一種用于治療軟骨疾病的脂質體遞送系統及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種用于治療軟骨疾病的脂質體遞送系統及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 印度刺猜蛋白（IndianHedgehog,Ihh)與創傷性骨關節炎（Post-traumatic osteoarthritis,PT0A)相關，在膝關節前交叉韌帶（AnteriorCruciateLigament,ACL) 損傷的早期階段Ihh表達增高，而ACL損傷后最終將發展成為PT0A。在動物實驗中，運用條 件性基因敲除小鼠敲除成年小鼠關節軟骨中的Ihh基因能夠減緩ACL損傷導致PTOA的發 生降低。因此，敲除Ihh基因可以作為一個靶向基因來治療PT0A。然而，目前的Ihh基因敲 除技術無法運用轉基因小鼠以外的其他動物及人體PTOA的治療，并且化學的Ihh抑制劑能 夠產生嚴重的毒副作用，包括：前腦無裂畸形、唇腭裂、肢體發育障礙等。因此，目前非常有 必要找到一種安全有效的方法敲除關節軟骨內Ihh基因來治療PT0A。
[0003] 關節軟骨表層非常致密，由軟骨細胞和細胞外基質組成，而后者主要由II膠原 和被其包繞的蛋白多糖組成。一些臨床I-III期的實驗研究證實通過RNA干擾的方式 沉默特定的基因能夠對人體疾病起到有效的治療作用（PignatelloR,SarpietroMG, CastelliF.Synthesisandbiologicalevaluationofanewpolymericconjugate andnanocarrierwithosteotropicproperties.JFunctBiomaterMarch2012; 3(1) :79-99.ZhangG,GuoB,WuH,TangT, ZhangBTjZhengL,HeY, YangZ,PanX, ChowH,ToKjLiY,LiD，WangX，WangY，LeeK，HouZ,DongN，LiG，LeungK， HungL，HeF，ZhangL，QinLAdeliverysystemtargetingboneformationsurface tofacilitateRNAi-basedanabolictherapy.NatMed2012; 18(2) :307_14)D 然而， 鑒于關節軟骨的組織結構特點，其表面又帶有大量負電荷，單獨的siRNA不能進入軟骨細 胞內，目前尚缺乏有效并且安全的軟骨siRNA遞送系統，限制了RNAi在治療軟骨疾病中的 應用。
[0004] 脂質體具有良好的生物相容性，已被廣泛用作藥物載體，能夠使包封的藥物具有 較好的穩定性，并且在一定程度上能夠降低藥物的毒副作用。在骨組織領域運用比較成熟 的是一種脂質體納米遞送系統（LipidNanoparticle,LNP)，它為骨革E向脂質體（ZhangG, GuoB,WuH,TangT,ZhangBT,ZhengL, HeY, YangZ,PanX, ChowH, ToK, Li Y,LiD,WangX,WangY,LeeK,HouZ, DongN,LiG,LeungK, HungL,HeF, ZhangL,QinLAdeliverysystemtargetingboneformationsurfacetofacilitate RNAi-basedanabolictherapy.NatMed. 2012; 18(2) :307_14)，但由于骨組織與軟骨組 織是不同的組織，這類脂質體納米遞送系統的脂質體上面攜帶骨靶向分子，能夠定向地將 脂質體與骨組織結合，而無法與骨以外的組織結合，因此這類脂質體納米遞送系統并不能 運用于軟骨組織。
