冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途的制作方法

本發明涉及醫藥和細胞生物學技術領域，特別涉及冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途。

背景技術：

心血管疾病是全球公共衛生的重大問題，據統計，2014年中國心血管病死亡率仍居各種疾病之首，高于腫瘤及其他疾病；隨著診療水平提高，加上人口老齡化及國民心血管危險因素的普遍暴露，我國心血管病帶病生存人群數量增加，心血管病負擔持續快速加重，而現存心血管疾病的藥物或介入治療各有其弊端，亟待尋求新型防治心血管疾病的藥物。

臨床和基礎研究均證實，心血管疾病進展中，心肌重構是心功能由代償向失代償演變，最終發生心力衰竭的基礎與核心機制。心肌重構(cardiacremodeling，cr)，是心臟為適應長期存在的損傷因素而做出的慢性代償性改變。重構心肌從組織形態到功能代謝等均呈現異常，主要表現為：形態功能上，室壁厚度增加、僵硬且運動不協調，心泵功能減弱；細胞水平上，心肌細胞肥大、排列紊亂、核質比增加，細胞外基質中膠原過度沉積，間質纖維化；分子水平上，胚胎基因重新啟動轉錄，代謝相關通路蛋白表達與磷酸化修飾水平改變。已有多組學的研究和動物實驗證實，蛋白激酶b(pkb，又稱akt)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mtor)和糖原合成酶激酶-3β(gsk3β)等多個基因及其上下游通路與心肌重構發生發展有密切聯系。目前臨床應用的抗心肌重構藥物多作用于降低交感神經興奮性、抑制腎素-血管緊張素系統激活，但均不能完全阻斷壓力或神經體液負荷下的心肌重構。

冬凌草甲素(oridonin,ori)，是從冬凌草等唇形科植物中提取出的天然二萜類化合物，其生物利用度高、性質穩定，有多種較便捷的提取方法，具有臨床使用的潛在價值。目前關于冬凌草甲素的研究集中于其對多種腫瘤細胞的抗增殖和促凋亡作用：有防治胃癌的研究證實，冬凌草甲素通過細胞周期蛋白p53和半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)途徑，發揮抗癌作用；有研究將冬凌草甲素應用于前列腺癌，發現其作用于天然免疫相關的信號通路，對前列腺癌起保護作用；bu等人在胰腺癌細胞相關研究中報道了冬凌草甲素通過絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(mapk)通路介導caspase激活，促進癌細胞凋亡。心肌細胞作為終末分化細胞，其細胞周期、代謝模式、信號轉導通路與腫瘤細胞有很大區別，目前尚未有冬凌草甲素用于心肌重構藥物的研究。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途，抑制壓力過負荷引起的心肌細胞肥大、心肌間質纖維化，具有抗心肌重構效果顯著、心臟毒性小等優點。

本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：

冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途。冬凌草甲素的分子式c20h28o6，分子量364.44，結構如式1所示。

進一步地，冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途中，冬凌草甲素應用于心肌細胞的安全劑量范圍以對心肌細胞沒有明顯細胞毒性作用為原則。優選地，冬凌草甲素加入體外培養的心肌細胞的培養液中，抑制刺激條件下心肌細胞的肥大，所述的冬凌草甲素的藥物濃度在5-50μm為安全劑量范圍。

進一步地，冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途中，冬凌草甲素在小鼠中的應用量按20-50mg/kg體重量灌胃給藥。

本發明公開了冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途，后續具體實施例方式中主要以野生型c57小鼠為實驗對象，通過主動脈縮窄術建立心肌重構模型，冬凌草甲素灌胃給藥進行干預，來驗證冬凌草甲素在治療心肌重構中的用途。結果證實，中藥提取物冬凌草甲素可以抑制壓力負荷誘導的心肌肥大和心肌纖維化：與c57小鼠不加藥相比，冬凌草甲素給藥組小鼠心重/體重比下降，心肌肥大標志物轉錄水平降低；間質膠原纖維沉積減少；心功能損傷程度減輕；心肌重構相關的akt/mtor通路蛋白磷酸化水平下降。因此，冬凌草甲素可對心肌重構起保護作用，可用于制備防治心肌重構的藥物。

