位點2胰島素類似物的制作方法

位點2胰島素類似物的制作方法
【專利說明】位點2胰島素類似物
[0001 ] 關于聯邦資助研究或開發的聲明 本發明在資助號DK040949和DK074176下，在由美國國立衛生研究院（National InstitutesofHealth)授予的合作協議下，由政府支持進行。美國政府可能在本發明中擁 有一定權利。
[0002] 發明背景 本發明涉及多肽激素類似物，其顯示出增強的藥學特性，例如改變的藥代動力學和藥 效動力學特性，即相對于相應的野生型人激素的可溶制劑，賦予縮短的作用持續時間。更特 別地，本發明涉及含有下述的胰島素類似物：任選與（ii)一個或多個B鏈取代結合的（i)在 其"位點2受體結合表面"中的一個或多個氨基酸取代，所述一個或多個B鏈取代是本領域 已知加速胰島素類似物從皮下儲庫吸收到血流內的。本發明的胰島素類似物可以任選含有 在A和B鏈之間的連接結構域（C結構域）（并且因此描述為單鏈類似物)，并且可以任選含 有在A或B鏈中的其他位點處的標準或非標準氨基酸取代。本發明依據的基本想法是通過 在激素的位點2受體結合表面中同時摻入取代，來增強速效類似物的安全和功效。這種取 代組合賦予在作為糖尿病治療方法的皮下注射后，血糖濃度的膳食控制中的效用的"快開/ 快關"藥代動力學特性，以及在用于治療糖尿病的的基于算法的閉環系統操作("智能栗"） 中的進一步效用。
[0003] 蛋白質包括治療劑和疫苗的改造可以具有廣泛的醫學和社會利益。天然存在的蛋 白質一如人類、其他哺乳動物、脊椎動物生物、無脊椎動物生物或一般而言的真核細胞的基 因組中編碼的一通常含有兩個或更多個功能表面。蛋白質類似物的利益能夠實現這些功能 表面之一或另一個的選擇性修飾，例如以提供生物活性的細調。治療蛋白質的實例由胰島 素提供。野生型胰島素的三維結構已充分表征為鋅六聚體、無鋅二聚體以及溶液中的分離 單體（圖1和2)。在其他哺乳動物的基因組中編碼的野生型人胰島素和胰島素分子與胰島 素受體（IR)結合，所述IR各自含有多重結構域和相關結構域表面。IR是a0半受體(指 定為（a0 )2)的二聚體，其中a鏈和0鏈是單個前體多肽的翻譯后產物。（a0 )2二聚 體的激素結合表面已分類為與受體的非線性結合和動力學特性有關的龍點7和龍點么這 種結合方案在圖3中以圖解形式顯示。IR胞外結構域片段的結構和生物化學分析中的近期 進展已顯示，位點1由通過（a0 )2二聚體中的兩個亞基形成的反式結合元件組成：一個亞 基的N末端L1結構域和另一個亞基的C末端a-螺旋（aCT)(WhittakerJ，Whittaker LJ,RobertsCTJr,PhillipsNB，Ismail-BeigiF，LawrenceMC和WeissMA.a-Helical elementatthehormone-bindingsurfaceoftheinsulinreceptorfunctionsasa signalingelementtoactivateitstyrosinekinase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109,1116-71 (2012))。位點2的位置并未得到充分表征，但提議為包含第一和第二纖連蛋 白同源結構域的部分。
[0004] 胰島素或胰島素類似物的受體結合表面可以同樣在同源的基礎上進行分類：分 別的位點1結合表面(典型受體結合表面）和位點2結合表面(非典型受體結合表面)。胰 島素的位點1結合表面重疊其在B鏈中的二聚體形成界面，而位點2結合表面重疊其六 聚體形成界面。位點1激素-IR界面近期已在低分辨率下顯現（MeritingJG，Whittaker J,MargettsMB,WhittakerLJ,KongGK,SmithBJ,WatsonCJ,ZakovaL,Kletvlkova E,JiracekJ,ChanSJ,SteinerDF,DodsonGG,BrzozowskiAM,WeissMA,WardCff 和LawrenceMC.Howinsulinengagesitsprimarybindingsiteontheinsulin receptor.yVatore493,241-5 (2103))。假定的位點2相關殘基可以基于突變的動力學效 應，或基于其中突變仍然損害結合的對于位點1外部的位置進行限定。這些標準突出顯示 了非典型殘基412)13)17、813和817的潛在重要性。各自的位點1相關和位點2相關表 面與圖4中的胰島素單體的表面相關顯示。然而，本領域已知加速來自皮下儲庫的胰島素 吸收的取代通常在激素的位點1結合表面內和與激素的位點1結合表面相鄰(例如在殘基 B24、B28或B29)，我們設想一萬在歡激溆或級織游表琢J:/#/茲，位點2結合表面的修飾就可 以通過激素受體復合物的信號傳導的細胞持續時間調節。盡管不希望受理論限制，我們進 一步設想信號傳導的細胞持續時間的此類縮短對速效胰島素類似物("快開"）賦予"快關" 藥代動力學特性，所述速效胰島素類似物在皮下儲庫中的分解已通過如本領域已知的在位 點1結合表面內或與位點1結合表面相鄰的取代得到加速(關于原理，參見圖6)。因此，此 類位點1/位點2相關取代的新型組合一起賦予在糖尿病治療中具有新型效用的快開/快 關藥代動力學特性的所需組合。
