紫杉醇-油酸小分子前藥自組裝納米粒的構建的制作方法

紫杉醇-油酸小分子前藥自組裝納米粒的構建的制作方法
【專利摘要】本發明設計合成了一系列紫杉醇?油酸小分子前藥，通過使用對氧化還原環境敏感的化學連接臂，促進藥物在腫瘤細胞內快速釋放。在此基礎上，制備了小分子前藥自組裝納米藥物傳遞系統。這些小分子前藥納米藥物傳遞系統的優勢在于：采用一步納米沉淀的方法，制備工藝簡單，易于產業化；粒徑小且均勻（~100 nm），易于通過EPR效應富集于腫瘤部位；超高的載藥量，有利于減小因輔料和生物材料而引發的不良反應；易于表面修飾，可通過PEG和主動靶向修飾以有效避免網狀內皮系統攝取和提高腫瘤細胞對納米粒的攝取；借助化學鏈接臂對腫瘤細胞氧化還原微環境的敏感性，實現紫杉醇在腫瘤部位的特異性釋藥，提高療效并降低毒副作用。
【專利說明】
紫杉醇-油酸小分子前藥自組裝納米粒的構建
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物制劑新輔料和新劑型領域，包括多個紫杉醇-油酸前藥的合成及 系列紫杉醇-油酸小分子前藥自組裝納米粒的構建，以及其在藥物傳遞中的應用。
【背景技術】
[0002] 紫杉醇(Paclitaxel ,ΡΤΧ)作為一線抗癌藥已經被廣泛應用于臨床中。由于紫杉醇 的水溶性很差，市售的溶液劑(泰素)是用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作為增溶劑和助溶劑將其 溶解而應用于臨床。正因如此，泰素會引起很嚴重的輔料相關的毒副作用，極大地限制了其 在臨床的應用。近年來，基于納米技術的新型藥物傳遞系統備受關注，有很多納米藥物傳遞 系統被構建起來用于紫杉醇的遞藥。其中，有一些已經被應用于臨床實踐中，包括紫杉醇脂 質體、紫杉醇白蛋白納米粒、紫杉醇納米膠束以及紫杉醇-聚合物前藥等。盡管納米技術極 大地改善了紫杉醇的成藥性，但這些新型納米制劑也存在一些缺陷，包括:載體相關的毒 性、載藥量低(一般不足10%)、穩定性差、藥物在儲存過程中易泄漏、結晶等。因此，如何設 計一種高效低毒的藥物傳遞系統用于紫杉醇的傳遞仍然是研究的熱點。
[0003] 前體藥物也被廣泛研究用來克服紫杉醇的成藥性差問題。其中，關于紫杉醇的不 飽和脂肪酸前藥的研究取得了很大的進展。例如：紫杉醇-二十二碳六烯酸前藥(PTX-DHA) 已經進入了臨床III期研究。然而，最新的臨床結果顯示，與現存的化療藥物相比，PTX-DHA 的療效并沒有展現出優勢。分析PTX-DHA的結構，我們發現紫杉醇和二十二碳六烯酸是通過 酯鍵相連的，這可能會導致紫杉醇很難從前藥上斷裂下來，進而導致其療效不佳。

【發明內容】

[0004] 針對這一問題，我們設計了一系列紫杉醇-油酸前藥，紫杉醇和油酸是通過一系列 氧化還原敏感的化學連接臂連接在一起，這些氧化還原敏感的化學連接臂在腫瘤細胞內的 高氧化還原環境中能快速斷裂，釋放出藥物。令人驚喜的是，我們發現這些小分子疏水性前 藥能自組裝形成均勻的前藥納米粒。在這些小分子前藥納米系統中，由于前藥自身既作為 載體材料又作為被包載的藥物，其載藥量非常高，超過了 50%。如此高的載藥量在所有紫杉 醇納米制劑中極為罕見。在此基礎上，比較了氧化還原敏感的化學連接臂對紫杉醇釋放速 率及其對抗腫瘤效果的影響。
[0005] 基于此，本發明設計構建了一系列氧化還原敏感的紫杉醇-油酸小分子前藥納米 粒，并對其進行了 PEG修飾，賦予其在血液中的長循環特性，將其應用于抗腫瘤研究。
[0006] 本發明的目的是設計和合成一系列氧化還原敏感的紫杉醇-油酸小分子前藥，制 備前藥自組裝納米藥物傳遞系統，并比較不同化學連接臂(酯鍵和氧化還原敏感鍵)對藥物 釋放速率和抗腫瘤效果的影響。
[0007] 本發明通過以下技術方案實現上述目的：
[0008] 本發明所述的紫杉醇-油酸小分子前藥包括(a)酯鍵相連的紫杉醇-油酸前藥、（b) 單硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥、（c)間隔二硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥和(d)二硫鍵 相連的紫杉醇-油酸前藥，其結構如下：
[0010] 本發明提供的系列紫杉醇-油酸小分子前藥合成方法，包括如下步驟：
[0011] (1)酯鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成:油酸在DCC和DMAP的催化下，與紫杉醇在 N2保護下反應，分離純化即得；
[0012] (2)氧化還原雙敏感的單硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成:油酸在對甲苯磺 酸催化下，與乙二醇反應，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt和EDCI的催化下，與2， 2硫代二乙酸酐反應，得(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸，（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸在HOBt和EDCI的催化下，與紫杉醇反應，分離純 化即得，反應全程都在他保護下進行，乙二醇也可以用乙二胺替代；
[0013] (3)氧化還原雙敏感的間隔二硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成:油酸在對甲 苯磺酸催化下，與乙二醇反應，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt和EDCI的催化下， 與1，2-亞乙基二硫代二乙酸酐反應，得(2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基） 乙硫基）乙酸，（2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸在HOBt和 EDCI的催化下，與紫杉醇反應，分離純化即得，反應全程都在犯保護下進行，乙二醇也可以 用乙二胺替代；
