一種聚電解質修飾的氧化石墨烯抗癌藥物制劑及其制備方法與流程

本發明屬于藥物制劑領域，特別涉及一種聚電解質修飾的氧化石墨烯用于抗癌藥物口服轉運的藥物制劑及其制備方法。

背景技術：

go是親水性物質，其表面具有羥基，羧基和環氧基團以及大量的含氧極性基團，是親水性材料，表面改性的go可在高鹽溶液和生理溶液中穩定。go結構中的碳原子與藥物結構形成穩定的化學鍵，所以通過π-π共軛和疏水相互作用可以吸附大量的生物活性分子。目前，研究重點是go的生物相容性，go與機體之間的相互作用的機制仍處于起步階段。go在機體內具體的生理機制尚待進一步研究，特別是作為抗癌藥物的口服載體，其在胃腸道的穩定性、生物相容性等方面的探究具有非常重要的意義。

大多數納米給藥系統經口服后，由于空間阻塞或黏附性而被黏液層截留，然后隨著黏液層的更新在數分鐘至數小時內被清除，嚴重影響制劑在局部的滯留時間。因此，納米粒子必須避免黏蛋白纖維網的空間阻隔，滲透并穿過黏液層，才能到達胃腸道表面。

以殼聚糖為代表的聚電解質是一種十分有效的腸道吸收促進劑。其作用機制可能是其陽離子部分與細胞表面的糖蛋白陰離子部分相互作用，或與上皮緊密連接內部的負電荷區相互作用，導致緊密連接蛋白的結構重組而打開緊密連接。這類聚電解質與生物膜的黏附一般靠的是弱的非共價鍵。最近，研究人員將聚電解質與半胱氨酸(cys)結合，這些結合在聚電解質上的cys能與黏膜糖蛋白的cys富集區域形成共價鍵結合，與原來聚電解質相比，巰基聚電解質具有毒性小、酶活性抑制更強的黏膜黏附能力、口服后不易被消化道吸收、能長時間發揮吸收促進作用等特點。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種聚電解質修飾的氧化石墨烯用于抗癌藥物口服轉運的藥物制劑及其制備方法，該方法操作簡單，反應條件溫和。能顯著提高藥物的載藥率，穩定性好，起到了緩控釋效果，借助paa-cys打開腸道黏膜上皮細胞間隙的緊密連接從而增加藥物的細胞旁路轉運，能夠顯著提高水溶性藥物口服生物利用度。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種聚電解質修飾的氧化石墨烯抗癌藥物制劑，在負載抗癌藥物x的氧化石墨烯go表面依次包裹帶正電荷的聚烯丙基胺鹽酸鹽pah及帶負電荷的聚丙烯酸paa和半胱氨酸cys，得到所述的聚電解質修的氧化石墨烯抗癌藥物制劑paa-cys/pah-go-x。

優選的，上述的聚電解質修飾的氧化石墨烯抗癌藥物制劑，所述的抗癌藥物x為平陽霉素(pym)或阿霉素(dox)或紫杉醇(ptx)或阿法替尼(af)。

聚電解質修飾的氧化石墨烯抗癌藥物制劑的制備方法，制備方法包括如下步驟：

1)攪拌下，將氧化石墨烯go的pbs溶液滴加到抗癌藥物x的水溶液中，超聲將抗癌藥物x負載到氧化石墨烯go上，10000rpm離心，除去游離的藥物沉淀物，復溶后凍干，得到go-x；

優選的，超聲反應時間為5-60min；按質量比，抗癌藥物x:氧化石墨烯go＝1:(0.2-2)；離心時間5-30min。

2)將go-x水溶液加熱至45℃，加入聚烯丙基胺鹽酸鹽pah和縮合劑edc，攪拌反應，獲得pah-go-x；

優選的，go-x水溶液的濃度為0.5-3mg/ml。

優選的，每200mggo-x加入78mgpah。

3)調節聚丙烯酸paa水溶液的ph，加入縮合劑edc(碳二亞胺)，20-35℃，攪拌下，逐漸加入半胱氨酸cys，將所得反應物透析，除去過量cys，凍干，得到paa-cys；

