一種水包油型納米乳佐劑及其mrsa納米乳佐劑疫苗和制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種水包油型納米乳佐劑，還涉及MRSA納米 乳佐劑疫苗及其納米乳佐劑和疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 隨著疫苗制品的不斷推廣，其自然屬性所造成應用局限性也不斷的暴露出來。大 多數疫苗制品在單獨狀態下，其半衰期都比較短，尤其是在溫度的催化下，其半衰期更是隨 著溫度的升高而直線下降。因而，大多數疫苗如MRSA疫苗都需要一個合適的保存條件，以 維持其穩定性，其中所處的液體環境對穩定性的維持更起著尤為關鍵的作用。而液體環 境的酸堿度、離子強度以及其他一些維持穩定的成分（如一些糖類分子、氨基酸組分、酯類 等）的加入都可能影響疫苗制品穩定周期，因此，尋找一個合適的疫苗佐劑及其載體來保 護疫苗在生產、儲存、運輸過程中的穩定性對于疫苗本身的應用與推廣有著極為重要的意 義。同時，由于疫苗單一的有效成分在進行免疫提呈的過程中受到各種生物途徑的影響，使 得其無法實現預期的免疫效果，因此需要一些可增強機體對疫苗抗原的免疫應答或改變免 疫應答類型的佐劑作為輔助。而佐劑的功能主要有：使用部位招募免疫細胞和免疫分子，增 強免疫應答；增強疫苗抗原傳遞；通過改變抗原的物理形狀，延長抗原在機體內保留時間； 增進免疫接觸；增強弱抗原的免疫原性和免疫記憶，如高度純化的抗原或重組抗原；減少 抗原接種劑量和接種次數；促進疫苗在免疫應答能力弱的群體中的免疫效果；刺激單核吞 噬細胞對抗原的提呈能力；刺激淋巴細胞分化，增加擴大免疫應答能力等機制來增強免疫 應；加快免疫應答的速度和延長持續時間；改變抗原的構型；改變體液抗體的種類、IgG亞 類和抗體的親和性，以及細胞免疫和黏膜免疫效應。理想的佐劑不僅沒有免疫原性并能增 強機體的免疫應答，更能使機體獲得最佳的保護性免疫和免疫記憶。
[0003] 目前FDA批準可人用的佐劑僅有氫氧化鋁為代表的鋁佐劑、MF59、AS系列佐劑是 目前普遍被批準用于人類疫苗的主要佐劑。自1926年Glenny首先應用鋁鹽吸附白喉類毒 素至今已廣泛應用于疫苗，有磷酸鋁和氫氧化鋁兩種鋁鹽佐劑。文獻報道顯示，氫氧化鋁佐 劑作為疫苗佐劑在使用過程中存在很多疫苗安全隱患：局部的過敏性反應、局部組織的刺 激反應、引起皮膚淋巴組織增生癥、急性類肉瘤狀病、引起巨噬細胞肌筋膜炎及慢性疲勞、 神經系統毒性、海灣戰爭綜合征相關性、自閉癥相關性、羅恩氏病相關性等等。隨著疫苗接 種范圍的不斷推廣，嬰幼兒成為了很多疫苗的接種對象，而嬰幼兒身體系統發育的不完善， 勢必增加其對氫氧化鋁佐劑的副反應的敏感性，特別對嬰幼兒認知發育可能有不良影響， 從而有可能釀成悲劇。同時鋁佐劑以體液免疫應答為主，不能誘導細胞免疫和黏膜免疫應 答效應，特別是近幾年發現多次使用出現免疫抑制和累積中毒而使用受限，并且對一些疫 苗抗原無效。意大利于1997年率先批準含MF59佐劑的流感亞單位疫苗復立達上市；2009 年歐盟批準含AS03 (MontanideW/Ο水包油佐劑中加入維生素E制備的AS03)佐劑的H1N1 疫苗上市；2009年含AS04佐劑（氫氧化鋁和3-0-脫酰單磷酸類脂A制備的AS04佐劑） 的人乳頭瘤狀病毒（HPV)疫苗在美國上市。目前AF03和W805EC兩種0/W型亞微乳佐劑處 于臨床試驗中。在已經批準上市的佐劑中，MF59和AS03為水包油型亞微乳，W09014837、 EP0399843A2、US6299884B1、US6451325B1、US20090191226A2 等專利公開了MF59 的處方、制 備方法及其用途。該佐劑含4. 0%~5. 0%角鯊烯、0. 5%吐溫80、0. 5%司盤85,平均粒徑 約為160nm。但MF59只能采用過濾除菌，如果采用終端熱壓滅菌，則會導致亞微乳分層，因 而整個生產過程對無菌操作要求苛刻。US2007141078A1、US2010189741A1、US2010183667A1 等專利公開了AS03的處方、制備方法及其用途。單個劑量的AS03含角鯊烯10.68mg、 DL-α-生育酚11. 86mg，吐溫804. 85mg，平均粒徑為150~155nm。2009~2010年甲型H1N1 流行期間，歐洲多個國家報告疫苗接種者出現神經系統不良反應，主要表現為嗜睡和睡眠 過度。根據芬蘭國家健康與福利研究所公布的一份調查報告顯示，4~19歲青少年在接種 了疫苗后患嗜睡癥的風險比同年齡組未接種疫苗的青少年高出9倍。