具有明顯的溶脹性，隨著在水溶液中浸泡時間的延長，涂層出現溶脹，與az31鎂合金基體結合力下降，所以，在基體邊緣涂層相對薄弱的地方首先開始脫落。

3.4.2na-mmt涂層腐蝕后電鏡形貌及eds分析

圖6為az31鎂合金在dmem+10％fbs培養液中浸泡1d和3d后的電鏡形貌，

圖6(a)(b)為az31鎂合金浸泡1d的形貌，由于鎂合金在dmem+10％fbs溶液中主要發生析氫腐蝕，mg(oh)2等不溶性腐蝕產物生成，局部ph值升高，產物在az31鎂合金表面的堆積，az31鎂合金表面出現點蝕坑及較淺的腐蝕裂紋。由圖6(c)(d)可以看出，隨著浸泡時間增加，腐蝕坑及腐蝕裂紋的深度逐漸加深加大且分布不均勻，浸泡3d后鎂合金表面變成干涸河床狀，腐蝕產物結構疏松，在深坑區域出現部分腐蝕物的脫落。圖6(e)(f)(g)(h)為na-mmt涂層在dmem+10％fbs培養液中腐蝕1d和3d后的形貌，浸泡1d后，表面均勻致密的na-mmt涂層變化不明顯，但結構不再如以前致密；浸泡3d后，na-mmt涂層仍緊密結合在az31基體上，涂層無脫落。由此進一步證實，na-mmt涂層對az31鎂合金基體起到了非常好的保護作用。

圖7為na-mmt涂層腐蝕后3d的eds譜圖分析，圖中顯示c、o元素含量較高，主要因為浸泡實驗在dmem+10％fbs液體中進行，溶液中存在多種氨基酸及少量蛋白質，na-mmt涂層會吸附一部分氨基酸，使鎂合金表面c、o元素含量增高，而na、mg、si、o、al元素的大量存在印證了na-mmt涂層的存在，說明3d后，na-mmt涂層仍然覆蓋在鎂合金表面。

3.4.3腐蝕后xrd

az31鎂合金及na-mmt涂層在dmem+10％fbs培養液中浸泡3d的xrd分析結果中。很明顯，在浸泡3d之后，na-mmt涂層xrd顯示，mmt的特征峰仍然存在，兩種試樣浸泡3d后產生的腐蝕產物主要均為mg(oh)2，其中涂層產生的mg(oh)2量較少，無其它產物形成。由此說明，浸泡3d，na-mmt涂層比az31鎂合金基體耐腐蝕。

3.4.4腐蝕后紅外光譜分析

na-mmt涂層浸泡后ft-ir圖譜中顯示在3620cm^-1附近為羥基鍵al-o-h鍵的伸縮振動、1420cm^-1附近有較弱吸收峰；1089cm^-1及1038cm^-1附近為si-o-si及si-o的伸縮振動，915cm^-1，850cm^-1，694cm^-1處較弱的al-oh，mg-oh，si-o-mg彎曲振動均顯示蒙脫石的特征峰均在，說明涂層仍存在；涂層浸泡后各組紅外圖譜均在1408cm^-1，1366cm^-1處出現弱的coo-的不對稱和對稱吸收帶，可能為na-mmt吸附dmem中的少量氨基酸所致。

3.5na-mmt涂層耐腐蝕機理

通過對na-mmt涂層的性質分析，電化學測試，腐蝕前后形貌及eds分析、xrd、ft-ir等綜合分析，總結na-mmt涂層的耐腐蝕機理如下：

第一，na-mmt涂層的屏障作用，電鏡觀察到na-mmt涂層比較致密，與az31鎂合金表面結合較緊密，厚度達到42μm，能有效防止氯離子等腐蝕性離子的入侵，提高az31鎂合金的耐蝕性。

