Amo-134在制備治療心律失常藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及AM0-134在制備治療心律失常藥物中的應用，更具體地說，本發明涉 及AM0-134在制備治療心律失常中促進hERG表達的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 長QT綜合征是以動作電位復極延長、心電圖QT間期延長為特征，其可導致尖端扭 轉型室性心動過速增加進而易致心源性猝死。雖然Na +和Ca 2+通道基因突變可導致遺傳性 長QT綜合征，但hERG基因突變致鉀通道功能缺陷所導致的遺傳性長QT綜合征更常見。此 外，獲得性長QT綜合征可以被諸多藥物如III類抗心律失常藥所誘發，臨床上也更常見。截 止目前已發現有13個基因與遺傳性長QT綜合征有關，其中hERG突變導致遺傳性長QT占 總突變的45%，為第二常見突變基因。hERG基因突變參與遺傳性2型長QT發病的病理生 理過程。hERG基因位于7號染色體上，在心臟中表達編碼快速激活延遲整流鉀通道的α亞 單位，在動作電位3期復極化過程中起重要作用。目前已經發現300多個hERG突變位點可 致遺傳性長QT綜合征。研究表明hERG基因突變可以通過通道合成障礙、轉運障礙、門控及 通透性改變最終導致遺傳性長QT綜合征的發生。
[0003] 人類心臟中功能下調可以導致2型長QT綜合征。具體機制為復極化外相電流 減少導致動作電位延長，這就增加了尖端扭轉性室速及室顫等威脅生命的惡性心率的發生 率。hERG蛋白曾是抗心律失常藥物的重要作用靶點。因此，更好的理解hERG相關LQTS的 發病機制將有助于針對LQTS病人尋找新的治療手段。
[0004] MicroRNAs是由21-25個堿基構成的非編碼RNA，其在真核生物的很多基因的轉錄 后調控過程中發揮重要作用。miRNA通過結合目的基因的3' -UTR區可以抑制其mRNA表 達或介導其降解。其靶基因參與體內眾多生物過程，如細胞增生、分化、發育、凋亡等。近些 年研究表明miRNAs在很多心臟疾病發病過程中表達改變，這其中包括心律失常。miRNAs水 平的改變可導致相應離子通道功能紊亂從而引起離子通道疾病。例如，已有研究證明miR-1 可作用于縫隙連接通道蛋白43及內向整流鉀通道的α亞單位從而降低心臟功能及引起缺 血性心律失常。而過表達miR-17-5p可抑制很多內質網應激相關分子伴侶的表達從而引起 hERG轉運障礙。因此臨床上可將miRNA用作診斷標記物及治療靶標。運用與相應miRNA互 補的寡核苷酸序列AMOs可抑制相應miRNA的功能。研究發現在數種病理條件下心律失常 的發生與miRNA-1表達上調有關26-29,而目前研究發現AM0-1可逆轉miRNA-1對心臟的毒 害作用，證明其可作為缺血性心律失常潛在的治療手段。
【發明內容】
[0005] 現有技術中，還沒有藥物用于在治療心律失常中促進hERG表達，此處hERG基因 是位于7號染色體上，在心臟中表達編碼快速激活延遲整流鉀通道的α亞單位，在動作電 位3期復極化過程中起重要作用。本發明人利用生物信息學網站-RegRNA網站(http ：// regrna. mbc. nctu. edu. tw),輸入已確定的革F1基因 hERG，根據相應的比分值，并經blast比 對，預測出6個與hERG相關的miRNA :首先選定miR-134,并依據其核苷酸序列制成反義核 苷酸AM0-134。在進行干預實驗時，驚喜地發現AM0-134能夠在阻止心律失常時促進hERG 的表達，從而完成了本發明。
