一種新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統及其制備方法與流程

本發明屬于藥物制劑領域，提供了一種新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統。

技術背景

腫瘤轉移是癌癥成功治療的主要障礙，超過90％的癌癥患者死于腫瘤轉移。因此，如何抑制腫瘤轉移，尤其是抑制腫瘤的早期轉移對于提高癌癥患者的生存率至關重要。腫瘤的轉移是一個多步驟、多階段、多因素的復雜生物學過程。越來越多的證據表明，上皮間質轉化(emt)是許多腫瘤侵襲和轉移早期的一個重要的過程，是腫瘤細胞轉移中的關鍵步驟。原發腫瘤細胞發生emt而獲得運動和侵襲能力，從而使腫瘤細胞的侵襲與轉移能力增強。因此，針對emt的治療能切實抑制腫瘤的侵襲和轉移。

腫瘤細胞發生emt時，會失去與基質膜之間的聯系，細胞的形態和細胞分子標志物的表達會發生變化。其中，n-鈣粘蛋白(n-cadherin)是腫瘤細胞發生emt時顯著高表達的分子標志物，在腫瘤的早期侵襲與轉移中發揮著至關重要的作用。研究表明，腫瘤細胞中n-cadherin表達的上調會促進其侵襲與轉移。因此，下調或是抑制n-cadherin的表達，是抗腫瘤轉移的一個很有潛力的治療策略。環五肽adh-1是一種n-cadherin的拮抗劑，能夠選擇性地結合并阻斷n-cadherin的功能，從而有效地抑制n-cadherin介導的腫瘤細胞的遷移與侵襲。

技術實現要素：

針對現有技術存在的不足，本發明提供一種新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統及其制備方法。

為了達到上述目的，本發明的技術方案為：

一種新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統，該介孔二氧化硅納米給藥系統中環五肽-透明質酸adh-1-ha作為靶向材料、阿霉素作為模型藥物、氨基化的介孔二氧化硅作為載體。靶向材料中的環五肽adh-1作為發生emt的腫瘤細胞表面n-cadherin的靶向抑制劑；靶向材料中的透明質酸(ha)作為主動靶向遞送的靶頭分子，利用其與腫瘤細胞表面cd44受體的特異性結合，實現對腫瘤細胞的靶向識別，同時ha還作為adh-1與氨基化的介孔二氧化硅之間的偶聯分子；采用氨基化的介孔二氧化硅作為藥物載體，利用其有序的介孔結構、大的比表面積、良好的生物相容性及表面易于修飾等特點，實現對藥物dox的高效包載及對自身的表面修飾；該新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統對發生emt的腫瘤細胞具有主動靶向結合與靶向抑制能力，能夠有效地抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。

上述雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的制備方法：

第一步，合成靶向材料環五肽-透明質酸(adh-1-ha)

1.1)將透明質酸鈉溶于去離子水并置于茄型瓶中，室溫下溶脹12～24h，得到透明質酸鈉水溶液。所述的透明質酸鈉水溶液的濃度為15～31mg/ml，透明質酸鈉的分子量為37kda。

1.2)將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)依次滴加到透明質酸鈉水溶液中，活化透明質酸鈉中的羧基1～1.5h，得到混合溶液。所述的edc與nhs的摩爾比為1:1～0.5，透明質酸鈉中的羧基與edc的摩爾比為1:1～1.5。

1.3)將環五肽adh-1加到上述混合溶液中，室溫、攪拌條件下反應24～48h；反應結束后將反應液轉移至透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析純化24～48h；將透析袋中的溶液冷凍干燥，得到產物adh-1-ha，產物可用核磁共振氫譜進行鑒定。所述的透明質酸鈉中羧基與環五肽adh-1的摩爾比為10:1～5:1。所述的透析袋的截留分子量為3500～37500。

第二步，合成新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統

2.1)將靶向材料adh-1-ha溶于去離子水并置于茄型瓶中，室溫下溶脹12～24h。所述的靶向材料adh-1-ha的濃度為16～32mg/ml。

2.2)將edc與nhs依次滴加到步驟2.1)得到的溶液中，活化1.5～2h后，將氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室溫條件下攪拌2～4h得到反應液。所述的edc/nhs的摩爾比為1:1～0.5，靶向材料adh-1-ha中的羧基與edc的摩爾比為1:1～1.5。

2.3)反應液離心并用去離子水洗滌進行純化，冷凍干燥即得新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn)。所述的靶向材料adh-1-ha與氨基化的介孔二氧化硅的質量比為1:2～1:1。