第二，na-mmt的吸附作用及離子交換作用，氨基酸的活性基團可以通過靜電吸引、疏水作用、共價鍵以及氫鍵等方式與na-mmt發生吸附，通過coo^-與蒙脫石端面正電基團間的靜電作用力吸附氨基酸兩性離子；通過nh³⁺與蒙脫石層間基面氧原子形成氫鍵吸附氨基酸正離子，減少了鎂合金與dmem中的氯離子的吸附，提高az31鎂合金的耐蝕性。

第三，腐蝕產物的保護作用，涂層在浸泡過程中也會有很慢的腐蝕，產生的mg(oh)2沉積在na-mmt涂層表面，成為保護膜的一部分。

本發明通過水熱法成功地在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層，該涂層的性質與na-mmt相同。

(1)na-mmt涂層結構致密，與基體結合緊密，高倍鏡下呈現片層狀結構，na-mmt涂層約42μm厚。形成機理如下：蒙脫石硅氧四面體表面有活性的oh^-與鎂合金水化反應產生的oh^-，在水熱條件下，脫去1分子h2o，在az31鎂合金表面形成氧橋，使na-mmt與az31鎂合金緊密結合，形成na-mmt涂層

(2)az31鎂合金表面na-mmt涂層腐蝕電流密度比az31基體提高了2個數量級，eis圖中半圓直徑遠大于基體，腐蝕速度明顯下降。

(3)az31鎂合金表面na-mmt涂層在dmem+10％fbs培養液中浸泡1d后，電鏡觀察表面均勻致密的na-mmt涂層變化不明顯，但結構不再如以前致密。浸泡3d后，na-mmt涂層仍緊密結合在az31鎂合金基體上，涂層無脫落。xrd、ft-ir也同時印證，由此可見na-mmt涂層延緩了az31鎂合金基體的降解，提高了耐蝕性。

(4)由以上實驗可得出na-mmt涂層的耐腐蝕機理可能為na-mmt涂層的屏障作用、吸附作用及離子交換作用、腐蝕產物的保護作用共同作用的結果。

4、na-mmt涂層的體外血液相容性

當今時代，現代醫學和材料學的發展十分迅猛，生物醫用材料己逐漸在骨外科、口腔科、心血管科等臨床治療中發揮著重要的作用。在各國生物醫用材料分析中，生物學評價是最基本的環節，也是對人體安全性的重要保證。生物相容性是指生物醫用材料應用于生物體內，所產生的宿主反應是可接受的，并能起到有效治療作用，它反映了材料與活體組織或系統相互作用的生物學行為，包括血液相容性、組織相容性。生物醫用材料與血液接觸時，兩者相互作用，血液中的各種成分及功能不可避免會受到影響。但是，具有良好血液相容性的生物醫用材料對血液成分及功能影響較小，不會造成凝血、溶血等損害。本發明在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層，提高了耐蝕性，比較適合骨科固定材料。下面對兩種涂層進行體外溶血實驗、血細胞計數實驗、動態凝血時間實驗、凝血酶原時間、血小板黏附實驗，以考察na-mmt涂層的az31鎂合金的血液相容性；同時，通過測定浸提液中鎂離子濃度、ph、鎂合金及涂層的接觸角等，探討涂層提高az31鎂合金血液相容性的機理，為其在醫學領域的應用提供理論依據。

4.1體外血液相容性

4.1.1溶血實驗

溶血，即紅細胞破裂，血紅蛋白外逸，亦稱為紅細胞溶解。在臨床上，引起溶血的因素很多，可分為內源性因素與外源性因素。其中，內源性因素包括溶血性細菌侵入抗原-抗體反應、各種機械損傷、紅細胞內在(膜、酶)缺陷、藥物作用等；外源性因素主要有低滲溶液、機械強力振蕩、突然低溫冷凍、過酸或過堿等。溶血率實驗是一項常用的檢驗植入材料血液相容性的方法，由于其能敏感的反應材料對紅細胞的影響，所以被公認為是評價長期植入骨、軟組織及血液環境中的生物材料的安全性的指標之一。iso標準規定，如果材料與血液接觸后的溶血率小于5％，則符合溶血率要求；如果材料與血液接觸后溶血率大于5％，則預示著材料有溶血作用。本發明試驗采用體外非直接接觸法-利用和材料充分接觸的浸提液來與新鮮血液接觸，考察由材料釋放出的離子對紅細胞有無溶血作用。