[0014] (4)還原敏感的二硫鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成：油酸在對甲苯磺酸催化 下，與乙二醇反應，得油酸-乙二醇酯，油酸-乙二醇酯在HOBt、EDCI和DMAP的催化下，與2， 2'-二硫代二乙酸酐反應，得(2-氧代-2-(2-(⑵-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸，（2-氧 代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸在HOBt和EDCI的催化下，與紫杉醇反應， 分離純化即得，反應全程都在他保護下進行，乙二醇也可以用乙二胺替代。
[0015] 本發明提供的小分子前藥自組裝納米粒的制備方法如下：
[0016] 將一定量的小分子前藥溶解到適量的乙醇中，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到 水中，前藥自發形成均勻的納米粒。
[00?7 ]所述的小分子前藥納米粒可以為非PEG化的小分子前藥納米粒、PEG修飾的小分子 前藥納米粒、包載疏水性熒光物質或藥物的小分子前藥納米粒和主動靶向的小分子前藥納 米粒。
[0018] (1)非PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的制備方法:將一定量的前藥溶解到適量 的乙醇中，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到水中，前藥自發形成均勻的納米粒。
[0019] (2)PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的制備方法:將一定量的TPGS2_前藥溶 解到適量的乙醇中，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到水中，前藥自發形成均勻的納米粒。
[0020] (3)包載疏水性熒光物質或藥物的小分子前藥自組裝納米粒的制備方法:將一定 量的TPGS 2k、香豆素-6或DiR以及前藥溶解到適量的乙醇中，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加 到水中，前藥自發形成均勻的納米粒。
[0021] (4)主動靶向的小分子前藥自組裝納米粒的制備方法：將一定量的TPGS2k、DSPE-PEG-AA以及前藥溶解到適量的乙醇中，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到水中，前藥自發形 成均勾的納米粒。
[0022] 本發明的脂肪酸-紫杉醇小分子前藥首次被發現可以自組裝形成均勻的納米體 系。該納米藥物傳遞系統的優勢在于：（1)采用一步納米沉淀的方法，制備工藝簡單，易于產 業化；（2)粒徑小且均一(~100nm)，有利于納米粒通過EPR效應富集于腫瘤部位；（3)超高的 載藥量，有利于減小因輔料和生物材料而引發的不良反應；⑷易于表面修飾，可通過PEG和 主動靶向修飾以有效避免網狀內皮系統攝取和提高腫瘤細胞對納米粒的攝取；（5)通過鏈 接臂對腫瘤部位細胞內環境的敏感性，實現紫杉醇在腫瘤細胞內的特異性釋藥，提高療效 的同時降低毒副作用。
[0023] 本發明具有以下有益效果：1.設計合成了一系列新的紫杉醇-油酸小分子前藥，合 成方法簡單易行；2.通過設計和對比不同化學連接臂，能有效促進紫杉醇在腫瘤細胞內從 前藥中快速被水解釋放出來;3.制備了均勻的小分子前藥自組裝納米粒，制備方法簡單易 行，穩定性好，載藥量高;4. PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒能有效延長藥物在血液中 的循環時間；5.所制備的小分子前藥自組裝納米粒具有良好的抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明實施例1的酯鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(ΡΤΧ-0Α)的1HNMR譜圖。
[0025] 圖2為本發明實施例2的單硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-S-0A)的1HNMR譜 圖。
[0026] 圖3為本發明實施例3的間隔二硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-2S-0A)的 ^NMR譜圖。
[0027]圖4為本發明實施例4的二硫鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-S-S-0A)的1HNMR譜 圖。
[0028]圖5為本發明實施例6的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的透射電子顯微鏡 圖。
[0029] 圖6為本發明實施例9的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的粒徑-存儲時間圖。
[0030] 圖7為本發明實施例10的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的體外釋放試驗圖。
[0031 ]圖8為本發明實施例11的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的細胞毒性圖。