優選的，調節聚丙烯酸paa水溶液的ph為3.5-4.5；每1mol聚丙烯酸paa加入10-20mol的縮合劑edc，1-4mol的半胱氨酸cys。

優選的，透析采用的透析袋為mw＝8000da，透析時間為每2h更換透析介質，透析48h。

4)將paa-cys與pah-go-x混合，在攪拌下，滴加少量冰醋酸，溶解后，加入到維生素e琥拍酸酯反應液中，加熱攪拌反應1h，之后室溫反應12h，得聚電解質修的氧化石墨烯抗癌藥物制劑paa-cys/pah-go-x。

優選的，每200mggo-x加入78mgpaa-cys。

上述的聚電解質修的氧化石墨烯抗癌藥物制劑paa-cys/pah-go-x在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明，以go作為口服給藥載體，依靠π-π共軛吸附作用，將抗癌藥物裝載于go表面，go巨大的比表面積能顯著提高藥物的載藥率。同時，為了防止抗癌藥物在消化道內被降解和破壞，利用層層自主裝技術，在go表面分別包裹帶正電荷的聚烯丙基胺鹽酸鹽(pah)和帶負電荷的paa-cys，最終得到paa-cys/pah-go-x。

本發明的有益效果是：

1、本發明，聚電解質pah和paa-cys以非共價鍵形式包裹在go表面，不改變其原有物理化學及生物學性質。復合材料載藥量高，生理溶液中穩定性好。

2、本發明，藥物具有ph敏感的釋放特性，聚電解質的雙層包裹明顯使pym在強酸環境下的耐酸能力得到了改善，藥物在胃中穩定，在腸道中釋放，提高藥物的靶向性，從而增強其抗腫瘤療效。

3、本發明，paa-cys與腸黏膜上的糖蛋白形成的二硫鍵能提供較強的腸道黏附性，大大延緩了機體的清除作用。雙層聚電解質包裹，顯著提高藥物在消化道內穩定性的同時，延緩了藥物的釋放速度，起到了緩控釋效果。

4、本發明，paa-cys能夠打開上皮細胞的緊密連接，增加粒子的細胞旁路轉運，顯著提高藥物的口服生物利用度。

5、本發明，paa-cys是一種非常好的ph敏感型聚電解質腸道吸收促進劑，當外界環境ph>4.5時，paa去質子化帶負電荷，大量負電荷相互排斥，開始吸水發生顯著溶脹產生黏性。paa-cys與黏蛋白混合后溶液黏度增加6倍，與paa相比，paa-cys的黏膜黏附性提高25倍。

附圖說明

圖1為實施例1中pym的標準曲線。

圖2為實施例1中游離巰基的標準曲線。

圖3為實施例1中paa-cys在掃描電子顯微鏡下的結構。

圖4為實施例1中paa-cys粒徑分布圖。

圖5為實施例1中paa-cyszeta電位圖。

圖6為實施例2中pcpgp的粒徑圖。

圖7為實施例2中pcpgp的zeta電位圖。

圖8為實施例2中pcpgp的透射電鏡圖。

圖9為實施例2中go-pym在不同ph介質中的釋放曲線。

圖10為實施例2中pcpgp在不同ph介質中的體外釋放曲線圖。

圖11為實施例2中pym、go-pym、pcpgp大鼠在體腸吸收試驗。

圖12為實施例2中空白血漿色譜圖。

圖13為實施例2中pym和內標dox的高效液相色譜圖。

圖14為實施例2中pym體內藥動標準曲線圖。

圖15為實施例2中大鼠口服灌胃pym、go-pym、pcpgp后測得的藥時曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進一步闡述，但需要指出的是，本發明的保護范圍不應受這些實施例的任何限制。

實施例1

(一)go載藥平陽霉素(pym)