[0005] 申請號為201110156949. 7,名稱為基于小核酸藥物成骨治療的骨靶向遞送系統及 其制備方法的發明專利，提供了一種基于小核酸藥物成骨治療的骨靶向遞送系統及其制備 方法。該骨靶向遞送系統包括脂質體、骨靶向分子和小核酸藥物，所述骨靶向分子選自雙磷 酸鹽、8個天門冬氨酸多肽重復序列、6個天門冬氨酸-絲氨酸-絲氨酸多肽重復序列和針 對成骨樣細胞篩選出的適配子中的一種或幾種，所述小核酸藥物選自具有促進骨形成功能 的小干擾核糖核酸、微小核糖核酸的模擬物和微小核糖核酸的阻斷劑中的一種或幾種。本 發明相比傳統的骨靶向遞送系統具有更強的專屬性和特異性，小核酸藥物轉染效率高，能 夠達到較高的沉默效率。而該專利所制備的骨靶向遞送系統是脂質體肌肉注射或者靜脈注 射，然后脂質體通過靶向分子將脂質體帶入骨組織，從而作用于骨組織，但是該骨靶向遞送 系統無法將脂質體靶向進入軟骨組織中。
【發明內容】
[0006] 本發明為了解決目前缺乏有效并且安全的軟骨SiRNA遞送系統，限制了RNAi在治 療軟骨疾病中的應用，提供了一種用于治療軟骨疾病的脂質體遞送系統及其制備方法。
[0007] 本發明由如下技術方案實現的：一種用于治療軟骨疾病的脂質體遞送系統， 包括脂質體、脂質體修飾物和小核酸藥物，所述脂質體為磷脂酰膽堿DPPC、膽固醇、 Dlin-KC2-DMA;所述脂質體修飾物為聚乙二醇脂質共輒物C-PEG，所述小核酸藥物為Ihh siRNA;所述磷脂酰膽堿DPPC濃度為35mg/ml，占脂質體和脂質體修飾物的質量百分比為 11. 72% ;膽固醇濃度為9. 5mg/ml，占脂質體和脂質體修飾物的質量百分比為23. 85% ;聚乙 二醇脂質共輒物C-PEG濃度為50mg/ml，占脂質體和脂質體修飾物的質量百分比為16. 74% ; Dlin-KC2-DMA的濃度為28. 5mg/ml，占脂質體和脂質體修飾物的質量百分比為47. 69%。所 述小核酸藥物的靶序列為SEQIDNO:2,即IhhsiRNA的第1708-1734位堿基序列。
[0008]所述IhhsiRNA在Genebank中SequenceName:ACCNM_053384. 1，喊基序列為 SEQIDNO:1，其正義鏈為：5 '-rGrArArGrGrArGrCrCrUrGrGrArUrGrUrCrCrUrUrGrCrCAC _3' ；反義鏈為：5'-rGrUrGrGrCrArArGrGrArCrArUrCrCrArGrGrCrUrCrCrUrUrCrCrC-3'； 本發明選用IhhsiRNA堿基序列中第1708-1734位堿基序列作為靶序列。
[0009] 用于治療軟骨疾病的脂質體遞送系統的制備方法包括以下步驟： (1) 混合脂質體：將2ul磷脂酰膽堿DPPC、15ul膽固醇、2ul聚乙二醇脂質共輒物、 IOul的Dlin-KC2-DMA混合，然后加入乙醇將脂質體溶解，形成A液； (2) 將20uM、IOul的IhhsiRNA加入55ul的檸檬酸鹽緩沖液，形成B液； (3) 將A液加入B液中混合均勻，形成AB混合液； (4) 在AB混合液中加入400ul的PBS緩沖液洗滌，然后在超濾離心管中12000r離心 5min； (5) 用PBS重復洗滌離心3次，離心后所獲得的80-100ul液體即為軟骨siRNA脂質體 遞送系統。
[0010] 所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為50mM，pH為4。
[0011] 本發明修飾了脂質體納米為基礎的軟骨RNA干擾遞送系統（LipidNanoparticle (LNP)-basedcartilageRNAiDeliverySystem)。包裝形成LNP-siRNA復合物系統，此復 合物帶有正電荷，并且安全、體積小能夠分布到全層軟骨組織中。本發明把包含有siRNA的 脂質體注射入關節腔內，利用陰陽電荷相互吸引而將脂質體變相地靶向遞送入關節軟骨細 胞，成功敲除軟骨細胞內的Ihh基因。本發明安全有效的敲除關節軟骨內Ihh基因，可以作 為一個靶向基因來治療PTOA。通過載體實驗證實，修飾后的LNP能夠將Ihh-siRNA遞送入 軟骨細胞，成功敲除軟骨細胞內的Ihh基因。突破了軟骨組織中基因敲除的瓶頸，解決了這 一難題。本發明安全有效的敲除關節軟骨內Ihh基因，可以作為一個靶向基因來治療PTOA。
[0012] 本發明所述的脂質體米用的是通用脂質體，可以遞送任何siRNA，siRNA是一種小 RNA分子，不同的蛋白均可通過其相應的siRNA將此蛋白的基因敲除，使得這個蛋白不表 達