在此基礎上，本發明還提供一種抗心肌重構藥物，其包含冬凌草甲素，可以為僅含冬凌草甲的單一組分藥物，也可以為含冬凌草甲素的藥物組合物。其中，含冬凌草甲素的藥物組合物包括冬凌草甲素，以及與冬凌草甲素同時施用后對治療心肌重構有積極作用的藥物成分和/或使冬凌草甲素穩定性提高的藥學上可接受的成分和/或制藥學上可接受的輔助成分。

進一步地，本發明所提供的抗心肌重構藥物，其劑型可以為粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、溶液、懸浮液或注射液等。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

1、本發明提出冬凌草甲素可減輕心肌重構，對心肌重構起保護作用，防止心功能惡化，并為心肌重構的防治提供更多有靶點針對性的治療藥物提供了可能。

2、本發明提供了冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的新的藥用用途，冬凌草甲素可以抑制或者延緩壓力負荷引起的心肌細胞肥大、心肌間質纖維化，具有抗心肌重構效果顯著、用藥量少、心臟毒性小等優點。

附圖說明

圖1是實施例1中不加藥對照組和②-⑥組減去相應空白對照后的細胞活力檢測結果，即應用細胞計數試劑盒檢測細胞活力，測得產物450nm吸光度值，計算得到存活細胞百分比。

圖2是實施例2中離體心肌細胞肥大結果。其中，a、b分別為免疫熒光圖和細胞面積圖；c為細胞肥大標志物anp、bnp、β-mhc轉錄水平圖。

圖3是實施例3中在體心肌肥厚結果。c57小鼠行主動脈弓縮窄手術(ab手術)或假手術組(sham)，灌胃給予冬凌草甲素溶液或0.1％dmso生理鹽水后，心臟大體形態拍照(圖3a)、he染色拍照(圖3b)、心肌細胞橫截面積統計(圖3c)；心重/體重比(hw/bw)、肺重/體重比(lw/bw)及心重/脛骨長度比(hw/tl)統計(圖3d)；心肌肥厚標志物anp、bnp、β-mhc轉錄水平統計(圖3e)。

圖4是實施例4中在體心肌纖維化結果。c57小鼠行主動脈弓縮窄手術(ab手術)或假手術，灌胃給予冬凌草甲素溶液或0.1％dmso生理鹽水后，心臟psr染色拍照(圖4a)、心肌間質膠原容積分數統計(圖4b)，纖維膠原分泌標志物collageniα、collageniiiα和ctgf轉錄水平統計(圖4c)。

圖5是實施例5中心功能檢測結果。c57小鼠行主動脈弓縮窄手術(ab手術)或假手術，灌胃給予冬凌草甲素溶液或0.1％dmso生理鹽水后，左心室舒張期內徑、收縮期內徑、左室射血分數、短軸縮短率統計。

圖6是實施例6中akt信號通路westernblot檢測圖和熒光數值統計。

具體實施方式

為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明不僅僅局限于下面的實施例。

下述實施例中，體外心肌細胞培養、動物飼養、藥物來源、配置、給藥方式具體采用如下方式，但是并僅限于下述方式。

體外心肌細胞培養：離體實驗選用原代sd乳鼠心肌細胞，胰酶(gibco25200)消化貼壁后，用含有15％胎牛血清(fbs,hyclonesv30087)的dmem/f-12培養基(gibco11330)培養于37℃，5％二氧化碳培養箱。

動物飼養：在體實驗選用8-10周齡、體重在23.5-27.5g，雄性c57bl/6小鼠(購自北京華阜康生物科技有限公司)(簡稱c57小鼠)，飼養于武漢大學心血管病研究所實驗動物中心。飼養環境spf級，設獨立進回風凈化籠具(individalventilationcages，ivc)，恒溫(22±2℃)恒濕(55±15％)，每12小時明暗交替，每5只小鼠一籠，進食鈷-60照射滅菌標準鼠飼料，飲用高壓滅菌水，小鼠自由進食、水。

藥物來源：藥物冬凌草甲素購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號160427，純度>98％。離體實驗的體外心肌細胞用藥時，冬凌草甲素溶于二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,dmso,sigmad2650)和細胞培養基，配成10mm儲存液，分裝保存于-20℃待用；在體實驗的小鼠用藥時，冬凌草甲素溶液的濃度為5mg/ml，溶于0.1％dmso生理鹽水，現用現配。

