玉米低聚糖復合物在防治年齡相關性黃斑變性中的醫用用途的制作方法

本發明提供了玉米低聚糖復合物的一種新用途，涉及玉米低聚糖復合物在防治年齡相關性黃斑變性中的醫用用途，屬于生物學和醫藥學領域。

背景技術：

醫學研究證明，年齡相關性黃斑變性（amd）主要影響視網膜色素上皮（rpe）細胞，導致光感受器變性，最終導致中心閱讀視力的喪失，是與年齡相關的致盲的重要眼病之一，對老年人的生活質量造成破壞性影響。amd是一種多因素導致的眼部疾病，具有環境，代謝和遺傳因素之間的復雜相互作用，衰老、氧化應激、炎癥免疫、血管生成等因素都與amd疾病的發生與發展相互聯系、相互影響，共同促進amd的發生發展。

當rpe細胞受到損傷時，會引起功能障礙及代謝異常，其最終會導致與之相關的光感受器的損傷而產生視力的退化。在干性amd早期階段，bruch膜與rpe之間會出現局灶性沉積物---玻璃疣，并隨著疾病發展而增加大小和數量，晚期階段會對rpe細胞和光感受器進行進行性破壞。只有一小部分具有玻璃疣的患者將發展濕性amd，其特征在于rpe下的脈絡膜新異常血管的生長，最終導致中心視力的顯著下降甚至失明。目前治療amd的方法有物理治療法（包括經瞳孔溫熱療法、激光治療和光動力治療）、抗血管內皮生長因子（vegf）藥物和手術治療法（黃斑下cnv切除術和黃斑轉位術）。這些治療方法各有優缺點，應該根據實際病情進行選擇。除此之外，具有良好抗氧化活性的天然提取物也可用于預防amd的發生和延緩amd的發展。

碳水化合物根據其分子大小或聚合度（組合的單糖單元的數目）分為單糖、寡糖或多糖,寡糖又稱低聚糖，一般含有3-10個單糖。低聚糖復合物是指低聚糖通常是以糖復合物的形式與蛋白質或脂類等物質相連。本發明利用的玉米低聚糖復合物具有良好抗氧化活性，但是其用于預防amd的發生和延緩amd的發展的研究國內外沒有相關報道。

技術實現要素：

本發明公開了一種玉米低聚糖復合物在防治年齡相關性黃斑變性中的醫用用途，用于防治年齡相關性黃斑變性的發生與發展。

本發明中的玉米低聚糖復合物（osc）有著良好的抗氧化功能。rpe細胞是向視網膜提供結構和營養支持的細胞層，是身體中最具代謝活性的組織，其高代謝率產生高的氧需求和易受氧化應激損傷。玉米低聚糖復合物（osc）作為外源性抗氧化劑，可以在眼睛中通過抑制氧自由基來抑制有害自由基的生成，進而防止眼睛受到氧化損傷。

本發明中的玉米低聚糖復合物（osc）對arpe-19細胞內的抗氧化活性測定，表明其在arpe-19細胞內具有明顯的抗氧化能力。

玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe細胞損傷起保護作用。

玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞sod活性降低、gsh含量降低以及mda含量升高起抑制作用。

玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的活性氧自由基具有清除作用。

玉米低聚糖復合物（osc）的抗氧化分子機制是通過激活細胞的sirt1/pgc-1α通路來完成的。

本發明中的玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠體內的抗氧化活性測定，通過對乙醇損傷小鼠血清中的sod活性、gsh含量以及mda含量的研究，表明其在小鼠體內具有明顯的抗氧化能力。

玉米低聚糖復合物（osc）在小鼠肝臟和眼球中可以激活sirt1/pgc-1α通路，進而抵御由氧化應激引發的疾病。

本發明的積極效果在于：

提供了玉米低聚糖復合物（osc）的新的醫用用途，玉米低聚糖復合物（osc）的作用機制明確、安全、無任何毒副作用；長期服用對治療年齡相關性黃斑變性將有顯著作用，具有廣泛應用的市場前景。