az31鎂合金、na-mmt涂層的血紅蛋白吸光值及溶血率實驗的結果表明；az31的溶血率為41.62％，大于5％，發生了明顯溶血現象；na-mmt涂層的溶血率為4.81％，小于5％，無明顯溶血現象，溶血率達到了生物材料要求的標準。顯然，在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層后明顯提高了az31鎂合金的血液相容性。

4.1.2血細胞計數實驗

血液是由血漿和血細胞組成的流體組織，在心血管系統內循環流動,起著運輸物質的作用，血細胞可分為紅細胞、白細胞和血小板三類，各自執行著相應的功能。生物材料的血液相容性包括對血液成分及功能無明顯影響，即：不會造成紅細胞、白細胞及血小板的明顯減少。本文對az31鎂合金、na-mmt涂層進行體外血細胞計數實驗。結果為三種樣品在血液中浸泡30min后，血小板減少分別為(1.26±0.56×10¹⁰/l、1.71±0.53×10¹⁰/l、)，紅細胞減少分別為(1.15±0.80×10¹¹/l、1.61±0.75×10¹¹/l、)及白細胞減少分別為(0.17±0.02×10⁹/l、0.21±0.08×10⁹/l、)，三種血細胞的數量稍有所下降，但均在正常范圍內。經spss16.0軟件進行方差分析，posthoctests結果為；az31鎂合金、na-mmt涂層在血液中浸泡30min后，三種血細胞減少均無統計學意義(p>0.05)。

綜合來看，az31鎂合金比na-mmt涂層造成的血細胞的減少明顯，但數據經過方差分析兩兩比較均無顯著性意義(p>0.05)。說明三種樣品對血液中紅細胞、白細胞、血小板影響不大，即na-mmt涂層后的az31合金對血細胞無明顯影響。

4.1.3動態凝血時間實驗

體外動態凝血時間實驗常用來檢測內源性凝血因子被激活的程度，以觀察材料對人體血液凝血時間的影響。體外動態凝血時間曲線反映血液在材料表面的凝固趨勢和凝血時間的長短，可以比較各種材料對凝血因子的激活程度,凝血程度越小，材料的血液相容性越好。為了方便比較對不同材料的抗凝血性能，人為地把縱坐標吸光度值為0.100時的時間定義為材料的凝血時間。

從az31鎂合金、na-mmt涂層的動態凝血時間曲線發現，2條曲線隨著與血液接觸時間的增長，材料的od值逐漸減小，最終趨于平緩。在達到0.10吸光值時，az31所用時間較短，時間較長的是na-mmt涂層。na-mmt涂層的曲線經歷時間長，呈緩慢向下傾斜形狀，抗凝血性能均優于az31。綜合而言，na-mmt涂層提高了az31鎂合金的抗凝血性能。

4.1.4血小板黏附實驗

血小板是由紅骨髓中巨核細胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態不規則的小體，生物材料與血液接觸后，表面吸附一定量的纖維蛋白原，同時結構發生變化，血小板會黏附在纖維蛋白原周圍，聚集、釋放大量的凝血活性因子，使凝血酶原轉變為凝血酶，凝血酶會激活新的凝血因子，如此循環發生凝血反應，形成血栓。因此，生物材料表面血小板黏附的數量和激活狀態是血液相容性中抗凝血性能最基本的評價指標之一。血小板黏附愈少，變形越少，則血液相容性愈好。