嗜睡癥是一種睡眠失 調現象，患者會感到極端疲倦，昏昏欲睡，往往會在毫無預警的情況下睡著，甚至是在活動 中途突然入睡。專利文獻US2007014805A1、US2007191314A1、EP2080522A1 公開了AF03 的處 方及其制備方法。該佐劑含2. 5%角鯊烯、約0. 48%鯨蠟硬脂醇聚醚-12(Ceteareth-12)、 約0. 37%司盤80,此外尚含一種Toll樣蛋白受體4(TLR-4)激動劑，其中90%的乳滴粒徑 彡200nm。其制備方法是先制備成W/0型亞微乳，然后加熱至50~65°C經歷相轉變，冷卻后 而得0/W型亞微乳。制備工藝復雜，質量較難控制。此外，所含的表面活性劑Ceteareth-12 具有一定毒性，一般僅用于局部外用制劑中。專利文獻US2009304799A1、US2012003277A1 公開了W805EC的處方、制備方法及其用途。該佐劑含64%大豆油、8%乙醇、5%吐溫80、 1 %十六烷基氯化吡啶（CPC)，平均粒徑約為400nm。由于處方中乙醇和吐溫80含量較高， 不適于注射給藥，目前僅局限于作為鼻粘膜免疫疫苗的佐劑。專利文獻CN02144678. 4與 CN201010103495. 2公開的均為一種納米乳佐劑，粒徑在10~100nm之間，但在制備過程中 流感疫苗需經歷高速攪拌與納米對撞過程，容易導致抗原效價降低甚至失活。
[0004] 由此可以看出現有的佐劑不良反應多，同時疫苗免疫原性的增強作用不明顯，且 粒度大多大于lOOnm，制備過程中使用有機溶劑、殘留溶劑毒性大、制造工藝復雜、條件要 求高、工藝操作時間過長、破壞蛋白穩定性、熱力學不穩定、不能長期保存、包封率低，易滲 漏、耗能大等嚴重缺陷，從而造成疫苗需多次接種、儲存和運輸過程中易失活、吸收效率低， 免疫保護效果差等嚴重問題。同時，鑒于疫苗制品使用的對象為人體，在選擇疫苗配方的 配伍、配比過程中，不僅要考慮所添加成分穩定劑和佐劑的作用，更要考慮其對人體是否有 毒、有害，是否會引起人體的不良、過敏反應。因此，探尋一種安全、低廉、具有穩定劑和佐劑 功能的疫苗佐劑，對于疫苗制品的推廣和應用具有重大社會效益和經濟效益，也成為疫苗 學的重大現實問題。
[0005] 目前將粒徑小于l〇〇nm的乳劑稱為納米乳，它由油相-水相-表面活性劑-助表 面活性劑組成，連續相為水相、分散相為油相的納米乳為0/W型，連續相為油相、分散相為 水相的納米乳劑為W/0型。納米乳具有粒徑小且均勻，易于制備，穩定性、流動性均較好，易 于注射等優點，可作為藥物載體應用于多種吸收方式的藥物制劑中。外觀呈透明或半透明 的納米乳是由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑按一定比例混合后自發形成的熱力 學穩定、各向同性、外觀透明或半透明的分散體系。納米乳可作為一種新型疫苗載體，促進 疫苗蛋白分子在體內的吸收，從而提高疫苗的免疫效果，同時具有安全性高，穩定性好等優 點，在增強疫苗的免疫效果方面將顯示獨特優勢。
[0006] 因此，急需一種粒徑小于100nm的W/0型納米乳劑，具有很好的全身和黏膜免疫效 果。
【發明內容】
[0007] 為克服現有疫苗佐劑，尤其是鋁佐劑存在的不良反應，MF59、AS系列等佐劑對疫苗 免疫原性的增強作用不明顯，穩定性差等不足，本發明提供一種水包油型納米乳佐劑，還提 供含有該納米佐劑的疫苗及制備方法，可以極大增強疫苗免疫效果，降低不良反應，同時成 分簡單、劑型穩定，使用方便；該佐劑與抗原配制成的疫苗，穩定性好，副反應小，免疫效果 好，保護期長。
[0008] 本發明的目的采用如下技術方案實現。
[0009] -種水包油型納米乳佐劑，按質量百分比計包括如下組分：
[0010]
[0012] 優選的，所述納米乳佐劑的乳滴粒徑為1~100nm。更優選的，所述表面活性劑與 助表面活性劑的質量比為2:1~5:1。
[0013] 本發明中，所述表面活性劑為吐溫-80、吐溫-85、吐溫60、聚氧乙烯氫化蓖麻油和 聚氧乙烯蓖麻油中任一種或多種組合；所述助表面活性劑為：失水山梨醇脂肪酸酯、C2~ C4的一元醇和C2~C4的多元醇中的任一種或多種組合；所述油相為石蠟油、乙酸乙酯、肉 豆蔻異丙酯、角鯊烷、角鯊烯、油酸乙酯、辛酸/葵酸三甘油脂中任一種或多種組合。
[0014] 本發明中，所述失水山梨醇脂肪酸酯為司盤-85、司盤80或司盤60中的任一種或 多種組合，所述C2~C4的一元醇和C2~C4的多元醇為無水乙醇、甘油、1，3- 丁二醇或1， 3_丙二醇中的任一種或多種組合。
[0015] 2、利用所述水包油型納米乳佐劑制備的納米乳佐劑疫苗。
[0016] 優選的