1、制備方法包括如下步驟：

1)稱取200mg的氧化石墨烯go于ep管中，加入100mlpbs緩沖液，通過超聲使其充分溶解。

2)稱取100mgpym加入到盛有1000ml蒸餾水的燒杯中溶解。

3)在磁力攪拌的條件下，將ep管中的go的pbs溶液滴入燒杯中的pym的水溶液中，通過超聲將藥物負載到氧化石墨烯go上。

4)溶液用高速離心機在10000rpm下高速離心20min，除去游離的pym。收集下層沉淀物，并復溶，即可得到go-pym。

2、包封率的計算

go-pym載藥體系的包封率，采用高效液相色譜法測定藥物含量。

1)pym液相色譜條件為：色譜柱：色譜柱為watersmaterialsc18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：以己烷磺酸鈉溶液(己烷磺酸鈉鈉7.53g和乙二胺四乙酸3.72g，加0.08mol/l醋酸溶液并稀釋，加入氨水至1000ml并調整ph值4.3)為流動相a；甲醇-乙腈(7:3)為流動相b。流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：291nm；進樣量：20μl

2)pym標準曲線的建立

精密稱取pym標準品20mg于500ml的容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，制備成濃度為40μg/ml的母液。將上述母液逐漸稀釋成濃度為40μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml，0.8μg/ml，0.4μg/ml，在1)的液相條件下進樣分析，得到標準曲線：y＝28168x-1108.8，r＝0.9999，如圖1。日內、日間精密度測量rsd值均小于2％，說明方法精密度良好。方法回收率在95％-105％的區間，且rsd值也符合要求，說明此方法的可行性。

3)包封率測定：取已知體積的上清液置于25ml容量瓶中，加水至刻度線，并取1ml置于10ml的ep管中待測定。在2.3.1的高效液相色譜條件下進行測定，記錄數據，并代入標準曲線公式，計算出的上清液的藥物濃度為c1，總藥量則為c0。包封率按照如下公式計算。

包封率(ee)＝(c0-c1)/c0×100％

3、go-pym的處方工藝考察

以包封率為考察指標，將go-pym的制備過程進行優化篩選。通過單因素考察(超聲時間和藥質比)來確定載藥試驗的最佳處方工藝。

1)超聲時間對包封率的影響

如表1改變制備方法中步驟3)的超聲時間，并分別做4批次。在試驗的超聲環節，通過選擇不同的超聲時間，分別為(5min，15min，30min和60min)。超聲結束后將各溶液以10000rpm離心20min，取上清液并測定其藥物含量以計算試驗包封率。其包封率結果如下表1。

表1超聲時間對藥物包封率的影響

由表1可知，超聲時間對于載藥的包封率有顯著的影響，超聲時間為30min時，達到最大包封率，因此選用超聲時間為30min。

2)藥物/載體比例對包封率的影響

如表2改變pym和go的質量比，并分別做4批次。在試驗的投料環節，通過選擇不同的藥物/載體比例分別為(1:2,1:1,1:0.5,1:0.2)。超聲30min，將各溶液以10000rpm離心20min，取上清液并測定其藥物含量，并計算包封率。其包封率結果如下表2。

表2藥質比對藥物的包封率和載藥量的影響

由表2可見，在藥物與載體的質量比為2:1時，包封率為82.05％，達到良好的載藥效果，故選擇藥物與載體的質量比為2:1為最佳處方工藝。

(二)巰基修飾的聚丙烯酸(paa-cys)的合成及表征

1、paa-cys的制備

1)將720mg(0.01mol)paa溶于10ml水中，調節paa水溶液的ph到3.5，再加入1910mg碳二亞胺(edc)(0.1mol)。

2)將反應混合物在20-35℃下，磁力攪拌器攪拌15min，并逐漸向混合物中加入1210mg的cys(0.01mol)，反應過程中攪拌不停止。

3)所得反應物放入處理后的透析袋內，然后將透析袋放入盛有0.2mmol/l鹽酸的大燒杯中，將大燒杯放入磁力攪拌器下攪拌透析2h，然后將透析液換成蒸餾水，繼續透析，每隔2h換一次透析液，共透析48h。