[0032]圖9為本發明實施例12的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的細胞攝取圖。
[0033]圖10為本發明實施例13的小分子前藥自組裝納米粒的血藥濃度-時間曲線圖。 [0034]圖11為本發明實施例14的PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的組織分布圖。
[0035] 圖12為本發明實施例15的PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的在體抗腫瘤實驗腫 瘤體積變化圖。
[0036] 圖13為本發明實施例15的PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的在體抗腫瘤實驗裸 鼠體重變化圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將發明限制在所述的實施 例范圍之中。
[0038] 實施例1:酯鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(ΡΤΧ-0Α)的合成
[0039] 油酸(0A)溶于少量二氯甲烷中，在DCC和DMAP的催化作用下，在犯保護下，冰浴2-4h，然后與紫杉醇在25°CN2保護下反應24-48h，經分離純化得到白色粉末前藥。采用核磁共 振測定h-NMR氫譜來確定實施例1中前藥的結構，選用的溶劑為CDC13，結果如圖1，波譜解析 結果如下：
[0040] 咕-匪1?(4001抱，0)(：13)3:8.13(七，2!〇,7.74((1，2!〇,7·61(ι?，lH)，7.59(m，3H)，7.42 (d，4H)，7.40(m，3H)，6.87((1, lH，J = 9.2Hz，-NH_)，6.29(t，2H，10-H，13-H)，5.95(dd，lH，J = 3.2Hz ,J = 6.0Hz,3,-H) ,5.69(d,lH ,J = 7.2Hz,2-H) ,5.50(d,lH ,J = 3.2Hz,2,-H),5.34 (m,2H,-CH=CH-),4.98(d,lH ,J = 8.0Hz,5-H),4.45(t,lH,7-H),4.31(d,lH ,J = 8.4Hz,20 a-H),4.21(d,lH,J = 8.4Hz,2O0-H) ,3.83(d,lH,J = 6.8Hz,3-H) ,2.52-2.64(m,lH,6a-H), 2.46(s,3H,4-C0CH3) ,2.39(m,2H,14a-H,14g-H) ,2.35(t,2H,J = 7.5Hz,-CH2C0-) ,2.23(s, 3H,10-C0CH3),2.00(s,4H,-CH2CH=CHCH2-),1.95(s,3H,18-H),1.89(t,lH,6g-H),1.68(s, 3H,19-H),1.58(t,2H,-CH 2CH2C0-),1.23(t,23H,17-H) ,1.13(s,3H,16~H) ,0.88(t,3H,J = 6.4Hz,-CH3)〇
[0041] 實施例2:氧化還原雙敏感的單硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-S-OA)的合成 [0042]將乙二醇置于50mL三頸瓶中，向茄形瓶中加入適量對甲苯磺酸，N 2保護，加熱到 100-120°C，將用適量甲苯溶解的油酸溶液緩慢滴注到反應瓶中，反應2-4h。反應結束后，靜 置分層，用甲苯萃取至乙二醇層TLC無產物點，合并甲苯層，然后用飽和NaHC0 3溶液洗至中 性，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(Z)-油酸-2-羥乙基酯。將適量的2,2'_硫代 二乙酸酐和少量的三乙胺置于25mL茄形瓶中，加入10-15mLCH 2Cl2,加入HOBt和EDCI，N2保護 條件降溫到〇°C下，緩慢滴加溶解在CH 2C12的（Z)-油酸-2-羥乙基酯，攪拌0.5-lh，室溫過夜 反應。反應結束后，蒸干，稀鹽酸酸化，CH 2C12萃取至水層TLC無產物點，飽和NaCl溶液洗 CH2C12層三次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(2-氧代-2-(2-((Z)_油酰氧基） 乙氧基）乙硫基）乙酸。將（2-氧代-2-(2-((Z)_油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸、EDCI、H0Bt 和紫杉醇置于10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保護條件降溫到0°C下，攪拌0.5-lh，室 溫過夜反應。反應結束后，飽和NaCl溶液洗CH 2C12層三次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分 離純化得白色固體。
[0043] 采用核磁共振測定1H-NMR氫譜來確定實施例2中前藥的結構，選用的溶劑為CDC13， 結果如圖2,波譜解析結果如下：