[0006] 在發達國家心血管疾病仍然是病人死亡的主要原因。與心律失常相關的基因表達 譜的改變會影響心臟病理和生理，直接或間接影響的功能。miRNAs已被報道作用于心臟離 子通道進而影響心律失常的發生。截止目前，已報道30%基因受miRNA調控。目前的研究 表明miRNA表達異常可以通過影響離子通道的表達，近而導致離子通道病的發生。miRNA介 導的基因調控是轉錄后一個基本的調控過程。然而，明確miRNA的靶基因以及它們的功能 一直是miRNA研究領域的主要挑戰。miRNA可以直接抑制mRNA的翻譯，或直接使其降解， 具體將由堿基序列的結合程度來決定。在之前的研究中，有報道miR-212可以下調Kir2. 1 表達，明顯改變Ikl的密度。研究已證明hERG基因編碼快速激活延遲整流鉀通道，在動作 電位3期復極化過程中起著重要作用，hERG基因功能的改變可以導致LQT2的發生。然而， miRNAs是否在LQT2的發病過程中起作用尚不清楚。這篇文章從miRNA水平探討LQT2發病 的病理生理機制，為LQT2研究提供了新的視角。
[0007] 我們的研究表明hERG基因受miR-134的負性調控。首先生物信息學預測好hERG 受6個miRNAs調控。其次，雙螢光素酶報告基因顯示miR-134與hERG3^ -UTR或者編碼區 有結合位點，而miR-147和miR-185無結合位點。已有很多文獻證明miRNA可以與目的基因 3' -UTR結合。最近又有文章報道有少量功能的miRNA可以結合于目的基因 Y -UTR區， 然而更多的結合位點則是在基因編碼區。在本實驗中，過表達miR-134降低了 hERG的蛋白 及mRNA水平。蛋白降解可能是因為mRNA降解或者抑制其翻譯所致，其又由miRNA與目的 基因的結合程度而定。很多動物的miRNA與其目的mRNA不能完全結合導致，通常抑制目的 蛋白的合成，然而卻并不降解其mRNA。我們的試驗中miRNA抑制hERG蛋白降解和mRNA水 平一致，可能與其匹配高度重合，以降解hERGmRNA為主有關。運用miR-134的特異性抑制 劑糾正了其對hERG的抑制作用。最終我們激光共聚焦實驗與qRT-PCR及Western blot實 驗相一致。因此，我們實驗說明了 miR-134是hERG新的靶點。此外，通過相應的AMOs可以 逆轉miRNAs對hERG的抑制作用表明我們可以通過干擾miRNA水平來治療相應心律失常， 相應miRNAs可作為潛在的治療靶點。
[0008] hERG鉀通道首先在內質網內合成，初步折疊加工后轉運致高爾基體進一步加工， 成熟后轉致細胞膜發揮作用。hERG蛋白在內質網和高爾基體內要進行兩步糖基化過程，合 成過程中任何損傷都會導致最終膜蛋白合成受抑制。我們證明了 miRNA可以抑制hERG通 道蛋白表達，導致臨床上QT間期延長，這些發現證明了 miR-134,可以影響hERG蛋白的合 成。
[0009] 已經報道有很多分子可以上調hERG通道蛋白功能，包括磷脂酰肌醇、蛋白激酶 C、及環腺苷酸等，然而蛋白激酶A及蛋白激酶B介導的磷酸化則可減低hERG電流幅度。 HEK293T細胞系里激活蛋白激酶C途徑直接抑制了 hERG電流。研究已證明抑制表皮生長因 子受體激酶后，hERG電流幅度也會減小。然而，這些調控機制仍然缺乏特異性，其同時可改 變其它離子通道的門控或者動力學特征。最近有研究證明KCNH2基因轉錄本上游一個TG 重復的多態性位點負性調控hERG的轉錄，并且導致QT間期延長。鑒于hERG在心臟離子通 道活動過程中起著非常重要的作用，對KCNH2基因有關電生理層面更深入的研究仍然十分 必要。
[0010] LQT2綜合征的發病可能受多種miRNA調控，我們證明了 hERG基因受miR-134調 控，且這些miRNA尚可影響hERG蛋白的表達。然而，有關miRNA調控室性心律失常的具體 機制尚不清楚，且與KCNH2基因及其電生理特性之間的關系尚需進一步研究。鑒于LQT2尚 不能被傳統的治療手段治愈，現迫切需要尋找新的治療方法。之前的研究表明siRNA可以 糾正E637K電流及恢復其動力學特征。因此，這些新的AMOs (AM0-134)可以作為遺傳性或 者獲得性長QT的新的特異性治療方案。我們需要在動物或人心肌細胞中驗證這些miRNA 對hERG的調控作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1 :本發明實施例中miRNA-134和AM0-134對hERG基因表達在mRNA水平的影 響，圖中Ctl為空白對照組。