附圖說明：

圖1是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞損傷的保護作用；

圖2是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞凋亡的影響；

圖3是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞的sod活性的影響；

圖4是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞的gsh含量的影響；

圖5是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞的mda含量的影響；

圖6是玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的arpe-19細胞ros含量的影響；

圖7是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠sod活性的影響；

圖8是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠gsh含量的影響；

圖9是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠mda含量的影響；

圖10是玉米低聚糖復合物（osc）對arpe-19細胞sirt1和pgc-1α蛋白水平的表達影響；

圖11是玉米低聚糖復合物（osc）對arpe-19細胞sirt1蛋白表達的統計學結果；

圖12是玉米低聚糖復合物（osc）對arpe-19細胞pgc-1α蛋白表達的統計學結果；

圖13是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠肝臟組織中sirt1、pgc-1α蛋白水平的表達影響；

圖14是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠肝臟組織中sirt1蛋白表達的統計學結果；

圖15是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠眼球組織中pgc-1α蛋白表達的統計學結果；

圖16是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠肝臟組織中sirt1和pgc-1α蛋白水平的表達影響；

圖17是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠眼球組織中sirt1蛋白表達的統計學結果；

圖18是玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠眼球組織中pgc-1α蛋白表達的統計學結果。

具體實施方式

通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所做的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求范圍之內。

實施例1

本發明涉及的玉米低聚糖復合物（osc）的制備方法參見專利申請號2016062200452660，本發明在上述專利基礎上，通過進一步分子量截留，選取分子量為500-1300da的玉米低聚糖復合物（osc）為研究材料。玉米低聚糖復合物（osc）為淡黃色粉末，根據不同人的需求，可以將其制成散劑、顆粒劑、片劑以及膠囊等。

實驗例1

玉米低聚糖復合物（osc）在arpe-19細胞內的抗氧化活性試驗

一、玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2損傷的arpe-19細胞起保護作用。

實驗方法：arpe-19細胞培養于含10％(v/v)胎牛血清的dmem培養基中，貼壁生長，5％co2、37℃培養于培養箱中，根據不同的實驗要求可分別培養于96孔板、6孔板中。先在含有50，150和250μg/ml的玉米低聚糖復合物（osc）的培養基培養24小時，然后更換含有500μmh2o2的培養基培養24小時。

實驗結果：h2o2損傷組的細胞存活率是對照組細胞的68.4%，當用50、150和250μg/ml的osc處理后，arpe-19細胞的細胞活力分別為74.9%、81.3%和87.4%，與h2o2損傷組相比，其細胞活力分別升高了6.5%、12.9%和19%，結果見圖1。利用熒光染料hoechest33258進行染色，熒光顯微鏡下可觀察到正常arpe-19細胞核呈均勻彌散熒光；h2o2損傷的arpe-19細胞的細胞核呈濃染致密的熒光，細胞膜完整，細胞核由勻質狀態固縮成高凝集的點狀結構，這是典型的凋亡形態。加入50、150、250μg/ml的osc培養之后在進行損傷的細胞的核固縮數目減少，染色質邊聚和核碎片減少，細胞凋亡的典型特征明顯減弱，結果見圖2。

二、玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2損傷的arpe-19細胞sod活性、gsh含量和mda含量的影響

實驗方法：將準備檢測的細胞培養液棄去，用pbs溶液清洗2次，用細胞刮刀刮下細胞，1000rpm/min離心10min，棄去上清；重新加入200μl的pbs緩沖液重懸細胞，超聲破碎細胞，制成細胞混濁液，用bca法測定蛋白濃度，其余按試劑盒進行操作；嚴格按照說明書，計算sod活性、gsh和mda含量。

實驗結果：對照組細胞的sod活性為174.78u/mgprot；h2o2損傷組細胞的sod活性為94.11u/mgprot，比對照組降低了80.67u/mgprot。在osc（50，150和250μg/ml）處理下，三個劑量的osc給藥組sod活性顯著地恢復。當osc濃度為250μg/ml時，sod活性為165.21u/mgprot，比h2o2損傷組升高了71.10u/mgprot，結果見圖3。