4)最后將產物凍干，將凍干粉末于4℃的環境下儲存，備用。

2、paa-cys的合成條件的優化篩選

通過上述的paa-cys的制備，將其中的edc的量，ph的條件，溫度以及cys的量分別作為變量，進行合成條件篩選，具體參數如下表3。二硝基苯磺酸(tnbs)測共軛物中游離的cys的含量；ellman試劑反應，二硝基苯甲酸(dtnb)在紫外下測得paa-cys中游離的巰基的含量，最后用馬爾文激光粒度分析儀測共軛物的粒徑及zeta電位大小來檢驗聚合物是否穩定，從而選出最優的制備工藝。

表3paa-cys高分子聚合物的制備

2.1tnbs測游離cys

將制得的paa-cys100mg溶于10ml溶劑中，分別取不同體積溶液于試管中。向每個試管里加入蒸餾水1ml。將每個試管里加入1ml的硼酸緩沖液(0.1mol)，最后向每個試管里加入1ml的tnbs溶液，將溶液混勻并在溫水浴40℃下反應100min，在420nm紫外下測得光譜。

對7組方法分別進行游離cys檢測，當透析時間為48h時，幾乎測不到各組中有游離的cys。此結果說明透析時間為48h最佳，可以將混合物中的游離cys等小分子物質更徹底的透析除去。

2.2游離巰基含量的測定：

1)三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)緩沖液(0.25mol/l)：稱取3.0285g三羥甲基氨基甲烷，加入蒸餾水，用鹽酸調節ph為8.3定容至100ml；

2)cys標準溶液(0.2mol/l)的配制：準確稱取2.42gcys(mv＝121)，用1ml甲酸溶解，用ddw定容至100ml。

3)dtnb(mw396.35)標準溶液(0.1mol/l)的配制：準確稱取1.9817g的dtnb，用50mmolna2hpo4(ph＝7.0)配制成50mlellman溶液，存放于棕色瓶中，放于暗處低溫的環境下保存備用。

4)用tris緩沖液稀釋cys標準溶液配制成濃度梯度分別為0.025mol/l，0.05mol/l，0.075mol/l，0.1mol/l，0.125mol/l的標準溶液。取上述各濃度溶液1ml分別加入到5ml的預先恒溫于25℃水中的ellman溶液溶液中，搖勻，靜止10min，于412nm處測定其吸光度值(a)。計算得到游離巰基的標準曲線y＝4.616x+0.1138，r＝0.99916。如圖2。

按照上述方法測定，計算得到paa-cys上游離的巰基的濃度如表4所示：

表4paa-cys上游離的巰基的濃度

由表4可以看出，7組所得游離的巰基并無太大差別，故選用更經濟的方法，即e組制備paa-cys要在ph為4.5的弱酸環境下，加熱至35℃，加入1.91g的edc活化羧酸根離子，并且paa與cys的加入的摩爾比為1:1，所制得的paa-cys的制備工藝為最優方案。

2.3paa-cys的表征與實驗結果

paa與cys之間的共價結合是通過cys上的氨基與聚合物上的羰基形成酰胺鍵而完成的。獲得的產物是白色的并且成纖維狀結構。

1)掃描電鏡

將樣品分散在dmso溶液中，濃度為0.1mg/ml，然后滴入溶解的分散液，通過離子濺射儀對表面進行噴金處理后觀察。掃描電鏡的加速電壓為8.0kv。如圖3所示。從圖中可以看出，paa-cys在未經染色的情況下，是白色的類球狀的結構且連接緊密，這與paa-cys的理論結構相一致。

2)zeta電位與粒徑

稱取paa-cys置于ep管中，加入蒸餾水使之充分溶解，測粒徑及zeta電位，如圖4、圖5所示，平均粒徑在300nm左右，zeta電位平均值在-39mv左右。

實施例2paa-cys/pah-go-pym(pcpgp)的合成

(一)paa-cys/pah-go-pym的合成方法

1)稱取200mg的氧化石墨烯go于ep管中，加入100mlpbs緩沖液，通過超聲使其充分溶解。稱取100mgpym加入到盛有1000ml蒸餾水的燒杯中溶解。在磁力攪拌的條件下，將ep管中的go溶液滴入pym的燒杯中，超聲30min，所得溶液用高速離心機在10000rpm下高速離心20min，除去游離的pym。收集下層沉淀物并復溶后凍干得到go-pym。