從eds點掃箭頭所指部位，顯示出有s、c、o等元素成分，結合形貌確定為血小板；從sem圖中可以看到na-mmt涂層表面黏附有很少的血小板，血小板形狀不規則，但都沒有偽足，表明血小板沒有被激活，表現出了良好的抗血小板黏附性能。

4.2血液相容性機理

4.2.1浸提液mg²⁺濃度及ph的影響

本實驗對溶血實驗中材料浸提液中的mg²⁺濃度及ph進行檢測，結果見表4.1。由表4.1可以明顯看出，az31鎂合金在生理鹽水中浸提30min后，mg²⁺濃度為38.23±2.96，是正常人血清mg²⁺濃度的35倍多，na-mmt涂層浸提液中mg²⁺濃度略高于人血清正常值；az31鎂合金出現溶血，溶血率41.6％，而na-mmt涂層未發生溶血，溶血率分別為4.81％，均小于5％。另外，由表4.1可知，az31鎂合金浸提液ph為8.25±0.77，明顯堿化，高于機體可以代償的水平，而na-mmt涂層浸提液中ph無明顯改變，仍在正常人體體液的ph范圍內。

表4.1各組浸提液mg²⁺濃度及ph值

4.2.2接觸角測定

4.2.2.1材料與去離子的接觸角測定

材料的親水性與人體對這種材料的相容性呈正相關，親水性越高，材料的生物相容性越高。由于血液及組織液中主要組成是水，因此材料的接觸角測定采用材料與水的接觸界面進行測定。材料的接觸角測定一定程度上反映了材料親水性，比較az31鎂合金、na-mmt涂層后材料的接觸角，去離子水滴滴到az31鎂合金基體表面，球形水滴較快變成半球形，平均接觸角為60.43±3.38；滴到na-mmt涂層時，球形水滴迅速浸潤，na-mmt涂層后接觸角比az31鎂合金基體減小；接觸角數據見表4.2，na-mmt涂層后接觸角與az31鎂合金進行比較p<0.05，有顯著性意義；由此說明，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層后，提高了材料的親水性能，兩種涂層之間親水性相似，無明顯差別。由此可知，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層，材料的接觸角減小，親水性提高，故血液相容性提高。

表4.2材料的接觸角測定

4.2.3表面張力及界面張力的計算

根據公式：

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

γs＝γs^d+γs^p

可計算得az31、na-mmt涂層及na-mmt涂層的表面張力與界面張力,計算結果見表4.3：

表4.3不同樣品表面張力、各分項值和界面張力

由表4.3可知，az31鎂合金、na-mmt涂層的色散力分量γ^ds相差不明顯，而兩種涂層的極性分量γ^ps均明顯大于az31鎂合金，即na-mmt涂層表面張力高于az31鎂合金。γ^ps是影響材料血液相容性的重要因素，γ^ps的增加提高了材料的潤濕性，另一方面使材料優先吸附白蛋白，改善材料的血液相容性。由表4.3還可看出，na-mmt涂層的界面張力值小于az31基體。即材料的界面能較小，因而na-mmt涂層樣品比az31鎂合金基體具有更優的血液相容性。

如前面所述表面張力是分子色散力和極性力的共同作用的結果。提高樣品表面色散力，能夠提高表面吸附蛋白質層的穩定性，進而提高材料表面的血液相容性。

極性力分量γ^ps/γs是一項生物材料血液相容性的決定性因素，提高極性分量(γ^ps/γs)能夠促進血漿白蛋白在表面的吸附，而色散力分量(γ^ds/γs)越高則會優先吸附纖維蛋白。白蛋白減少與血小板形成復合體，能夠減少凝血現象的發生，而纖維蛋白原在材料表面蛋白吸附和血栓形成方面起著非常重要的作用，它與血小板形成復合體，加速凝血作用，纖維蛋白原轉化為纖維蛋白包裹住血液中的某些成分，導致血栓形成。因此極性力分量越高，材料表面的血液相容性越優。材料與血液之間的界面能較小的時候，材料表面不易于吸附纖維蛋白，且吸附的蛋白層只會產生很少的構象變性，這樣的材料有效抑制血小板的激活、團聚及變形，具有良好的血液相容性。