[0012] 圖2 :本發明實施例中miRNA-134和AM0-134對hERG基因表達在蛋白質水平的影 響，圖中Ctl為空白對照組。
【具體實施方式】
[0013] 材料與方法
[0014] 1. 1實驗儀器與試劑
[0015] 1.1.1主要實驗儀器
[0016] 表1實驗儀器名稱和生產廠家
[0023] 實驗方法
[0024] I. 1. 3
[0025] 實時熒光定量PCR
[0026] 用Trizol試劑從已轉染的U20S細胞中提取總RNA。將RNA隨后用無菌的 Rnase-free處理，hERG基因 mRNA的水平使用Taqman探針評估與qRT-PCR檢測。引物和探 針是來自ABI公司cat. #4331182(編號：Hs04234270-gl)。反轉錄條件設定為初始步驟在 95°C 10分鐘，隨后在95°C 15秒40個循環，并在60°C下維持1分鐘。實時PCR反應獨立重 復進行三次。結果用2-△△ CT相對定量方法分析30。
[0027] Western blot
[0028] 提取hERG蛋白的步驟免疫印跡分析按先前描述的Μ。簡而言之，首先轉染 pcDNA-hERG到U20S細胞中。所表達的hERG細胞進一步轉染各自的miRNA或miRNA加上 相應的AMOs。轉染48小時后收獲細胞。將等量的蛋白灌注在已制備好的7. 5% SDS聚丙 烯酰胺凝膠上，然后轉移到硝酸纖維素膜上。膜封閉用5%的脫脂奶粉，接著用兔多克隆抗 hERG的抗體在4°C下孵育過夜。在TBST中將膜洗滌三次，然后在室溫下用山羊抗兔IgG孵 育1小時。印跡處理用SuperSignal West Pico化學發光底物（Pierce Biotechnology公 司，美國），并使用Syngene公司的成像系統。
[0029] 實驗表明，我們采用生物信息學預測反向篩選聯合雙熒光素酶報告基因、 qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦及膜片鉗技術篩選出了 miR-134可以負性調控hERG表 達，相應的AMOs可以沉默這些miRNA對hERG的抑制作用。我們的實驗為進一步理解hERG 蛋白的調控機制及從基因角度對長QT綜合征進行治療提供了新的視角。然而，這些研究結 果需要在動物模型、前期臨床及臨床中進一步驗證。
【主權項】
1. AMO-134在制備防止心律失常中促進hERG表達的藥物組合物中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其中，所述AM0-134為miR-134的反義寡核苷酸序列。3. 如權利要求1或2所述的應用，其中，所述心律失常選自竇性心律失常，異位心律，心 臟傳導阻滯，房室間傳導異常，LQT2中的一種或多種。4. 如權利要求1或2所述的應用，其中，所述心律失常可引起心源性猝死。5. -種治療心律失常的藥物組合物，其特征在于，含有AM0-134。6. 如權利要求5所述的藥物組合物，其中，所述AM0-134是miR-134的反義寡核苷酸序 列。7. 如權利要求5或6所述的要去組合物，其中，所述心律失常選自竇性心律失常，異位 心律，心臟傳導阻滯，房室間傳導異常，LQT2中的一種或多種。8. 如權利要求5或6所述的要去組合物，其中，所述心律失常可引起心源性猝死。
【專利摘要】本發明公開了AMO-134在制備治療心律失常中促進hERG表達的藥物組合物中的應用；以及一種治療心律失常的藥物組合物，其特征在于含有AMO-134。
【IPC分類】A61K48/00, A61K31/713, A61P9/06
【公開號】CN105267986
【申請號】CN201510526703
【發明人】廉姜芳, 周建慶, 毛海燕, 巴艷娜, 莊凱麗
【申請人】寧波市醫療中心李惠利醫院
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年8月13日