2)稱取go-pym200mg溶于90ml蒸餾水中，加熱至45℃，加入78mg聚烯丙基胺鹽酸鹽pah和1910mg縮合劑edc，攪拌反應，通過透析法將溶液透析36h，獲得pah-go-pym；

3)將720mg(0.01mol)paa溶于10ml水中，調節聚丙烯酸paa水溶液的ph為4.5，加入1910mg(0.1mol)縮合劑edc(碳二亞胺)，35℃，攪拌下，逐漸加入1210mg(0.01mol)半胱氨酸cys，反應物透析除去過量cys，凍干，得到paa-cys；

所述的透析采用的透析袋為mw＝8000da，透析時間為每2h更換透析介質，透析48h。

4)將78mgpaa-cys與步驟2)獲得的pah-go-pym混合，在攪拌下，滴加少量冰醋酸，使之溶解后，加入到500ml維生素e琥拍酸酯反應液中，70℃加熱攪拌反應1h，之后室溫反應12h，得聚電解質修的氧化石墨烯抗癌藥物制劑paa-cys/pah-go-pym(pcpgp)。

(二)粒徑與zeta電位

將paa-cys/pah-go-pym溶解于蒸餾水中，振搖混勻。測量粒徑和zeta電位以及pdi值。結果如下圖6、圖7所示。由圖可知，paa-cys/pah-go-pym的粒徑在750nm左右，且pdi值約為0.23，小于0.3，粒徑均勻，分布良好。zeta電位為-34.1mv，說明表面帶有負電荷能側面說明制劑外層為paa-cys顯負電性。并且其絕對值大于20mv，由于具有較大的靜電斥力，藥物粒子不易聚沉，因此穩定性良好。

(三)透射電鏡試驗

制樣：取約1mlpaa-cys/pah-go-pym溶液，將其稀釋20倍，用槍頭吸取100μl，滴到200目的銅網上；并配置2％的磷鎢酸，用氫氧化鈉調節ph至6.4-7.0，然后吸取100μl磷鎢酸，緩慢的滴到銅網上，涼干，測定。結果如圖8所示。從圖中可以看出，go-pym以黑色片狀存在，外層包裹物的黑色片層為聚電解質片層，粒徑大約在750nm左右，未出現聚集現象。

(四)自由巰基檢測穩定性

取pcpgp溶液1ml分別加入到5ml的預先恒溫于25℃水中的dtnb分析溶液中，搖勻，靜止10min，在波長412nm處測定吸光度值(a)。通過檢測未檢測出游離的巰基，說明制劑組pcpgp溶液中不含有未結合的cys，證明制劑組pcpgp的穩定性。

(五)paa-cys/pah-go-pym的體外釋放研究

通過透析法來探究pcpgp的體外釋放情況。其中采用高效液相色譜法測定釋放介質中pym濃度。分別取1ml制備好的pcpgp和gp于透析袋中(mwco:8000da)，在不同ph條件下(ph2.3，ph5.8，ph7.4，ph8.0，模擬溶酶體的內環境，腫瘤部位，血液以及胃腸道處的ph值)的10ml含有0.1％(w/v)sds的pbs緩沖液作為透析介質，轉速設為100r/min，分別在0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h，60h取樣1ml，同時補充同樣的新鮮釋放介質1ml。并用0.45μm的濾頭進行過濾，按照實施例1進樣測定，測量pym的含量，并計算出相應時間點的累積釋放量。做出時間-累積釋放量曲線如下圖9、圖10。由圖可知，將4種不同ph條件的累積釋放量作為對比，gp中藥物在酸性條件下釋放量高于中性條件，表現出了一定的ph敏感性。其原因主要可能是：pym具有羥基，氨基等官能團，而go有羥基、羧基，在酸性條件下，使藥物與go形成的氫鍵斷裂，所以藥物釋放量大于其他環境。ph7.4中性條件，pym上的羥基、氨基可與go上羥基、羧基形成氫鍵，結合穩定。而pcpgp中pym被包裹上聚電解質后，使得其在ph2.3的條件下與ph8.0與ph7.4的累計釋放量相當。在酸性條件下累積釋放率降低13.60％，ph5.8的環境下藥物的累計釋放率并沒有下降，基本維持在80％以上的釋放溶出率。不同ph條件下的釋放變化情況一致，說明在雙層的聚電解質包裹下，使pcpgp制劑組中的pym得到了很好的保護。在胃酸等強酸的環境下，有了聚電解質的雙層包裹明顯使藥物的耐酸性得到了改善，從而提高了藥物的口服生物利用度。