本發明的有益效果為：本發明提供一種能夠高效靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的新型雙重靶向藥物載體。利用介孔二氧化硅作為藥物載體，一方面保證了較大的藥物包載量，另一方面為功能團的修飾提供了可修飾點；通過靶向材料adh-1-ha的修飾，可以增加介孔二氧化硅納米給藥系統的腫瘤細胞靶向性及對發生emt腫瘤細胞n-cadherin的靶向抑制，提高對腫瘤細胞遷移與侵襲的抑制率。本發明方法設計合理，制備工藝簡單，具有廣闊的應用前景，同時也為相應給藥系統的設計和發展打下基礎。

附圖說明

圖1為透明質酸(ha)的核磁共振氫譜圖；

圖2為靶向材料環五肽-透明質酸(adh-1-ha)的核磁共振氫譜圖；

圖3(a)為用掃描電鏡觀察到的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的形態圖；

圖3(b)為采用動態光散射儀分析得到的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn)的粒徑分布圖；

圖4(a)為未經tgf-β1誘導的人非小細胞肺癌a549細胞形態圖；

圖4(b)為tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞形態圖；

圖5為用蛋白免疫印跡分析得到的未用tgf-β1誘導(control)和tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞(tgf-β1)相關蛋白的表達情況；

圖6為tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞對包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統的攝取圖，其中細胞核用dapi進行染色。

圖7為tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞對包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統的攝取圖，其中細胞核用dapi進行染色。

圖8為tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞對包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的攝取圖，其中細胞核用dapi進行染色。

圖9為cck-8法測定的包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(msn/dox)、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(ha-msn/dox)、包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn/dox)和游離阿霉素(freedox)對tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞的細胞毒作用。

圖10(a)用未經基質膠覆蓋的侵襲小室測定的無血清培養基(a549/emt)、游離adh-1(adh-1)、包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(msn/dox)、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(ha-msn/dox)和包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn/dox)對tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞的遷移抑制情況；

圖10(b)用基質膠覆蓋的侵襲小室測定的無血清培養基(a549/emt)、游離adh-1(adh-1)、包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(msn/dox)、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統(ha-msn/dox)和包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn/dox)對tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞的侵襲抑制情況；

圖11為用蛋白免疫印跡法分析得到的各處理組對tgf-β1誘導發生emt的人非小細胞肺癌a549細胞內的n-cadherin蛋白表達量的影響情況。其中各處理組分別為：1.完全培養基；2.游離adh-1；3.包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統；4.包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統；5.預先用n-cadherin抗體孵育1h后，再加入包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統。

具體實施方式

以下結合具體實施方式對本發明作進一步說明。

實施例1

第一步，合成靶向材料環五肽-透明質酸(adh-1-ha)

精密稱取31mg透明質酸鈉溶于去離子水并置于茄型瓶中，溶脹24h，然后將23.4mgedc和14.1mgnhs依次滴加到透明質酸鈉水溶液中，活化1.5h，隨后將5mg環五肽adh-1加到上述溶液中，室溫、攪拌條件下反應48h。反應結束后將反應液轉移至截留分子量為3500的透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析24h，進行純化；將透析袋中的溶液冷凍干燥后，得到產物adh-1-ha。

將所得樣品用核磁共振氫譜進行表征，圖2為adh-1-ha的核磁共振氫譜圖：與圖1中ha的核磁共振氫譜圖相比，adh-1-ha的核磁共振氫譜圖中出現了三個新峰，分別為2.81ppm來自于adh-1十七雜環上的三個叔氫，7.25ppm和8.58ppm來自于adh-1五元雜環上的兩個叔氫，證明靶向材料adh-1-ha的成功合成。

第二步，合成新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統

精密稱取6mg靶向材料adh-1-ha溶于去離子水并置于茄型瓶中，水化24h，然后將3.90mgedc與2.35mgnhs依次滴加到溶液中，活化1.5h，將12mg氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室溫條件下攪拌2h。反應液以12000g/min的轉速離心并用去離子水洗滌三次，進行純化，冷凍干燥即得到新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統(adh-1-ha-msn)。

將新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統滴加到硅片上，待自然晾干后，用掃描電子顯微鏡進行觀察，如圖3(a)所示，其為圓形顆粒，大小較為均一。

將新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統用動態光散射儀進行粒徑分析，圖3(b)為其粒徑分布，可以看出它的粒徑主要分布在100nm。