藥物配置：離體實驗的體外心肌細胞用藥時，取0.5-5μl的10mm冬凌草甲素儲存液溶于1ml細胞培養基，即藥物冬凌草甲素在其中的終濃度5-50μm，給藥時間24小時。

給藥方式：在體實驗的小鼠灌胃給藥，按40mg/kg體重量給藥，以每只小鼠平均25g體重計算，一次灌胃配置好的冬凌草甲素溶液約為0.2ml×小鼠只數，術后第四天開始給藥，每天一次，持續4周。

實施例1冬凌草甲素對離體心肌細胞毒性檢測

(1)原代心肌細胞培養

出生3天內的sd乳鼠用75％酒精消毒，在超凈工作臺開胸取出心臟，用dmem/f12培養基清洗后剪成1-2mm³的碎片，加入稀釋的胰酶消化液8ml，于磁力攪拌器上水浴加熱、轉速150rpm，消化15分鐘，靜止數秒棄去上含雜質的清液，之后重復消化步驟并吸取心肌細胞消化液，加入預冷的含20％fbs的dmem/f12培養基中，重復消化4-5次，收集好的心肌細胞懸液。

將收集好的心肌細胞懸液以1500rpm離心8分鐘，棄上清液并加入適量培養基重懸細胞，然后經40μm濾網過濾后接種在1-2個100mm的培養皿中進行差時貼壁，90分鐘后吸取未貼壁的心肌細胞懸液過濾，臺盼藍拒染法計數并調整心肌細胞濃度為2.5～3×10⁵個/ml，加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(brdu，終濃度0.1mm)抑制非心肌細胞生長。

將上述培養皿中的心肌細胞接種到96孔板中，每孔100μl含5000個心肌細胞，置37℃，5％二氧化碳培養箱，孵育48小時，pbs清洗并更換培養基。

(2)心肌細胞加藥和計數

本實施例對于上述步驟(1)體外分離、培養了sd乳鼠心肌細胞，細胞培養基中加入冬凌草甲素溶液對該sd乳鼠心肌細胞培養24小時，其中冬凌草甲素在細胞培養基中的藥物最終濃度分別為5μm、20μm、50μm、100μm和200μm，并設置不加藥對照組，并分別設置空白對照組，每組6孔。具體檢測分組設置如下：

①不加藥對照組，即細胞培養基中對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，(記作veh)；

②冬凌草甲素5μm組，即冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為5μm，對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，記作ori5μm；

③冬凌草甲素20μμm組，即冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為20μm，對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，記作ori20μm；

④冬凌草甲素50μm組，即冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為50μm，對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，記作ori50μm；

⑤冬凌草甲素100μm組，即冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為100μm，對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，記作ori100μm；

⑥冬凌草甲素200μm組，即冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為200μm，對sd乳鼠心肌細胞培養24小時，記作ori200μm；

⑦用細胞培養液作空白對照組，依據②-⑥組中冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度，向細胞培養基中加入對應量的冬凌草甲素溶液，培養24小時。

上述各組中每孔加入10微升wst-8法細胞計數試劑(cellcountingkit-8，cck-8，碧云天c0038)，在細胞培養箱內孵育1小時，用酶標儀測定各組450nm吸光度(opticaldensity,od)值，統計各組減去相應的空白對照的od值，設不加藥對照組細胞為全部存活，計算各組細胞存活百分比。結果如圖1所示。

由圖1可知：冬凌草甲素在培養sd乳鼠心肌細胞的細胞培養基中的最終濃度為5μm-50μm時，細胞活力與不加藥對照組相比沒有明顯差異，直至冬凌草甲素的藥物濃度達100μm以上，細胞活性開始下降(圖1)，說明冬凌草甲素100μm以內是其作用于細胞的安全濃度。因此，本實施例通過檢測細胞活力和進行毒性分析，明確了冬凌草甲素應用于心肌細胞的安全劑量范圍5-50μm(*：p＜0.05vscontrol組)。