(六)paa-cys-pah/go-pym在體腸吸收實驗和藥代動力學研究

大鼠禁食12h，不禁水。腹腔內注射20％的烏拉坦溶液麻醉(約1.0g/kg)。將大鼠固定在手術臺上并保持體溫。沿著肚腹線打開腹腔，取小腸約10cm，由一端切開插管，切口兩端用預熱至37℃的kr溶液沖洗，輕輕清洗腸內容物。之后再插管結扎于出口處。用吸收鹽水的脫脂棉將大鼠傷口覆蓋，在紅外線下保溫。通過入口管灌注，流速大致保持為0.5ml/min，每間隔10min于出口處用ep管收集灌流液，持續1h。在測試結束后處死大鼠，將腸斷剪下，分別測定pym和酚紅的濃度。酚紅不被小腸吸收，給定時間測定酚紅的濃度，就可以計算出不同時間供試液的體積，再根據測定的藥物濃度，就可以得出不同時間小腸中剩余的藥量或被吸收的藥量。

1)pym的測定：取樣品0.5ml置5mlep管中，加入1mol/lhcl1ml，搖勻，然后加0.1％na2no21ml，搖勻，放置3min再加0.5％nh2so3nh41ml，搖勻，在291nm的波長處利用高效液相進行檢測。

2)酚紅的測定：取樣品0.5ml置5mlep管中，加0.2mol/lnaoh2ml，搖勻，在215nm的波長處用高效液相測定其峰面積。

3)通過分別測定0.17h、0.33h、0.5h、0.67h、0.83h、1h時間點的藥物濃度，求出剩余藥物百分比，再比較pym、go-pym、pcpgp的在體腸吸收情況，如圖11所示。由圖可以看出，通過試驗能夠看出，pym組、go-pym組、pcpgp組都有一定的在體腸吸收能力，同時pcpgp組表現出更好的吸收效果達到了27.84％高于pym組的18.29％和go-pym組的19.56％，說明聚電解質包裹的藥物對腸吸收有一定黏附作用。

(七)paa-cys-pah/go-pym藥代動力學研究

1)血漿樣品處理

將每個取血點的血漿樣品置于肝素潤濕的離心管中，10000r/min高速離心10min，取出血漿樣品(上層)100μl置于新的離心管中，并向其中加入15μl內標溶液(dox：50μg/ml)，再向其中加入200μl甲醇溶液，混勻并渦旋振搖5min，用15000r/min低溫(4℃)離心10min，取出上清液進液相進行分析(單次進樣20μl)。

2)色譜條件

色譜柱為watersmaterialsc18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；以己烷磺酸鈉溶液(取己烷磺酸鈉7.53g與乙二胺四醋酸二鈉3.72g，加0.08mol/l醋酸溶液使溶解并稀釋至1000ml，用氨溶液調節ph值至4.3)為流動相a；以甲醇-乙腈(7:3)為流動相b，按進行線性梯度洗脫，檢測波長為291nm。