[0044] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.15(12^ = 8.5?)，7.77(q，2H，J = 7.3Hz)，7·62(ι?， lH)，7.52(m，3H)，7.42(d，4H)，7.40(s，lH)，7.37(d，2H)，6.30(s，lH，10-H)，6.26(s，lH，13-H) ,6.06(dd,lH ,J = 3.2Hz ,J = 6.4Hz,3,-H) ,5.70(d,lH ,J = 7.1Hz,2-H) ,5.50(d,lH ,J = 3.1Hz，2'-H)，5.33-5.34(m，2H，-CH = CH-)，4.79(d，lH，J = 2.4Hz，5-H)，4.43(q，lH，7-H), 4.30(d,lH ,J = 6.0Hz,20a-H) ,4.26~4.29(m,4H,-〇CH2CH2〇-) ,4.25(d, 1H, J= 10.8Hz , 20g-H),3.83(d,lH ,J = 7Hz,3-H),3.17-3.53(m,4H,-CH2-S-CH2-),2.51-2.60(m,lH,6a-H),2.48 (s,3H,4-C0CH 3) ,2.33(m,2H,14a-H,14g-H),2.28(t,2H,J = 7.5Hz,-CH2C0-),2.23(s,3H, 10-COCHs), 2.01 (s, H4, J = 7.5Hz , ~CH2CH=CHCH2~, CH3CN), 1.95(d, 3H, 18~H), 1.89 (t, 1H, 6 g-H) ,1.69(s,3H,19~H) ,1.62(dd,2H,J = 7.2Hz,J = 8.4Hz,-CH2CH2C0-) ,1.26(t,25H,17~ H)，1.14(s，3H，16-H)，0.88(t，3H，J = 6.7Hz，-CH3)。
[0045] 實施例3:氧化還原雙敏感的間隔二硫醚鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-2S-0A) 的合成
[0046]將乙二醇置于50mL三頸瓶中，向茄形瓶中加入適量對甲苯磺酸，N2保護，加熱到 100-120°C，將用適量甲苯溶解的油酸溶液緩慢滴注到反應瓶中，反應2-4h。反應結束后，靜 置分層，用甲苯萃取至乙二醇層TLC無產物點，合并甲苯層，然后用飽和NaHC0 3溶液洗至中 性，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(Z)-油酸-2-羥乙基酯。將適量的1，2-亞乙 基二硫代二乙酸酐和少量的三乙胺置于25mL茄形瓶中，加入10-15mL CH2C12,加入HOBt和 EDCI，犯保護條件降溫到0°C下，緩慢滴加溶解在012(：12的（Z)-油酸-2-羥乙基酯，攪拌0.5-lh，室溫過夜反應。反應結束后，蒸干，稀鹽酸酸化，CH 2C12萃取至水層TLC無產物點，飽和 NaCl溶液洗CH2C12層三次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(2-( 2-氧代-2-( 2-((Z)-油酰氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸。將（2-(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧 基）乙硫基）乙硫基）乙酸、EDCI、H0Bt和紫杉醇置于10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保 護條件降溫到0 °C下，攪拌0.5-lh，室溫過夜反應。反應結束后，飽和NaCl溶液洗CH2C12層三 次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得白色固體。
[0047] 采用核磁共振測定1H-NMR氫譜來確定實施例3中前藥的結構，選用的溶劑為CDC13， 結果如圖3,波譜解析結果如下：
[0048] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.14((1,2^ = 7.2?)，7.74(d，2H，J = 8.5Hz)，7.61(t， 1H,J = 7.4Hz) ,7.51(q,3H) ,7.35-7.43(m,7H) ,7.08(d,lH,J = 9.2Hz,-NH-) ,6.30(s,lH, 10-H),6.26(d,lH ,J = 8.6Hz,13-H),6.02(dd,lH ,J = 3.0Hz ,J = 6.4Hz,3,-H),5.68(d,lH ,J = 7.0Hz,2-H),5.56(d,lH ,J = 3.1Hz,2,-H),5.32-5.36(m,2H,-CH = CH-),4.99(d,lH ,J = 8.0Hz,5-H),4.45(dd,lH ,J = 6.5Hz ,J = 4.2Hz,7-H) ,4.31 (d, 1H ,J = 8.4Hz , 2〇a-H) ,4.23-4.25(s,4H,-〇CH2CH2〇-) ,4.22(d, 1H ,J = 8.4Hz , 20β-Η), 3.83(d, 1H ,J = 7.0Hz , 3-H), 3.33 (s,2H,-⑶CH2-S-CH2CH2-S-CH2CO-) ,3.16(d,2H,J=1.7Hz,-COCH2-S-CH2CH2-S-CH2CO-), 2.79(d,4H,J = 4.6Hz,-S-CH2CH2-S-) ,2.52-2.60(m,lH,6a-H),2.46(s,3H,4-C0CH3),2.38 (q,lH,14a-H),2.31(t,2H,J = 7.3Hz,-CH2C0-),2.23(s,3H,10-C0CH3) ,2.00(m,4H,-CH2CH = CHCH2~) , 1,94(s,3H,18-H),1.89(t,lH,60-H),1.94(s,6H,19-H),1.60(t,4H,-CH2CH 2C0-),1.24-1.29(m,25H,17-H),1.14(s,3H,16-H),0.88(t,3H,J=6.8Hz,-CH3)〇
[0049] 實施例4:還原敏感的二硫鍵鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-S-S-0A)的合成