實施例2冬凌草甲素對離體心肌細胞肥大的影響

心肌重構在細胞水平表現為心肌細胞的體積增大，而細胞體積增大主要源于各種因素造成的肥厚相關基因的轉錄異常。離體乳鼠心肌細胞可一定程度代表在體細胞的病理生理變化；angii是心臟遭受長期過度壓力負荷、腎素-血管緊張素系統激活時的主要神經體液刺激因素。用angii刺激離體心肌細胞可以較好模擬在體心肌重構的過程，用于觀察冬凌草甲素對壓力負荷下心肌細胞重構的保護作用。本實施例具體模擬與證實過程如下：

(1)原代心肌細胞培養

同實施例1，心肌細胞接種到6孔板和置有細胞爬片的24孔板中。

(2)血管緊張素ⅱ刺激心肌細胞和冬凌草甲素給藥干預

依據實施例1所述的藥物安全劑量，原代心肌細胞隨機分為5組，①加pbs不加藥對照組(veh)；②血管緊張素ii刺激組(angii)；③血管緊張素ii加冬凌草甲素5μm組(angii+ori5μm)；④血管緊張素ii加冬凌草甲素20μm組(angii+ori20μm)；⑤血管緊張素ii加冬凌草甲素50μm組(angii+ori50μm)。上述5組，孵育24小時，其中，涉及到血管緊張素ii的，均采用1μm血管緊張素ii(angiotensinii,angⅱ,sigmaa9525)刺激；加pbs不加藥對照組加入相應量的pbs緩沖液而不添加冬凌草甲素；涉及到添加冬凌草素的，需添加冬凌草甲素儲存液至冬凌草甲素的濃度分別為5μm、20μm、50μm。

(3)心肌細胞免疫熒光染色觀察細胞面積

經過步驟(1、2)處理所得的細胞爬片用pbs清洗后多聚甲醛固定，pbs漂洗并用0.5％tritonx-100通透；3％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)室溫封閉；3％bsa稀釋anti-α-actinin(millipore05-384)一抗并滴加于爬片，4℃孵育過夜；pbs稀釋alexa568goatanti-mouseigg二抗并滴加于爬片，室溫避光孵育45分鐘；漂洗后dapi封片；正置熒光顯微鏡下觀察，拍照，并統計分析細胞面積。結果如圖2a、圖2b所示。

通過在熒光顯微鏡下觀察，由圖2a、圖2b可知：血管緊張素ⅱ刺激24h后的心肌細胞面積明顯大于pbs組，心肌細胞明顯肥大，而加入冬凌草甲素的心肌細胞肥大則顯著減小，細胞增大受到抑制，細胞面積減小；心肌細胞所處環境中，冬凌草甲素的濃度為20μm時，對細胞肥大的抑制程度大于5μm，而當培養基中冬凌草甲素濃度增至50μm，對心肌肥大的抑制作用未見進一步增加(*：p＜0.05vspbs組，#：p＜0.05vsangⅱ組，**：劑量間差異p＜0.05)。這說明對于心肌細胞而言，其培養環境中冬凌草甲素5μm的濃度即可對壓力過負荷時，內分泌體液因素造成的心肌細胞肥大產生有效抑制作用；其抑制作用在5μm-20μm劑量范圍內呈現一定的濃度依賴效應。

(4)實時定量pcr檢測心肌細胞肥厚標志物

經過步驟(1、2)處理所得的心肌細胞提取總rna，逆轉錄為cdna，用實時定量pcr(realtimepcr,rt-pcr)儀(rochelightcycler480ii)檢測心肌細胞中心房鈉尿肽(atrialnatriureticpeptide,anp)、腦型鈉尿肽(brainnatriureticpeptide,bnp)和β型肌球蛋白重鏈(β-myosinheavychain,β-mhc)的mrna水平。所用引物如下：

如圖3c所示，相對于血管緊張素ii刺激組(angii)，加入冬凌草甲素的組中，angⅱ刺激造成的心肌細胞anp、bnp、β-mhc轉錄升高受到抑制，細胞肥大標志物anp、bnp、β-mhc轉錄水平下降(*：p＜0.05vspbs組，#：p＜0.05vsangⅱ組，**：劑量間差異p＜0.05)；培養環境中冬凌草甲素的濃度為20μm時，對肥厚標志物anp、bnp的抑制程度大于5μm，說明培養環境中冬凌草甲素濃度為5μm足以在轉錄水平抑制心肌肥厚的發生發展，即對致重構刺激下的離體心肌細胞發揮了較好的保護作用，且在5μm-20μm劑量范圍內呈現一定的濃度依賴效應，為進一步在體實驗藥物作用提供了基礎。