對照組細胞的gsh含量為282.33nmol/mgprot；h2o2損傷組細胞的gsh含量為165.69nmol/mgprot，比對照組降低了116.64nmol/mgprot。在osc（50，150和250μg/ml）處理下，三個劑量的osc給藥組gsh含量顯著地恢復。當osc濃度為250μg/ml時，gsh含量為254.12nmol/mgprot，gsh含量比h2o2損傷組升高了88.43nmol/mgprot，結果見圖4。

對照組細胞的mda含量為1.79nmol/mgprot；h2o2損傷組細胞的mda含量為8.12nmol/mgprot，比對照組升高了6.33nmol/mgprot。在osc（50，150和250μg/ml）處理下，三個劑量的osc給藥組mda含量顯著地下降。當osc濃度為250μg/ml時，mda含量為2.62nmol/mgprot，比h2o2損傷組降低了5.50nmol/mgprot，結果見圖5。

總之，玉米低聚糖復合物（osc）可以增加h2o2損傷的arpe-19細胞中sod活性和gsh含量，減少mda含量。

三、玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的活性氧自由基具有清除作用

實驗方法：將準備染色的細胞上清液棄去；加入1ml稀釋好的dcfh-da（dcfh-da：無血清培養基=1:1000），細胞培養箱內孵育20分鐘；用無血清細胞培養基洗滌細胞三次；利用488nm激發波長，525nm發射波長測吸光值。

實驗結果：h2o2損傷組的ros含量與對照組相比明顯上升，其相當于對照組的2.8倍，表明細胞氧化應激水平增強；而在osc（50、150、250μg/ml）處理下，三個劑量的osc給藥組ros含量明顯下降，分別下降至對照組的2.1、1.7和1.4倍，結果見圖6。總之，玉米低聚糖復合物（osc）對h2o2誘導的活性氧自由基具有清除作用。

實驗例2

玉米低聚糖復合物（osc）在小鼠體內的抗氧化活性試驗

實驗方法：將25-30g健康成年雄性小鼠隨機分為5個組：1個對照組（正常喂食），1個模型組（正常喂食、乙醇建模）和3個給藥組(喂食低、中、高三個劑量osc）。給藥組給予不同劑量藥物，連續灌胃30天；模型組給予同體積溶劑，連續灌胃30天；末次灌胃后，對照組、模型組以及給藥組禁食16小時（過夜），然后模型組及給藥組一次性灌胃給予50%乙醇12ml/kgbw，6小時后取材。根據試劑盒進行操作，并計算小鼠血清中sod活性、gsh和mda含量。

實驗結果：對照組小鼠的sod活性為291.91u/ml；模型組細胞的sod活性為217.94u/ml，比對照組降低了73.97u/ml。在osc（0.2g/kg、0.4g/kg和0.8g/kg）處理下，三個劑量的osc給藥組sod活性顯著地恢復。當osc濃度為0.8g/kg時，sod活性為274.67u/ml，比模型組升高了56.73u/ml，結果見圖7。

對照組小鼠的gsh含量為7.31umol/l；模型組細胞的gsh含量4.92umol/l，比對照組降低了2.39umol/l。在osc（0.2g/kg、0.4g/kg和0.8g/kg）處理下，三個劑量的osc給藥組gsh含量顯著地恢復。當osc濃度為0.8g/kg時，gsh含量為7.04umol/l，gsh含量比模型組升高了2.12umol/l，結果見圖8。

對照組小鼠的mda含量為6.01nmol/ml；模型組細胞的mda含量為29.51nmol/ml，比對照組升高了23.50nmol/ml。在osc（0.2g/kg、0.4g/kg和0.8g/kg）處理下，三個劑量的osc給藥組mda含量顯著地下降。當osc濃度為0.8g/kg時，mda含量為8.98nmol/ml，比模型組降低了20.53nmol/ml，結果見圖9。