腫瘤emt細胞模型的建立及表征

細胞模型的建立方法：待a549細胞的覆蓋率達到30％～40％時，用無血清的培養基饑餓處理24h，然后用含5ng/mltgf-β1的完全培養基，再培養48h。圖4(a)、(b)為a549細胞未誘導和誘導的細胞形態圖。可以看出與未誘導的細胞相比，誘導之后細胞的形態大多為紡錘狀。

將a549細胞接種于六孔板中，饑餓處理24h，然后用含5ng/mltgf-β1的完全培養基，再培養48h。去除培養基，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，然后每孔中加入150μl細胞裂解液，用槍吹打數下，使裂解液與細胞充分接觸，在冰上裂解40分鐘后，12000g/min離心4min，取上清，然后進行免疫印跡分析。圖5分別為未用tgf-β1誘導和誘導后相關蛋白的表達情況，與未用tgf-β1誘導的細胞相比，誘導之后細胞的上皮細胞標志物e-鈣粘蛋白(e-cadherin)的表達量下降，間質細胞標志物：n-鈣粘蛋白(n-cadherin)，snail和波形蛋白(vimentin)的表達量增多，表明誘導之后的a549細胞發生了上皮間質轉化。

tgf-β1誘導發生emt的a549細胞對新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的攝取

將tgf-β1誘導發生emt的a549細胞接種于放置蓋破片的24孔板中，培養過夜，使細胞爬片。移除培養基，分別用包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統和包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統處理細胞4h，其中各組阿霉素的濃度均為10ng/ml。用激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組中介孔二氧化硅納米給藥系統在誘導tgf-β1發生emt的a549細胞內的攝取情況。從圖6和圖7顯示的結果可以看出：經過ha修飾后的介孔二氧化硅納米給藥系統在tgf-β1誘導發生emt的a549細胞內的攝取量明顯高于未經ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統的攝取量，說明ha的修飾增加了介孔二氧化硅納米給藥系統對tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的靶向性。但是，adh-1-ha修飾的該新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統對tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的靶向能力與只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統相比有所下降。這是由于ha上的羧基被adh-1取代，羧基數目的減少會削弱ha的靶向性。圖6，圖7，圖8的比例尺為75.0μm。

新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的細胞毒性測定

新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的細胞毒性測定采用cck-8法。將tgf-β1誘導發生emt的a549細胞(5×103/孔)接種于96孔培養板，培養過夜。分別加入含有一系列濃度的包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的完全培養基，以游離阿霉素、包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統和包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統處理組作為對照。co2培養箱37℃培養48h，然后每孔中加入10μlcck-8溶液，繼續培養1h后，在酶標儀上，于450nm測定a值。按以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率(％)＝(a樣品/a空白)×100％

圖9中的結果表明：與未經ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統相比，ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統顯著增加了對tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的細胞毒性。表明ha的修飾增加了介孔二氧化硅納米給藥系統對tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的靶向性，提高了藥物在細胞內的蓄積量，增加了藥物對tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的毒性。更重要的是，新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的細胞攝取量雖然低于只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統，但是它的細胞毒性要顯著高于只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統，這表明該新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統表現出了協同的抗腫瘤效果：adh-1阻斷了n-cadherin的功能，阿霉素導致dna損傷。圖9中每個數值為平均值±sd(n＝3)。

新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統抑制腫瘤細胞遷移與侵襲能力的測定

tgf-β1誘導發生emt的a549細胞消化、離心、用無血清培養基重懸后接種于未鋪基質膠的侵襲小室的上室，下室中加入600μl完全培養基作為趨化劑。然后在上室中加入包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統液，以無血清培養基、包載阿霉素的未經ha和adh-1修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統和游離adh-1作為對照。培養24h后移除上、下室液體，用磷酸鹽緩沖液洗一遍，用棉簽擦去上室中未遷移的細胞，用磷酸鹽緩沖液洗三遍，下室加入600μl甲醇固定20min，移除甲醇，用磷酸鹽緩沖液洗三遍，下室加入500μl，0.1％的結晶紫溶液，將細胞染色30min，用磷酸鹽緩沖液洗滌小室，待膜完全干燥后，用顯微鏡觀察上室底側的細胞，10倍目鏡拍照，取九個視野計數，統計細胞遷移數目。細胞侵襲實驗與上述的細胞遷移實驗類似，只是侵襲小室的上室要基質膠包被基底膜。