實施例3在體應用冬凌草甲素對壓力過負荷造成的心肌肥厚的影響

(1)小鼠壓力過負荷心肌重構模型的建立和冬凌草甲素給藥

以胸主動脈縮窄術，建立壓力負荷誘導心肌重構模型。將8-10周齡、體重在23.5-27.5g，雄性c57小鼠納入實驗，隨機分為4組，每組10-12只小鼠，具體如下：

①假手術不加藥組(shamveh)，

②假手術冬凌草甲素給藥組(shamori)；

③ab手術不加藥組(abveh)，

④ab手術冬凌草甲素給藥組(abori)。

其中，ab手術組(包括ab手術不加藥組、ab手術冬凌草甲素給藥組)中，小鼠麻醉、備皮、行無創氣管插管并連接呼吸機，右側臥位固定，沿第2-3肋間水平開胸游離胸主動脈，將7-0手術縫線穿過主動脈下方，將去尖的27號針頭平行于主動脈置于縫線上，連同主動脈和針頭一起牢固結扎，然后立即抽出針頭，造成主動脈70％狹窄后抽出胸腔氣體關胸；假手術組(包括假手術不加藥組、假手術冬凌草甲素給藥組)只掛線不結扎。術后觀察小鼠及時蘇醒、基本生命體征、進食和活動狀況正常。

術后第四天起，分別向假手術組和ab手術組中的冬凌草甲素給藥組小鼠灌胃給冬凌草甲素溶液，冬凌草甲素溶液濃度為5mg/ml，以0.1％dmso生理鹽水溶適量冬凌草甲素粉末；小鼠稱重，按40mg/kg體重量給藥，每只小鼠灌胃冬凌草甲素灌胃液約0.2毫升，每天灌胃給藥一次，持續給藥4周；術后第四天起，分別向假手術組和ab手術組中的不加藥組小鼠灌等量0.1％dmso生理鹽水，每天灌胃一次，持續4周。

(2)小鼠心臟取材，組織形態水平評價小鼠心肌肥厚

首先，4周后，假手術組、ab手術組的小鼠稱量體重后處死取心臟，擠血后稱心臟重量(mg)；剪下完整肺臟除去液體，稱量肺重量(mg)；暴露一側脛骨的兩端，測量脛骨長度(cm)。

其次，取小鼠心臟置于體積分數10％甲醛中固定48小時，拍大體照片；修剪心臟并置于包埋框中脫水處理、透明、浸蠟包埋，制作病理切片并烘烤備用。

蘇木素-伊紅(he)染色檢測細胞面積：切片在二甲苯中脫蠟，100％-70％梯度酒精水合，水洗后染蘇木素染液(珠海貝索，ba-4041)，1％鹽酸酒精分色，scott液藍化，染伊紅染液(珠海貝索，ba-4024)，蒸餾水洗去浮色，70％-100％梯度酒精脫水，二甲苯透明后立即封片，通風櫥內吹干后顯微鏡拍照。he染色拍照圖統計細胞橫截面積：每張圖片選擇6個以上邊界清楚、核大致位于中央的細胞，用image-proplus6.0軟件計算細胞面積。

如圖3所示，c57小鼠行主動脈弓縮窄手術(ab手術組)或假手術組，灌胃給予冬凌草甲素溶液或0.1％dmso生理鹽水后，心臟大體形態拍照(圖3a)、he染色拍照(圖3b)、心肌細胞橫截面積統計(圖3c)；心重/體重比(hw/bw)、肺重/體重比(lw/bw)及心重/脛骨長度比(hw/tl)統計(圖3d)；心肌肥厚標志物anp、bnp、β-mhc轉錄水平統計(圖3e)。