總之，玉米低聚糖復合物（osc）可以增加乙醇損傷的小鼠血清中sod活性和gsh含量，減少mda含量。

實驗例3

玉米低聚糖復合物（osc）在arpe-19細胞和小鼠體內的抗氧化機制試驗

實驗方法：分別利用實驗例1中arpe-19細胞及實驗例2對照組和給藥組小鼠組織，提取細胞及組織中的蛋白質，利用bca法測定樣品的蛋白質濃度，將所有樣品標準化為相同的蛋白質量。使用4×蛋白質上樣緩沖液稀釋，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）上進行分類。蛋白質通過電印跡轉移到硝酸纖維素膜上，將膜在5％的脫脂奶粉溶液中室溫封閉2小時，然后在4℃條件下用一抗孵育過夜。連接辣根過氧化物酶的抗兔二抗用于檢測sirt1、pgc-1α、β-actin的一抗，室溫孵育2小時。將pvdf膜用配制好的顯色液浸濕，用tanon5200全自動化學發光圖像分析系統顯影并分析光密度。

實驗結果：

1.玉米低聚糖復合物（osc）對arpe-19細胞中sirt1及pgc-1α蛋白水平的影響

h2o2損傷組的arpe-19細胞中sirt1及pgc-1α的表達量與對照組（未損傷）相比顯著下降，而在不同濃度osc(50、150、250μg/ml)處理下，三個劑量的osc給藥組sirt1及pgc-1α的表達均有效地提高，并呈濃度依賴性。結果見圖10。對照組細胞sirt1/β-actin為0.703，h2o2損傷組的細胞sirt1/β-actin為0.643，降低了0.06，當osc的濃度為250μg/ml時，sirt1/β-actin為0.865，比損傷組增加了0.222，并呈濃度依賴性，結果見圖11。對照組細胞pgc-1/β-actin為0.817，h2o2損傷組的細胞pgc-1/β-actin為0.716，降低了0.101，當osc的濃度為250μg/ml時，pgc-1/β-actin為0.910，比損傷組增加了0.194，并呈濃度依賴性，結果見圖12。

實驗結果表明，玉米低聚糖復合物（osc）提高了arpe-19細胞中sirt1及pgc-1α的表達量。

玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠肝臟組織sirt1及pgc-1α蛋白水平的影響

喂食不同劑量osc小鼠的肝臟中sirt1及pgc-1α蛋白表達量與對照組相比明顯上調，并呈濃度依賴性，結果見圖13。對照組小鼠sirt1/β-actin及pgc-1/β-actin分別為0.648和0.708，當小鼠被給予0.8g/kg的osc時，sirt1/β-actin及pgc-1/β-actin分別為0.799和0.804，分別比對照組上調了0.151和0.096，結果見圖14、15。

實驗結果表明，玉米低聚糖復合物（osc）提高了小鼠肝臟中sirt1及pgc-1α的表達量。

玉米低聚糖復合物（osc）對小鼠眼球組織sirt1及pgc-1α蛋白水平的影響

喂食不同劑量osc小鼠的眼球中sirt1及pgc-1α蛋白表達量與對照組相比明顯上調，并呈濃度依賴性，結果見圖16。對照組小鼠sirt1/β-actin及pgc-1/β-actin分別為0.762和1.083，當小鼠被給予0.8g/kg的osc時，sirt1/β-actin及pgc-1/β-actin分別為1.030和1.207，分別比對照組上調了0.268和0.124，結果見圖17、18。實驗結果表明，玉米低聚糖復合物（osc）提高了小鼠眼球中sirt1及pgc-1α的表達量。

終上所述，玉米低聚糖復合物（osc）分別提高了arpe-19細胞、小鼠肝臟及眼球中的sirt1及pgc-1α的表達量，推測osc可能通過激活sirt1/pgc-1α通路來抵御氧化應激，進而對細胞和機體起到保護作用。