[0005] 本領域已知在胰島素的典型受體結合表面內的修飾或取代可以使激素對于其受 體的體外親和力損害最高達約五倍(例如從0. 05nM的解離常數到0. 25nM的解離常數)， 而對體內效力沒有顯著作用，如通過皮下或靜脈內注射時，變體胰島素引起血糖濃度中的 降低的能力評價的。此類穩固性至少部分歸于親和力和激素從血流中的清除速率之間的補 償關系。因為與IR的結合介導胰島素作用和在很大程度上的胰島素清除兩者，所以親和 力中的降低導致循環半衰期中的成比例增加，且因此導致影響生物學信號傳導的機會。此 類補償的實例已與胰島素類似物相關公開，在所述胰島素類似物中，在位置B24處的苯丙 氨酸由環己基丙氨酸（Cyclohexanylalanine) (Cha)取代，公開于2012年7月13日提交 的國際專利申請序列號PCT/US12/46575和2013年1月22日提交的美國臨時專利申請序 列號61/755,020中，所述專利的內容通過引用并入本文。在位置B24處的Cha的非平面 脂環（圖8中舉例說明的）使受體結合親和力損害約三倍，但對KP-胰島素的效力或藥效動 力學特性沒有作用，如通過在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中測試的（圖9A)。另外的實例 已通過在位置B24處經由氟-芳香族和氯-芳香族取代進行修飾而提供，如圖7中舉例說 明的（與野生型二聚體界面有關)，并且如分別于2012年7月18日和2011年1月31日提 交的美國專利申請序列號13/515, 192、13/018, 011，于2012年10月4日提交的美國臨時 專利申請號61/709, 448,以及分別于2010年12月13日和2012年10月29日提交的國際 專利申請號PCT/US2010/60085和PCT/US2012/62423中公開的，所述專利通過引用并入本 文。在靡K[LysB2S，ProB29]_胰島素，也指定為KP-胰島素（Humalog?的活性組分）； EliLillyandCo.)中的PheB24通過在芳環的鄰位處的單個氯取代（2_Cl_PheB24)的修飾， 因此使變體激素在體外對于經分離的IR的生物化學親和力損害約三倍，而不改變其體內 效力，如通過在經由鏈脲霉素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中評價的，或如在麻醉的 非糖尿病青春期約克夏豬中評價的，在所述約克夏豬中，內源胰島素分泌被靜脈內奧曲肽 抑制(數據未顯示)。甚至更引人注意地，雖然含有2-F-PheB24 (在位置B24處的鄰-單氟苯 丙氨酸）的[AspB1°，LysB2S，ProB29]-胰島素（DKP-胰島素）的衍生物顯示出受體結合親和力 中的相似減少量(相對于KP-胰島素約35 ( ±5) %)，其效力和信號傳導持續時間在糖尿病 Sprague-Dawley大鼠中得到增強（圖9B)，如于2011年1月31日提交的美國專利申請序列 號13/018, 011 (其通過引用并入本文）中公開的。因此，預期如在體外評估的，一般在胰島 素分子中對IR結合引入適度擾亂的修飾或取代在體內將是良好耐受的，并且就效力或(在 不存在對自裝配的作用的情況下）其他藥理學特性而言，與野生型胰島素無法區別一或甚 至更有效力和如在2-F-PheB24-DKP-胰島素的情況下延長的。因此出乎意料地發現在位點2 內的取代或修飾可以顯著縮短體內胰島素作用的持續時間（藥代動力學的改變)，盡管對變 體胰島素關于IR的生物化學親和力賦予的擾亂小于五倍。盡管在位置B13、B17、A12、A13 和A17處的側鏈不被認為在胰島素受體的主要激素結合表面處銜接，但丙氨酸掃描誘變已 顯示在位點2相關位置處的單個丙氨酸取代如下影響相對受體結合親和力：（位置B13) 12 (±3)%、（B17)62 (±14)%、（A12)108 (±28)%、（A13)30 (±7)% 和（A17)56 (±20)%。
[0006] 胰島素施用長久以來已確定為糖尿病的治療。在患有糖尿病的患者中的常規胰島 素替代療法的主要目標是血糖濃度的緊密控制，以阻止其偏移高于或低于健康人主體特有 的正常范圍。偏移低于正常范圍與立即腎上腺素或神經低糖（neuroglycopenic)癥狀相 關，其在嚴重發作中導致抽搐、昏迷和死亡。偏離高于正常范圍與微血管疾病的長期危險增 加相關，所述微血管疾病包括視網膜病變、失明和腎衰竭。胰島素是在脊椎動物的代謝中起 關鍵作用的小型球狀蛋白質。胰島素含有兩條鏈：含有21個殘基的A鏈和含有30個殘基 的B鏈；各個殘基通過氨基酸的身份(通常使用標準三字母代碼)、鏈和序列位置(通常為上 標)指出。激素作為Zn2+穩定六聚體貯存于胰細胞，但在血流中充當無Zn2+單體。胰島 素是單鏈前體胰島素原的產物，其中連接區（35個殘基)將B鏈的C末端殘基(殘基B30)與 A鏈的N末端殘基連接。各種證據指出它由胰島素樣核心和無序的連接肽組成。三個特異 性二硫橋（A6 -All