從圖10(a)顯示的結果可以看出，與未經ha修飾的相比，ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統顯著抑制了tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的遷移，表明ha的修飾增加了介孔二氧化硅納米給藥系統對細胞的靶向性，提高了對細胞遷移的抑制能力。而且新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統抑制tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的遷移能力要顯著高于只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統，表明adh-1的修飾阻斷了n-cadherin的功能，因此抑制了腫瘤細胞的遷移。這一結論，會進一步用蛋白免疫印跡進行驗證。細胞侵襲實驗的結果與細胞遷移實驗的結果一致(圖10(b))，與其它給藥系統相比，新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統抑制tgf-β1誘導發生emt的a549細胞的侵襲的能力最強。

新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統抑制腫瘤細胞遷移與侵襲機制的探究

越來越多的研究表明，n-cadherin的下調抑制了腫瘤細胞的遷移與侵襲。因此，我們用蛋白免疫印跡的方法測定了n-cadherin的表達量，用于探究新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統抑制tgf-β1誘導發生emt的a549細胞侵襲的機制。tgf-β1誘導發生emt的a549細胞用包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統進行處理，以完全培養基、游離adh-1、包載阿霉素的只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統和預先用n-cadherin抗體孵育1h后，再用包載阿霉素的新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統的處理組作為對照。如圖11所示，用新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統處理的實驗組，與用只有ha修飾的介孔二氧化硅納米給藥系統處理的對照組和預先用n-cadherin抗體孵育1h后，再用其處理的對照組相比，降低了n-cadherin的表達量；與用游離adh-1處理的對照組結果一致。上述結果表明，新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統是通過下調n-cadherin的表達量實現對腫瘤細胞遷移與侵襲的抑制。

實施例2

將第一步的adh-1肽和ha的質量5mg和31mg改為9.1mg和31mg；將第二步的adh-1-ha和氨基修飾介孔二氧化硅的質量6mg和12mg改為6mg和6mg；其它制備條件不變，制備新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統。

實施例3

將第一步的adh-1肽和ha的質量5mg和31mg改為5.7mg和31mg，將第二步的adh-1-ha和氨基修飾介孔二氧化硅的質量6mg和12mg改為6mg和9mg，其它制備條件不變，制備新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統。

實施例4

第一步，合成靶向材料—環五肽-透明質酸(adh-1-ha)

精密稱取31mg透明質酸鈉溶于去離子水并置于茄型瓶中，溶脹12h，然后將15.6mgedc和9.4mgnhs依次滴加到透明質酸鈉水溶液中，活化2h，隨后將9.1mg環五肽adh-1加到上述溶液中，室溫、攪拌條件下反應24h。反應結束后將反應液轉移至截留分子量為3500的透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析36h，進行純化；將透析袋中的溶液冷凍干燥后，得到產物adh-1-ha。

第二步，合成新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統

精密稱取6mg靶向材料adh-1-ha溶于去離子水并置于茄型瓶中，溶脹12h，然后將2.6mgedc與1.6mgnhs依次滴加到溶液中，活化2h，將6mg氨基修飾的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室溫條件下攪拌4h。反應液12000g/min離心并用去離子水洗滌三次，進行純化，冷凍干燥即得到新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統adh-1-ha-msn。

實施例5

第一步，合成靶向材料—環五肽-透明質酸(adh-1-ha)

精密稱取31mg透明質酸鈉溶于去離子水并置于茄型瓶中，溶脹18h，然后將19.5mgedc和11.7mgnhs依次滴加到透明質酸鈉水溶液中，活化2h，隨后將5.7mg環五肽adh-1加到上述溶液中，室溫、攪拌條件下反應36h。反應結束后將反應液轉移至截留分子量為3500的透析袋中，兩端夾緊，用去離子水透析36h，進行純化；將透析袋中的溶液冷凍干燥后，得到產物adh-1-ha。

第二步，合成新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統

精密稱取6mg靶向材料adh-1-ha溶于去離子水并置于茄型瓶中，溶脹36h，然后將3.3mgedc與2.0mgnhs依次滴加到溶液中，活化2h，將9mg氨基化的介孔二氧化硅滴加到上述溶液中，室溫條件下攪拌3h。反應液12000g/min離心并用去離子水洗滌三次，進行純化，冷凍干燥即得到新型雙重靶向抑制腫瘤細胞遷移與侵襲的介孔二氧化硅納米給藥系統adh-1-ha-msn。

上述實施方式用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發明做出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。