由圖3可知：與心臟大體形態拍照所見(圖3a)相似，he染色拍照可見，假手術給藥組的心肌細胞與假手術未給藥組相比，細胞面積和形態無明顯變化。ab手術組中的不加藥組心肌細胞橫截面積明顯增大，而冬凌草甲素給藥組的心肌細胞肥大程度減輕；且ab手術組中的不加藥組肌絲排列紊亂、松散，心肌細胞形態不規整，胞核增大，核仁模糊，冬凌草甲素給藥組的心肌細胞排列較不加藥組整齊、致密，形態較完整，胞核及核仁結構未明顯改變(圖3b)。心肌細胞面積統計結果統計學差異顯著(*：p＜0.05vsveh組，#：p＜0.05vsab組)(圖3c)，證實冬凌草甲素給藥能夠明顯降低ab術造成的細胞層面的心肌肥厚。

統計各組小鼠心重/體重比(hw/bw)、肺重/體重比(lw/bw)和心重/脛骨長度比(hw/tl)，結果如圖3d所示，假手術組中給藥組與未加藥組相比，上述指標無明顯變化，而ab手術組中給藥組比未加藥組相比，心重、肺重降低(*：p＜0.05vsveh組，#：p＜0.05vsab組)，證實冬凌草甲素給藥能夠明顯降低ab術造成的心重增加。

(3)小鼠心肌肥厚標志物轉錄檢測

小鼠心臟組織研磨提取總rna，逆轉錄為cdna，同前，用實時定量pcr檢測小鼠心臟中anp、bnp和β-mhc的mrna水平。所用引物如下：

如圖3e所示，ab手術組中，不加藥組造成anp、bnp、β-mhc轉錄水平均明顯升高，而冬凌草甲素給藥組中，上述肥厚標志物的轉錄受到不同程度的抑制。

心肌重構在大體形態上多表現為心臟體積的增大，左心室重量增加，左心室壁厚度增加；心肌細胞是終末分化細胞，不進行有絲分裂增殖數量，在各種生理或病理性促增殖刺激或損傷下，主要發生細胞肥大：心肌細胞體積增大、肌節數量增多、排列紊亂；小鼠的胸主動脈結扎術是國際上常用的研究心肌重構的在體動物模型。在長期過當壓力負荷刺激下，心肌從大體組織形態到細胞發生上述惡化改變，而冬凌草甲素灌胃可以改善組織病理水平和基因轉錄水平的心肌重構。

實施例4在體應用冬凌草甲素對ab手術造成的心臟纖維化的影響

(1)小鼠壓力過負荷心肌重構模型的建立和冬凌草甲素給藥

同實施例3。

(2)小鼠心臟取材和組織形態水平評價小鼠心臟纖維化

小鼠心臟取材同實施例3。

天狼星紅(psr)染色檢測膠原容積分數：小鼠心臟取材、固定、脫水、包埋、切片后，二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，0.2％磷鉬酸處理后用0.1％天狼猩紅苦味酸溶液染色90分鐘，0.01n鹽酸4次，梯度酒精脫水，二甲苯透明后立即封片，通風櫥內吹干后顯微鏡拍照。psr染色拍照圖統計(image-proplus6.0軟件)，計算膠原容積分數＝膠原面積/(總面積-空白面積)×100％。

如圖4a、b所示，ab手術組中，不加藥的小鼠心肌間質膠原含量增加，血管周圍膠原增加更明顯，且膠原增粗，排列紊亂；而冬凌草甲素給藥組中，冬凌草甲素抑制壓力過負荷造成的心肌間質膠原沉積與分泌(*：p＜0.05vsveh組，#：p＜0.05vsab組)，間質和血管周纖維染色面積均減少。

(3)小鼠心臟纖維化標志物轉錄檢測

同實施例3，用實時定量pcr檢測小鼠心臟中一型膠原(collageniα)、三型膠原(collageniii)和結締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor,ctgf)的mrna水平。所用引物如下：

如圖4c所示，ab手術組中，冬凌草甲素給藥后，成纖維細胞的增殖標志ctgf和分泌型膠原collageniα、collageniii的轉錄均被冬凌草甲素抑制；與不加藥相比，冬凌草甲素抑制壓力過負荷造成的心臟成纖維細胞過度增殖與膠原沉積。

