水鬼蕉新堿A在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法

本申請為申請號201510868700.7、申請日2015年12月01日、發明名稱“一種新化合物及其應用”的分案申請。

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種從植物水鬼蕉鱗莖中分離得到新的生物堿類化合物的應用。

背景技術：

水鬼蕉(hymenocallislittoralis)，又名美洲蜘蛛蘭，為多年生鱗莖草本植物。有如螯蟹腿、蜘蛛腳，故有"螯蟹花"、"水鬼蕉"的名稱。花為白色，有香氣。花期夏秋，蒴果卵圓形或環形，肉質狀，成熟時裂開。種子為海綿質狀，綠色。水鬼蕉原產美洲熱帶地區，西印度群島。中國福建、廣東、廣西、云南等地區引種栽培。在具備觀賞價值的同時，也具備一定的藥用價值，其鱗莖可以入藥，臨床用于舒筋活血，消腫止痛。用于風濕關節痛，甲溝炎，跌打腫痛，癰疽，痔瘡等。研究發現，其鱗莖中含有豐富的生物堿類化合物。

根據報道，主要以水鬼蕉的鱗莖作為研究對象，水鬼蕉鱗莖中主要含有生物堿、黃酮類化合物，研究表明生物堿具有很好的抗腫瘤、抗炎活性。

我們對采集自廣西的水鬼蕉進行了系統的化學成分研究，以期明確其化學成分，為天然藥物化學研究積累資料；發現具有良好活性的天然產物，為后續深入的研究開發提供物質基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種新的化合物及其在制備抗炎、抗腫瘤藥物中的應用。

本發明是從水鬼蕉(生長于中國廣西貴港)鱗莖中提取分離得到的一種新的生物堿類化合物，命名為水鬼蕉新堿a其化學結構式(ⅰ)如下：

本發明的化合物的制備原料資源豐富，提取分離技術難度小，溶劑可回收使用，生產成本低。

上述化合物的制備方法如下：

(1)提取：將水鬼蕉的鱗莖切碎，陰干，用濃度為1％的氫氧化鈉浸泡堿化，堿化時間為1小時，然后取出水鬼蕉鱗莖晾干，用二氯甲烷溫浸法提取3次，每次2小時；合并提取液，對提取液減壓濃縮成浸膏。

(2)分離：將上述浸膏應用硅膠柱層析，以體積比為15:1-3:1的氯仿-甲醇系統梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含有新化合物的流分，再經ods反相柱層析，以體積比為3:7-5:5的甲醇-水進行洗脫，最后經c18反相柱層析制備液相制備，以體積比為4:6的甲醇-水進行洗脫，得到新化合物水鬼蕉新堿a。

本發明的新化合物水鬼蕉新堿a，黃色無定形粉末，hr-esi-ms在m/z298.1070處給出[m+h]⁺峰，在m/z617.1861處給出[2m+na]⁺峰，推算其分子式為c17h15no4，¹h和¹³c核磁共振數據如表1所示。

經實驗研究表明，本發明的化合物對腫瘤有明顯的抑制作用。因此，可以用于制備抗腫瘤藥物。另外，該化合物對炎癥也有明顯的抑制作用，因此，可以用于制備抗炎藥物。

表1水鬼蕉新堿a的¹h和¹³c核磁共振數據

新化合物水鬼蕉新堿a結構解析

如圖1-7所示，本發明新化合物的¹hnmr、¹³cnmr、2d-nmr(cosy、hsqc、hmbc和rosey)譜，以及hr-esi-ms譜得知化合物結構。具體地說：

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)譜中，δ：8.05(1h,d,j＝8.0hz,),7.82(1h,d,j＝8.0hz),7.59(1h,t,j＝7.3hz),7.53(1h,t,j＝7.3hz),提示結構中存在一個1,2鄰二取代的苯環片段；δ：7.67(1h,s),7.03(1h,s),提示結構中存在一個aa’bb’取代的苯環片段；δ：5.81(1h,d,j＝14.3hz,),4.68(1h,d,j＝14.4hz),3.85(2h,dd,j＝15.2,25.2hz)，提示結構中存在2*-ch2-片段；δ：3.65(3h,s),提示結構中存在一個與吸電子基相連的甲基。

¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)譜給出17個碳信號，其中δc163.0為羰基碳信號。δc：148.8、148.2、140.8、130.1、129.0、127.3、125.5、123.3、121.5、120.6、108.1、104.5提示結構中可能存在12個sp²雜化的碳原子；δc63.5、60.6、49.9提示結構中可能存在與吸電子基連接的碳原子。

hsqc譜給出結構中所有氫碳直接相連的信息，如表1所示。δh6.15與δc101.8相關提示結構中可能存在-o-ch2-o-片段；δh3.65與δc49.9相關，提示結構中可能存在-n-ch3-片段。

hmbc譜中，芳香質子信號δh7.67與δc148.8、121.5相關，芳香質子信號δh7.03與δc148.2、123.3相關，以及亞甲基質子信號δh6.15與δc148.8、148.2相關，提示存在結構片段a1(如圖8所示)；芳香質子信號δh8.05與δc140.8、130.1、123.3相關，芳香質子信號δh7.82與δc130.1、129.0相關，芳香質子信號δh7.59與δc129.0、127.3、120.6相關，芳香質子信號δh7.53與δc140.8、125.5、104.5相關，氮甲基質子δh3.65與δc140.8、63.5、60.6相關，亞甲基質子信號δh3.85與δc163.0、60.6、49.9相關，亞甲基質子信號δh5.81與δc140.8、123.3、121.5相關，亞甲基質子信號δh4.68與δc140.8、123.3、121.5、63.5相關，提示存在結構片段a2(如圖8所示)。將結構片段a1和a2部分連接在一起，最終確定了化合物a的平面結構。

noesy譜中，h-11與h-15、13相關，h-2與h-14a、14b相關，h-14a與h-14b、13相關，確定了該化合物的相對構型。該化合物為未見文獻報道的新生物堿類化合物，相關nmr數據歸屬如表1所示。

附圖說明

圖1新化合物的¹hnmr譜；

圖2新化合物的¹³cnmr譜；

圖3新化合物的cosy譜；

圖4新化合物的hsqc譜；

圖5新化合物的hmbc譜；

圖6新化合物的rosey譜；

圖7新化合物的hr-esi-ms譜；

圖8新化合物的結構片段；

圖9新化合物對人體腫瘤細胞的體外增殖抑制作用影響。

具體實施方式

下面通過實施例進一步描述本發明，使本專業技術更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

實施例1：水鬼蕉(hymenocallislittoralis)鱗莖，切碎，陰干稱重7.5kg，用濃度為1％的氫氧化鈉浸泡堿化，堿化時間為1小時，然后取出水鬼蕉鱗莖晾干，用二氯甲烷溫浸法提取3次，每次提取二氯甲烷的用量為30l，每次提取時間為2小時；合并提取液，對提取液減壓濃縮成浸膏，得到浸膏78g；將上述浸膏與80g硅膠混合拌樣，應用硅膠柱層析，以體積比為15:1-3:1的氯仿-甲醇系統梯度洗脫，薄層層析檢測，收集體積比為15:1-3:1的流分，再經ods反相柱層析，以體積比為3:7-5:5的甲醇-水進行洗脫，收集洗脫液，最后經c18反相柱層析制備液相制備，等度洗脫，流動相為甲醇-水(40：60)，流速為3ml/min，檢測波長210nm，柱溫25℃，得到新化合物水鬼蕉新堿a純品177mg。

實施例2：新化合物水鬼蕉新堿a的細胞毒活性實驗

1、實驗材料

1.1、受試樣品

水鬼蕉新堿a用dmso溶解，加入pbs配成1000μg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用含有dmso的pbs稀釋。

1.2、細胞株

a549(人肺癌細胞)、lovo(人腸癌細胞)、mcf-7(人乳腺癌細胞)、hl-60(人白血病細胞)、hepg-2(人肝癌細胞)。

1.3、培養液

包含rpmi1640、15％nbs、雙抗。

1.4、其他材料

酶標儀、96孔培養板。

2、試驗方法

mtt法：96孔板每孔加入濃度為1×10⁵個/ml的細胞懸液100μl，置于37℃，5％co2培養箱內。24h后，加入樣品液，10μl/孔，設6復孔，37℃，5％co2培養箱內作用48h。每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培養箱內，溶解后用酶標儀測570nmod值。

3、試驗結果

結果見圖9，結果顯示，水鬼蕉新堿a對a549(人肺癌細胞)、lovo(人腸癌細胞)、mcf-7(人乳腺癌細胞)、hl-60(人白血病細胞)和hepg-2(人肝癌細胞)均有較好的抑制活性，水鬼蕉新堿a有很好的抗腫瘤作用，具有良好的開發前景。