[0050] 將乙二醇置于50mL三頸瓶中，向茄形瓶中加入適量對甲苯磺酸，N2保護，加熱到 100-120°C，將用適量甲苯溶解的油酸溶液緩慢滴注到反應瓶中，反應2-4h。反應結束后，靜 置分層，用甲苯萃取至乙二醇層TLC無產物點，合并甲苯層，然后用飽和NaHC0 3溶液洗至中 性，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(Z)-油酸-2-羥乙基酯。將適量的2,2'_二硫 代二乙酸酐置于25mL茄形瓶中，加入10-15mL CH2C12,加入H0Bt、EDCI和DMAP作為催化劑，N2 保護條件降溫到〇°C下，緩慢滴加用CH2C12溶解的（Z)-油酸-2-羥乙基酯，攪拌0.5-lh，室溫 過夜反應。反應結束后，蒸干，稀鹽酸酸化，CH 2C12萃取，飽和NaCl溶液洗CH2C12層三次，無水 硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得(2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基） 乙酸。將（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酰氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸、EDCI、H0Bt和紫杉醇置于 10mL茄形瓶中，加入3-5mL CH2C12，N2保護條件降溫到0°C下，攪拌0.5-lh，室溫過夜反應。反 應結束后，飽和NaCl溶液洗CH 2C12層三次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干，經分離純化得白色 固體。
[0051] 采用核磁共振測定1H-NMR氫譜來確定實施例4中前藥的結構，選用的溶劑為CDC13， 結果如圖4,波譜解析結果如下：
[0052] 4-^^(40010^,00(:13)3:8.14((1,2^ = 7.2?)，7.76(d，2H，J = 8.8Hz)，7·62(ι?， lH)，7.52(m，3H)，7.33-7.43(m，7H)，6.99(s，lH，-NH-)，6.30(s，lH，10-H)，6.25(m，lH，13-H)，6.02((1, lH，J = 8.4Hz，3'-H)，5.69(d，lH，J = 7.2Hz，2-H)，5.52(s，lH，2'-H)，5.34(s， 2H，-CH = CH-)，4.96(d，lH，J = 9.6Hz，5-H)，4.44(q，lH，7-H)，4.31(d，lH，J = 8.8Hz，20a-H) ,4.27(d,4H,J = 6.4Hz,-QCH2CH2〇-) ,4.22(d,lH,J = 9.2Hz,20g~H) ,3.82(d,lH,J = 7.6Hz,3-H),3.65(s,2H, -S-SCH2CO-PTX ),3.49(s,2H, -COCH2-S-S-CH2CO-PTX ),2.56(m,lH, 6a~H) ,2.45(s,3H,4-C0CH3) ,2.30(t,2H,J = 6.4Hz,-CH2C0-) ,2.17(s,3H,10-C0CH3),2.01 (d,4H,-CH2CH = CHCH2-) ,1.94(s,3H,18~H) ,1.69(s,3H,19~H) ,1.55(s,26H,-CH2CH2C0-, H2〇),1.26(d,23H,17-H),1.14(s,3H,16-H),0.88(s,3H,-CH3)〇
[0053] 實施例5:非PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的制備
[0054]精密稱取前藥8mg，用lmL乙醇將其溶解，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到4mL去 離子水中，自發形成均勻的納米粒(ΡΤΧ-0Α納米粒，PTX-S-0A納米粒，PTX-2S-0A納米粒， PTX-S-S-0A 納米粒)。
[0055]實施例6: PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的制備
[0056] 精密稱取TPGS2k 1.4mg和前藥8mg，用lmL乙醇將其溶解，攪拌下，將該乙醇溶液緩 緩滴加到4mL去離子水中，自發形成均勻的納米粒(PTX-〇A/TPGS2k納米粒，PTX-S-〇A/TPGS 2k 納米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒，PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒）。
[0057]通過透射電子顯微鏡測定實施例6中制備的小分子前藥自組裝納米粒的粒徑和形 態，結果如圖5,透射電鏡圖表明載藥納米粒為均一的球形，粒徑在100nm左右。
[0058]實施例7:包載香豆素-6或DiR的小分子前藥自組裝納米粒的制備
[0059] 精密稱取TPGS2k 1.4mg、香豆素-6 0.8yg或DiR 0.8mg和前藥8mg，用lmL乙醇將其 溶解，攪拌下，將該乙醇溶液緩緩滴加到4mL去離子水中，自發形成均勻的納米粒。
[0060]實施例8:主動靶向的小分子前藥自組裝納米粒的制備
[0061 ] 精密稱取TPGS2k 0.7mg、DSPE-PEG-AA 0.7mg和前藥8mg，用lmL乙醇將其溶解，攪拌 下，將該乙醇溶液緩緩滴加到4mL去離子水中，自發形成均勻的納米粒。