4.3細胞相容性實驗

將az31和na-mmt涂層的az31合金制成浸提液，進行小鼠成骨細胞mc3t3細胞毒性實驗。結果表明，az31浸提液與陰性對照組相比細胞毒性相對較高，嚴重抑制了mc3t3細胞的增殖活動；na-mmt涂層的az31合金對細胞沒有毒性影響，并且在培養第一天時，na-mmt涂層的az31合金表現出對mc3t3細胞生長的促進作用。

本發明分析了az31鎂合金及在其表面制備的na-mmt涂層對血液中紅細胞、白細胞、血小板等的影響，通過溶血率、血細胞計數、體外動態凝血試驗、血小板黏附試驗評估了涂層的血液相容性，并通過測定材料浸提液中mg²⁺濃度、ph值及材料的接觸角分析溶血及血小板黏附試驗的機理，通過細胞培養實驗評估涂層對細胞生長的影響，得出以下結論：

(1)az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層后溶血率明顯下降，均低于5％，達到醫用生物材料對血液溶血率的要求，生物相容性提高，即na-mmt涂層提高了鎂合金植入體內的生物安全性。

(2)通過接觸角測定表明在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層后材料的接觸角明顯減小，親水性增加，是涂層提高了鎂合金血液相容性的機理。

(3)細胞培養實驗證明na-mmt涂層，對mc3t3細胞細胞無毒性作用，還能促進mc3t3細胞的增殖。

5、結論

本發明以ca-mmt為原料，采用離子交換法，制備na-mmt；然后，利用水熱法，在az31鎂合金表面制備na-mmt涂層；分析了涂層的結構、組成、形成機理及在dmem+10％fbs溶液中的降解行為和耐腐蝕機理；采用測定溶血率、動態凝血時間，血小板粘附實驗、接觸角計算等研究na-mmt涂層的血液相容性；通過細胞培養實驗，分析na-mmt涂層的細胞相容性，得出以下結論：

(1)以陽離子交換容為指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化na-mmt制備工藝條件。最終的優化工藝為：氟化鈉為4mmol，溫度為80℃，時間為4.5h，陽離子交換容達到112mg/g。由此工藝獲得的na-mmt電鏡下呈不規則狀，很少聚集。

(2)利用水熱法，將na-mmt成功負載到az31鎂合金表面。na-mmt涂層耐蝕能力較好，延緩了az31鎂合金在模擬體液中的降解。

(3)az31鎂合金表面的na-mmt涂層具有較好的血液相容性，同時促進骨細胞增殖。分析其機理可能與涂層降低了az31鎂合金表面的接觸角，使其表面張力下降有關。

綜上所述，利用ca-mmt制備na-mmt，將na-mmt成功負載到az31鎂合金表面，na-mmt涂層延緩了鎂合金基體的降解，提高了鎂合金的血液相容性，同時促進骨細胞的增殖。由此推斷，具有na-mmt涂層的az31鎂合金有望成為較好的功能性醫用植入材料。

本發明利用水熱法，在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層，系統地分析了涂層的形成機理、結構形貌、在模擬提液中的降解及耐蝕性機理，認為na-mmt涂層有效地控制了鎂合金的降解，此方面研究尚未見報道。

本發明利用水熱法，在az31鎂合金表面制備了na-mmt涂層，在耐蝕性實驗及血液相容性研究的基礎上，首次對az31鎂合金表面na-mmt涂層進行細胞相容性進行分析，認為制備的na-mmt涂層具有較好促進骨細胞生長的能力。

本發明首次系統地分析na-mmt的體外血液相容性及細胞相容性，分析了na-mmt涂層降低az31鎂合金溶血率的機理，為mmt應用到鎂合金表面后制備醫用植入材料，評價其生物安全性提供依據。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。