3)專屬性考察

取出100μl空白血漿，按照1)的血漿樣品處理方法處理，并進樣20μl記錄色譜圖得到的色譜圖如圖12。取出100μl空白血漿，向其中加入內標dox溶液15μl和pym標準溶液100μl，按照如上1)的血漿樣品處理方法處理并進樣20μl記錄色譜圖得到的色譜圖如下圖13。從這兩個圖可以看出，內標dox的保留時間為10.79min左右，pym的出峰時間為7.16min左右。血漿中的內源性物質對于pym和dox的測定并不干擾。

4)標準曲線

取pym約10mg于100ml容量瓶中，精密稱重，蒸餾水定容至刻度，稀釋得到濃度分別為10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的系列溶液，根據1)項下的血漿處理方法處理樣品。根據2)項下的色譜條件檢測樣品濃度。得到標準曲線如圖14，縱坐標用apym/a內表示，橫坐標用c表示，標準曲線的線性方程為apym/a內＝0.0795c-0.2809(r＝0.9991)，定量限為10ng，檢測限為3ng。

5)精密度試驗

分別精密量取100μl大鼠空白血漿，并分別向其中加入不同量(高，中，低)的pym的標準儲備溶液，將其制備成高、中、低(10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)三種不同濃度，然后按照1)血漿樣品處理方法進行樣品處理，再進行液相分析，在一天之內重復測定五次，最后計算日內精密度；連續測定五天，每天測定一次，然后計算此方法的日間精密度。日內及日間精密度rsd(％)均小于5％，因此，可采用該法對pym進行測定。同樣的方法處理pym得到的日間日內精密度檢測結果rsd(％)均小于5％，因此，可采用此法測定血漿樣品中的pym的濃度。

6)穩定性試驗

用大鼠的空白血漿和pym儲備液配制濃度分別為10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml的pym樣品。然后分別在室溫(放置0h，2h，4h，6h和8h)；凍融(凍融1，2，3次)條件下進行穩定性試驗。結果表明，在室溫和凍融兩種條件下，穩定性試驗的rsd≤5％。因此在大鼠血漿樣品的處理、儲存、進樣等過程中，樣品的穩定性均不會受到影響。

7)回收率試驗

取100μl大鼠空白血漿將pym儲備液分別稀釋成濃度為10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml三種樣品，按照1)項下的操作進行血漿樣品處理，進行分析，將得到的數據代入標準曲線，計算濃度，以最后所得的測量值/理論值作為方法回收率，pym方法回收率均大于85％，且rsd均小于5％，所以上述方法符合生物樣品方法學考察的要求。

8)pcpgp制劑組口服給藥研究

將試驗用的250±20g的sd大鼠，在溫度25℃左右的條件下，每日自由飲食飲水，喂養7天左右，試驗前將大鼠分為3組，每組6只，在給藥的前12h禁食，給藥劑量為60mg/kg，其中a組口服灌胃給予pym原料藥，b組灌胃給予go-pym，c組給予pcpgp。三組大鼠在灌胃給藥后，分別于時間點0.083h、0.167h、0.25h、0.333h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采用眼眶靜脈取血，每次取血量至少為0.5ml，置于經肝素鈉潤濕后的離心管中，立即離心，在溫度為4℃下，10000rpm，離心10min，取出上層分離出的血漿樣品，并儲存在-20℃的冰箱中待測，含量測定時按照1)樣品處理方法進行處理并分析。

9)試驗結果

將pym原料藥，go-pym，pcpgp制劑組分別對大鼠進行灌胃后，三者的血藥濃度隨著時間的變化如圖15，藥動學參數如表5。由圖表可知，auc大小依次為paa-cys/pah-go-pym>go-pym>pym，通過聚電解質與藥物的結合，將pym的auc值由88.72增加到了154.29，t1/2由2.559h增加到3.078h，使得藥物的體內釋放時間得到提高。

表5pym，go-pym和pcpgp的藥動學參數

本實施例的抗癌藥物平陽霉素(pym)也可以替換成阿霉素(dox)或紫杉醇(ptx)或阿法替尼(af)，制成相應的聚電解質修飾的氧化石墨烯抗癌藥物制劑。