[0062]實施例9 :PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的膠體穩定性試驗 [0063] 將實施例6中制備的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒PTX-〇A/TPGS 2k納米粒， PTX-S-〇A/TPGS2k 納米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k 納米粒，和 PTX-S-S-〇A/TPGS2k 納米粒（2 · Omg/ mL)在4°C條件下儲存3個月。在此期間，通過動態光散射測定其粒徑變化。結果如圖6所示， PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒在三個月內粒徑無明顯變化，顯示出良好的長期儲存 穩定性。
[0064]實施例10 :PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的體外釋放試驗 [0065]以含乙醇的pH 7.4磷酸鹽緩沖液為釋放介質，考察PEG修飾的小分子前藥自組裝 納米粒的體外釋放情況。將實施例6中制備的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒(紫杉醇 含量為200mg)加入到30mL釋放介質中，在37°C條件下，于設定的時間點取樣，通過高效液相 色譜測定紫杉醇濃度。向釋放介質中加入一定濃度的雙氧水(H 2〇2)或二硫蘇糖醇(DTT)，以 分別考察納米粒在氧化條件和還原條件下的釋放情況。
[0066]結果如圖7所示，酯鍵相連的紫杉醇-油酸前藥(PTX-0A)具有極高的穩定性，無論 是否存在H2〇2和DTT，PTX-〇A/TPGS2k納米粒幾乎不發生水解，PTX很難從前藥上釋放出來。相 比之下，PTX-S-0A，PTX-2S-0A和PTX-S-S-0A具有一定程度的氧化或還原敏感性。當釋放介 質中含有一定濃度的DTT時，PTX-S-S-〇A/TPGS 2k納米粒在2小時內釋放了超過90 %的PTX， PTX-S-〇A/TPGS2k納米粒在48小時內釋放了 50 %的PTX，PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒在48小時 之內只釋放了 26% 的 PTX。各前藥還原敏感性:PTX-S-S-0A>PTX-S-0A>PTX-2S-0A>PTX-0A。 同時，PTX-S-0A，PTX-2S-0A還具有一定程度的氧化敏感性。當釋放介質中含有一定濃度的 H2〇2時，PTX-S-0A在6小時內釋放了超過90 %的PTX，PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒在12小時釋放 出46%的PTX。實驗結果表明本發明設計的系列紫杉醇-油酸小分子前藥具有氧化還原敏感 釋藥的特性，能對腫瘤部位特異的氧化還原環境作出響應，實現腫瘤部位特異性釋藥，有望 提高紫杉醇的抗腫瘤效果并降低對機體的毒副作用。
[0067]實施例11 :PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的細胞毒性 [0068]采用MTT法考察PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒對人鱗狀上皮癌細胞(KB-3-1)，人大細胞肺癌細胞(H460)和人卵巢癌細胞(0VCAR-8)的細胞毒性。將狀態良好的細胞消 化，用培養液稀釋至5000cell S/mL細胞密度，吹勻后于96孔板中每孔加入細胞懸液100yL， 置培養箱中孵育24h使其貼壁。待細胞貼壁后加泰素或實施例6中制備的PTX-S-〇A/TPGS 2k納 米粒，PTX-2S-0A/TPGS2k 納米粒，PTX-S-S-〇A/TPGS2k 納米粒和 PTX-〇A/TPGS2k 納米粒。本實驗 中藥物溶液與納米粒制劑的配制和稀釋均用1640培養液，并用0.22μπι濾膜無菌過濾。受試 溶液每孔加入l〇〇yL，每個濃度3個平行孔。對照組，即不加待測藥液，單一補加100yL培養 液，置培養箱中和細胞共同孵育。于加藥后48和72h，將96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶 液20yL，置培養箱中孵育4h后甩板，將96孔板倒扣于濾紙上充分吸干殘留液體后，每孔加入 200yL DMS0于振蕩器上振蕩10min以溶解藍紫色結晶物。設定A1孔（只含有200yL DMS0)為 調零孔。使用酶標儀在570nm處測定各孔調零后的吸光度值。
[0069] MTT結果如圖8所示，與泰素相比，小分子前藥自組裝納米粒的體外細胞毒性均存 在一定程度的降低。不同小分子前藥自組裝納米粒毒性大小為PTX-S-S-〇A/TPGS2km米粒〉 PTX-S-〇A/TPGS2k 納米粒〉PTX-2S-0A/TPGS2k 納米粒〉PTX-〇A/TPGS2k 納米粒。PTX-〇A/TPGS2k 納 米粒幾乎沒有細胞毒性。實驗結果表明，前藥的細胞毒性與PTX從前藥中的釋藥的難易程度 相關，連接臂對腫瘤部位氧化還原環境的敏感程度越高，紫杉醇越容易從前藥中釋放出來， 細胞毒性就越大。本發明設計的系列紫杉醇-油酸小分子前藥能對腫瘤部位特異的氧化還 原環境作出響應，實現腫瘤部位特異性釋藥，提高紫杉醇的抗腫瘤效果并降低對機體的毒 副作用。