心臟組織主要由心肌細胞和間質組成，在損傷或病理生理刺激下，除發生細胞肥大，還出現間質纖維化。發生纖維化的心臟間質中，成纖維細胞增殖并轉化，膠原分泌增加，各型膠原比例平衡失調，膠原沉積降解失平衡，最終膠原纖維過度沉積、密度增加。苦味酸-天狼猩紅染色可在組織形態學上進行纖維化評價；rt-pcr對纖維化標志物和分泌型膠原的轉錄進行檢測。

實施例5在體應用冬凌草甲素對心功能的影響

(1)小鼠壓力負荷心肌重構模型的建立和冬凌草甲素給藥

同實施例3。

(2)超聲心動圖檢測心功能

設置高頻超聲診斷儀(天津成信公司)參數；小鼠稱重并記錄，心前區備皮，固定于麻醉面罩，以1.5％-2.5％異氟烷吸入麻醉，取左側臥位，心前區均勻涂抹超聲耦合劑，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、左室射血分數及短軸縮短率等。

上述檢測結果經統計分析得出，如圖5所示，ab手術組中，冬凌草甲素用藥后，左心室舒張期內徑、收縮期內徑的增大不及ab手術組中的不加藥明顯，左室射血分數在給藥組有一定程度保留、短軸縮短率下降不明顯。結果表明，與ab手術組中的不加藥相比，冬凌草甲素抑制壓力負荷造成的左室內徑增大，維持左室射血分數水平，維持短軸縮短率(*：p＜0.05vsveh組，#：p＜0.05vsab組)。

壓力負荷造成的心肌重構發生發展中，左心室重量增加，左心室壁厚度增加，心肌細胞排列紊亂，心室壁僵硬且運動不協調。在超聲心動圖檢測中，可見左室舒張期、收縮期內徑均增大，反映左心輸出功能的左室射血分數、短軸縮短率下降。因此，本實施例證實冬凌草甲素用藥后，心肌肥厚改善、心功能得以一定程度保留。

實施例6在體應用冬凌草甲素對akt激酶相關通路的影響

(1)小鼠壓力負荷誘導心肌重構模型的建立和冬凌草甲素給藥

同實施例3。

(2)免疫印跡法檢測心肌重構相關通路蛋白表達

小鼠心臟組織研磨提取總蛋白，bca(thermo23227)法蛋白定量，sds-page-westernblot免疫印跡法檢測akt信號通路磷酸化蛋白和總蛋白表達量。所用一抗抗體如下(“p-”表示磷酸化蛋白，“t-”表示總蛋白)：

結果如圖6所示，可知：ab手術組中，akt/mtor信號通路蛋白磷酸化激活；冬凌草甲素用藥后，介導心肌重構的蛋白akt及其下游gsk3β、mtor的蛋白磷酸化水平下降，mtor下游的重構相關蛋白p70s6k、eif-4e蛋白磷酸化水平下降(“p-”表示磷酸化蛋白，“t-”表示總蛋白；*：p＜0.05vsveh組，#：p＜0.05vsab組)。上述總蛋白的水平在各組間無明顯差異。也就是說，主動脈弓縮窄手術顯著促進akt/mtor、gsk3β、p70s6k、eif-4e信號通路，冬凌草甲素給藥后抑制akt/mtor、gsk3β、p70s6k、eif-4e信號通路。

akt是和細胞增殖與凋亡密切相關的調節因子，可受多個位點磷酸化修飾的調控，活化的akt進一步通過磷酸化作用激活其下游底物如gsk3β和mtor；mtor可對生長因子、胰島素、腎上腺素、血管緊張素等多種細胞外刺激產生應答，進而通過磷酸化蛋白翻譯過程中的某些調節因子，參與多項細胞功能：其中研究比較集中的是p70s6k和eif-4e，它們通過控制細胞生長、增殖以及代謝相關的蛋白的轉錄翻譯與修飾，導致心肌代謝障礙、肥厚性生長直至功能惡化。

由以上實施例可知，冬凌草甲素應用于心肌細胞有較大的安全劑量范圍，在體和離體應用冬凌草甲素可顯著抑制心肌肥厚，冬凌草甲素能防治心臟纖維化發生發展，保護心功能，冬凌草甲素對心肌重構的保護是通過akt/mtor信號通路發揮作用。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

＜110＞武漢大學

＜120＞冬凌草甲素在制備抗心肌重構藥物中的用途

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