本發明屬于復合生物材料制備領域，具體涉及一種多巴結構修飾絲素蛋白組織修復材料的制備方法。
背景技術：
生物材料發展至今已經經歷了三個主要階段。自20世紀80年代以來，以醫療、保健及增進生活質量等為目的的生物醫用材料取得了快速的發展，已經有超過50種植入器械被應用于臨床，一般來源于技術成熟的工程材料，并且具有生物相容性和缺損組織替代功能，例如已廣泛應用于臨床的心人工血管、人工關節和人工腎等。上述生物醫用材料，具有一個普遍的共性:生物惰性。即生物醫用材料發展所遵循的原則是盡量將受體對植入器械的異物反應降到最低。從上世紀80年代到90年代，生物醫用材料領域的重點逐漸由生物惰性轉向生物活性和可控降解性，開發了第二代生物醫用材料及產品。
20世紀90年代后期，第三代生物材料是伴隨著組織工程學的建立、發展而迅速發展起來的。以組織工程生物材料支架為代表，其綜合了工程科學和生命科學原理，為種子細胞提供了適合其生長、基質合成及發揮其他功能的生物學空間，克服了以往單一的細胞移植中細胞不易成活、基質合成能力低下等缺點，為組織工程化組織的構建提供了細胞載體和結構支架。這類生物醫用材料將生物活性材料與可降解材料這兩個獨立的概念結合起來，在可降解材料上進行分子修飾，引起細胞整合素的相互作用，誘導細胞增殖、分化，以及細胞外基質的合成與組裝。但目前所應用于組織工程的生物材料的性能還有待進一步提高，不能滿足現代醫藥的需求。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種多巴結構修飾絲素蛋白組織修復材料的制備方法，進一步提高了組織修復材料的細胞粘附性及生物活性。
本發明采用以下技術方案：
一種多巴結構修飾絲素蛋白組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟二：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時后，將溶液置于透析袋中，放入盛有超純水的燒杯中，并置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟三：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟四：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟五：將2l去離子水燒熱至沸騰，加入4g碳酸鈉及5g家蠶生絲，煮沸30min后，用去離子水清洗干凈并烘干，再用9.3mol/l的libr溶液溶解蠶絲，溶解濃度20wt％，待完全溶解后將溶液裝入透析袋，去離子水透析72h，9000r/min離心20min，重復兩次，得絲素蛋白溶液；
步驟六：將絲素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然風干后獲得絲素蛋白膜，將絲素蛋白膜溶于質量濃度98％甲酸中，然后裝入注射器中進行靜電紡絲，得絲素蛋白納米纖維膜；
步驟七：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂與絲素蛋白納米纖維膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次，即得組織修復材料。
優選的，步驟二中所述的透析袋殘留分子量為10000da。
優選的，所述的步驟二中超純水用量為漫過透析袋。
優選的，步驟五中靜電紡絲的紡絲參數為：紡絲針頭內徑0.9mm，紡絲電壓在10-15kv，距離在8-15cm，速度為0.1-o.5m/h。
優選的，步驟六中噴涂的厚度為5-30nm。
本發明的有益效果在于：
1)多巴胺是神經激素中的一種化合物，含有豐富的乙氨基和兒茶酚活性官能團，幾乎能粘附在任何機體的表面，尤其對于有機表面效果更佳。多巴胺修飾后的明膠的黏附性較高，且在材料表面上形成了聚合的多巴胺-明膠層。多巴胺的修飾，不僅提高了固定的明膠的含量，同時促進了細胞的粘附，加強了材料表面的細胞相容性。
2)明膠分子結構上含有大量的羥基及少量的羧基和氨基，具有極強的親水性。因此，明膠分子中的羧基可以與多巴胺的氨基發生縮合反應。明膠具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可降解性以及生物活性。
3)絲素蛋白生物相容性良好，降解速度緩慢、且降解產物對組織具有低免疫原性，對皮膚、牙周等組織有營養和修復能力，絲素蛋白作為支架材料，為細胞生長、代謝提供場所，為形成新組織提供適宜的環境，此外還能調控和誘導的分化，形成新的具有功能性的組織和器官。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1
一種多巴結構修飾絲素蛋白組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟二：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時后，將溶液置于透析袋中，所述的透析袋殘留分子量為10000da，將透析袋放入盛有超純水的燒杯中，超純水用量為漫過透析袋位置，并將燒杯置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟三：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟四：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟五：將2l去離子水燒熱至沸騰，加入4g碳酸鈉及5g家蠶生絲，煮沸30min后，用去離子水清洗干凈并烘干，再用9.3mol/l的libr溶液溶解蠶絲，溶解濃度20wt％，待完全溶解后將溶液裝入透析袋，去離子水透析72h，9000r/min離心20min，重復兩次，得絲素蛋白溶液；
步驟六：將絲素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然風干后獲得絲素蛋白膜，將絲素蛋白膜溶于質量濃度98％甲酸中，然后裝入注射器中進行靜電紡絲，得絲素蛋白納米纖維膜；
步驟七：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂與絲素蛋白納米纖維膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次，即得組織修復材料。
細胞粘附實驗：取培養的huvec細胞，消化，細胞計數，以5×103cell/ml密度接種在實施例1制得的組織修復材料及空白對照組絲素蛋白材料上，每孔1ml，接種0.5h、1h、2h后，用無菌的pbs溶液漂洗，鏡下觀察并照相計數，結果見下表1。可以看出經過多巴胺修飾后的絲素蛋白組織修復材料所粘附的細胞數量明顯多于沒有經過修飾的空白對照組的細胞數量。
表1
細胞增殖實驗：取培養的huvec細胞，消化，細胞計數，以5×103cell/ml密度接種在實施例1制得的組織修復材料及空白對照組絲素蛋白材料上，每孔1ml，隔兩天換液，接種5day后，細胞計數試劑盒wst-8檢測材料表面的細胞活性，結果見表2，可以得出經過多巴胺修飾后的絲素蛋白組織修復材料的細胞活性略高于空白實驗組的細胞活性。
表2