[0070]實施例12 :PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒的細胞攝取 [0071]采用流式細胞儀測定PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒在鱗狀上皮癌細胞(KB-3-1)攝取情況。將KB-3-1細胞以5000 cells/mL的密度接種到12孔板上，置培養箱中孵育 24h使其貼壁。待細胞貼壁后加香豆素-6溶液或實施例7中制備的香豆素-6-PTX-S-0A/ TPGS2k納米粒，香豆素-6-PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒，香豆素-6-PTX-S-S-0A/TPGS 2k納米粒和 香豆素-6_PTX-0A/TPGS2k納米粒）。本實驗中藥物溶液與納米粒制劑的配制和稀釋均用1640 培養液，并用〇 . 22μηι的濾膜無菌過濾，香豆素-6的濃度為200ng/mL。在37°C孵化0.5h或2h 后，將細胞清洗，收集并分散在PBS中，用流式細胞儀考察細胞對香豆素-6的攝取情況。 [0072]結果如圖9所示，香豆素-6溶液和香豆素-6標記的納米粒的細胞攝取都具有時間 依賴性，隨著孵化時間的延長，細胞攝取量明顯增加。同時，相對于香豆素-6溶液，香豆素-6 標記的納米粒具有更高的熒光強度，說明納米粒能顯著增加細胞對藥物的攝取。此外，不同 納米粒之間也存在攝取差異:PTX-S-S-〇A/TPGS 2k納米粒〉PTX-S-〇A/TPGS2k納米粒〉PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒〉PTX-〇A/TPGS 2k納米粒。PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒的體外釋藥速率最快， 同時又具有最高的細胞攝取，表明從納米粒中水解釋放出的PTX會影響細胞的狀態，增加細 胞對納米粒的吸收。
[0073]實施例13:小分子前藥自組裝納米粒的藥代動力學研究
[0074]取54只健康、雄性大鼠，體重200-250g，隨機分為9組，給藥前禁食12h，自由飲水。 分別靜脈注射紫杉醇溶液劑(泰素），實施例5中制備的非PEG化的小分子前藥自組裝納米粒 (PTX-2S-0A納米粒，PTX-S-0A納米粒，PTX-S-S-0A納米粒，ΡΤΧ-0Α納米粒)和實施例6中制備 的PEG修飾的小分子前藥自組裝納米粒(PTX-2S-0A/TPGS 2k納米粒，PTX-〇A/TPGS2k納米粒， PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒，PTX-S-〇A/TPGS2k納米粒）。紫杉醇的劑量為5mg/kg。于規定的時 間點眼眶取血，分離獲得血漿。通過液相色譜-質譜聯用儀測定血漿中的藥物濃度。
[0075] 結果如圖10,非PEG化的小分子前藥自組裝納米粒體循環時間非常短，生物利用度 非常低。可能是因為非PEG化的小分子前藥自組裝納米粒穩定性差，且表面疏水，易被網狀 內皮系統吞噬。相比之下，PEG化的小分子前藥自組裝納米粒循環時間明顯延長，生物利用 度明顯提高。其中，由于ΡΤΧ-0Α前藥的高度穩定性，PTX-〇A/TPGS 21^米粒的生物利用度最 高。不同PEG化的小分子前藥自組裝納米粒生物利用度的大小為:PTX-〇A/TPGS 2km米粒〉 PTX-2S-0A/TPGS2k 納米粒〉PTX-S-〇A/TPGS2k 納米粒〉PTX-S-S-〇A/TPGS2k 納米粒。實驗結果表 明，PEG化的小分子前藥自組裝納米粒能顯著延長紫杉醇在血液中的循環時間。
[0076] 實施例14:小分子前藥自組裝納米粒的組織分布實驗
[0077]將人口腔上皮癌細胞懸液(KB-3-1)接種于裸鼠，當腫瘤體積達到500mm3時，尾靜 脈注射給藥:DiR溶液和實施例7中制備的DiR-PTX-〇A/TPGS2k納米粒，DiR-PTX-S-〇A/TPGS 2k 納米粒，DiR-PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒和DiR-PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒。DiR的給藥劑量為 lmg/kgj小時或24小時后，將裸鼠處死，分離出主要器官（心，肝，脾，肺，腎）和腫瘤，用活體 成像儀進行分析。
[0078] 結果如圖11所示，與DiR溶液組相比，PEG化的小分子前藥自組裝納米粒組在腫瘤 組織的熒光強度顯著增加。同時，DiR溶液組中熒光主要分布在肺部，在腫瘤組織中幾乎沒 有分布。相比之下，PEG化的小分子前藥自組裝納米粒主要分布在肝臟和腫瘤組織。說明PEG 化的小分子前藥自組裝納米粒能增加藥物在腫瘤部位的積蓄，減少藥物在非腫瘤部位的分 布，在提高藥效的同時降低紫杉醇對機體的毒副作用。
[0079] 實施例15 :PEG化的小分子前藥自組裝納米粒的在體抗腫瘤實驗
[0080] 將人鱗狀上皮癌細胞懸液(KB-3-1，lxl06cells/100yL)接種于雌性裸鼠腹側皮 下。待腫瘤體積生長至l〇〇-120mm 3,將荷瘤小鼠隨機分為六組，每組五只：空白對照組 (PBS)，泰素組，PTX-〇A/TPGS2k 納米粒組，PTX-2S-0A/TPGS2k 納米粒組，PTX-S-〇A/TPGS2k 納米 粒組和PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒組。給藥所用的納米粒為實施例6中制備的PEG修飾的小分 子前藥自組裝納米粒。每隔Id給藥1次，連續給藥5次，按紫杉醇計算，給藥劑量為8mg/kg。給 藥后，每天觀察小鼠的存活狀態，稱體重，測量腫瘤體積。最后一次給藥后一天將裸鼠處死， 獲取器官和腫瘤，進行進一步分析評價。
[0081 ] 結果如圖12所示，在空白對照組和PTX-〇A/TPGS2k納米粒組中，腫瘤體積迅速增長， 在第10天達到1100-1300mm3。相比之下，PTX-2S-0A/TPGS2k納米粒和泰素能延緩腫瘤生長， 而PTX-S-〇A/TPGS 2k納米粒和PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米粒組則能明顯抑制腫瘤生長。給藥10 天以后，PTX-S-〇A/TPGS 2k納米粒組的腫瘤體積僅為150mm3左右，而PTX-S-S-〇A/TPGS2k納米 粒的腫瘤幾乎全部看不見了。抗腫瘤效果與體外釋放結果和細胞毒性結果保持一致，連接 臂對腫瘤部位氧化還原條件的敏感程度越高，紫杉醇越容易實現腫瘤部位特異性釋藥，相 應的抗腫瘤效果越好。