實施例3：新化合物水鬼蕉新堿a對小鼠s180肉瘤(實體型)的療效試驗

1、實驗材料

1.1、受試樣品

水鬼蕉新堿a用少量吐溫-80助溶后用0.5％cmc配成溶液。

1.2、動物

品系：昆明種小鼠

體重：20±2g

1.3、移植性腫瘤

小鼠s180肉瘤

2、試驗方法

取生長良好的小鼠s180肉瘤腹水，用生理鹽水以1:4稀釋，每只小鼠腋皮下接種0.2ml，隨機分組，分為對照組，環磷酰胺組(ctx組，20mg/kg，ip×7)、水鬼蕉新堿a(5mg/kg)組，接種后次日起給藥，給藥體積為0.5ml/20g體重，連續灌胃7天。接種后10日脫頸處死動物，稱動物體重后解剖取瘤塊，稱瘤重。結果判定根據以下公式：

3、實驗結果

水鬼蕉新堿a有顯著的腫瘤抑制作用，實驗結果見表2。

表2新化合物水鬼蕉新堿a對小鼠s180肉瘤的抑制作用

與對照組比較：*p＜0.05,**p＜0.01。

實施例4：新化合物水鬼蕉新堿a抗炎實驗小鼠耳腫脹模型

1、實驗動物

swiss種小鼠，體重20-24g

2、實驗模型和測試方法

取小鼠50只，隨機分成5組，按表3所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后1h，用0.05ml的二甲苯將小鼠左耳致炎，用直徑為7mm的打孔器將雙耳重疊打孔，將打孔的圓片在萬分之一靈敏度天平上稱量，用鼠耳兩圓片的重量差表示其腫脹度。

3、統計學分析：

全部實驗結果均以均數±標準誤差表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空白組的顯著性差異，p＜0.05，表示差異有顯著性意義。

4、試驗結果：

表3新化合物水鬼蕉新堿a對小鼠耳腫脹實驗的影響

與對照組比較：*p＜0.05，**p＜0.01。

結果表明，陽性對照藥氫化可的松、新化合物水鬼蕉新堿a對小鼠耳腫脹模型引起的炎癥有顯著的抑制作用。

實施例5：新化合物水鬼蕉新堿a抗炎實驗大鼠角叉菜膠足腫脹模型

1、實驗動物

sd大鼠，雌雄各半，體重200±20g。

2、試驗模型和檢測方法

取大鼠50只，隨機分成5組，按表4所示的劑量灌胃給藥4d，與末次給藥前測量致炎前容積；末次給藥后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射1％角叉菜膠0.1ml致炎。分別于致炎后2、4、6h測量右踝關節以下容積。

3、統計學分析：

全部實驗結果均以均數±標準誤差表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空白組的顯著性差異，p＜0.05，表示差異有顯著性意義。

4實驗結果：

表4新化合物水鬼蕉新堿a對大鼠角叉菜膠足腫脹試驗的影響

與對照組比較：*p＜0.05,**p＜0.01。

結果表明，陽性對照藥地塞米松、水鬼蕉新堿a對大鼠叉菜膠足腫脹模型所引起的炎癥有顯著的抑制作用。

實施例6：新化合物水鬼蕉新堿a抗炎實驗小鼠腹腔毛細血管通透性試驗

1、實驗小鼠

nh系小鼠，雌雄兼用，體重20±2g。

2、實驗模型和測試方法

取大鼠50只，隨機分組5組，按表5所示的劑量灌胃給藥1h，尾靜脈注射2％生理鹽水溶液0.1ml/10g體重，隨機腹腔注射0.8％醋酸生理鹽水溶液0.2ml/只，20min后脫頸椎處死小鼠，用5ml生理鹽水分數次洗滌腹腔，3000轉/分，離心15min；取上清液用酶標儀于570nm比色測定其光密度(od)值。

3、統計學分析：

全部實驗結果均以均數±標準誤差表示。用studentt-檢驗比較各組數據與空白組的顯著性差異，p＜0.05，表示差異有顯著性意義。

4、試驗結果

表5.新化合物水鬼蕉新堿a對小鼠腹腔毛細血管通透性試驗的影響

與對照組比較：*p＜0.05,**p＜0.01。

結果表明，陽性對照藥地塞米松、水鬼蕉新堿a對小鼠腹腔毛細血管通透性試驗引起的炎癥有顯著的抑制作用。