[0082] 如圖13所示，各組裸鼠體重沒有明顯變化。結果說明這些PEG化的小分子前藥自組 裝納米粒在具有明顯的抗腫瘤效果的同時，沒有對機體造成顯著的非特異性毒性，是安全 有效的抗癌藥物傳遞系統。
【主權項】
1. 紫杉醇-油酸小分子前藥，其特征在于，紫杉醇和油酸直接通過醋鍵相連，或通過腫 瘤環境敏感鍵相連，包括(a)醋鍵、（b)氧化還原雙敏感的單硫酸鍵、（C)氧化還原雙敏感的 間隔二硫酸鍵W及(d)還原敏感的二硫鍵，其結構式為：2. 根據權利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前藥，其特征在于，所述的紫杉醇可W為 紫衫燒類化合物。3. 根據權利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前藥，其特征在于，油酸可W用硬脂酸、反 式油酸、亞油酸、α-亞麻酸、丫-亞麻酸、二十二碳六締酸、花生四締酸替換。4. 根據權利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前藥，其特征在于，所述的腫瘤環境敏感 鍵為抑敏感鍵或還原環境敏感鍵，所述的抑敏感鍵為腺鍵、碳酸醋鍵，所述的還原環境敏感 鍵為單硫酸鍵、二硫酸鍵、二硫鍵或金屬蛋白酶敏感鍵。5. 如權利要求1所述的紫杉醇-油酸小分子前藥的合成方法，其特征在于，采用如下步 驟制備： (1) 醋鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成：油酸在DCC和DMAP的催化下，與紫杉醇在化保 護下反應，分離純化即得； (2) 氧化還原雙敏感的單硫酸鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成：油酸在對甲苯橫酸催 化下，與乙二醇反應，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在冊化和邸CI的催化下，與2,2'-硫 代二乙酸酢反應，得(2-氧代-2-(2-( (Ζ)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸，（2-氧代-2-(2- ((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙酸在冊化和抓CI的催化下，與紫杉醇反應，分離純化即 得，反應全程都在化保護下進行； (3) 氧化還原雙敏感的間隔二硫酸鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成：油酸在對甲苯橫 酸催化下，與乙二醇反應，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在冊化和抓CI的催化下，與1， 2-亞乙基二硫代二乙酸酢反應，得(2-(2-氧代-2-(2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫 基）乙酸，（2-(2-氧代-2-(2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙硫基）乙硫基）乙酸在冊化和邸Cl的 催化下，與紫杉醇反應，分離純化即得，反應全程都在化保護下進行； (4)還原敏感的二硫鍵相連的紫杉醇-油酸前藥的合成：油酸在對甲苯橫酸催化下，與 乙二醇反應，得油酸-乙二醇醋，油酸-乙二醇醋在冊化、EDCI和DMAP的催化下，與2，2 二硫 代二乙酸酢反應，得（2-氧代-2-(2-( (Z)-油酷氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸，（2-氧代-2- (2-((Z)-油酷氧基）乙氧基）乙二硫基）乙酸在冊化和抓CI的催化下，與紫杉醇反應，分離純 化即得，反應全程都在化保護下進行。6. 紫杉醇-油酸小分子前藥自組裝納米粒，其特征在于，所述的紫杉醇-油酸小分子前 藥在水中自組裝形成前藥納米粒，其制備過程如下： 將一定量的紫杉醇-油酸小分子前藥溶解到適量的乙醇中，攬拌下，將該乙醇溶液緩緩 滴加到水中，前藥自發形成均勻的納米粒。7. 根據權利要求6所述的小分子前藥自組裝納米粒，其特征在于，所述的紫杉醇-油酸 小分子前藥納米粒為非PEG化的小分子前藥納米粒、PEG修飾的小分子前藥納米粒、包載或 藥物的小分子前藥納米粒和主動祀向的小分子前藥納米粒。8. 根據權利要求7所述的小分子前藥自組裝納米粒，其特征在于，所述的PEG為TPGS2k、 DS陽-PEG和PEG-PE，所述的疏水性巧光物質為香豆素-6、羅丹明、DiR、Di I、Cy-5和Cy-7。9. 權利要求1-5任何一項所述的紫杉醇-油酸小分子前藥或權利要求6-8任何一項所述 的小分子前藥自組裝納米粒在藥物傳遞系統中的應用。10. 權利要求1-5任何一項所述的紫杉醇-油酸小分子前藥或權利要求6-8任何一項所 述的小分子前藥自組裝納米粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。11. 權利要求1-5任何一項所述的紫杉醇-油酸小分子前藥或權利要求6-8任何一項所 述的小分子前藥自組裝納米粒在注射給藥、口服給藥或局部給藥藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105833284SQ201610206408
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月31日
【發明人】孫進, 羅聰, 何仲貴, 孫丙軍, 劉丹
【申請人】沈陽藥科大學