甘草中一類異戊烯基異黃酮類化合物的醫藥新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及甘草中一類異戊烯基異黃酮類化合物的藥物新用途，具體涉及它們在 制備抗癌藥物、PTP1B抑制劑和抗糖尿病藥物、酪氨酸酶抑制劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑中的 應用。
【背景技術】
[0002] 甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是最常用的中藥之一，在中國已經有2000 多年的應用歷史，除了中國藥典，它也被日本藥典、歐洲藥典以及美國藥典所收錄。甘草具 有清熱解毒、祛痰止咳、調和諸藥、補脾益氣等多種功效，主要用于脾胃虛弱、咳嗽痰多、心 悸氣短、癰腫瘡毒等病癥，在現代臨床應用中主要用于治療呼吸道感染、胃潰瘍、糖尿病以 及病毒性肝炎等疾病。此外，甘草也被廣泛應用于化妝品行業，具有顯著的祛斑美白等效 果。甘草的化學成分眾多，迄今已經從甘草屬植物中分離報道約450個化合物，主要分為三 萜皂苷類、黃酮苷元類以及黃酮糖苷類化合物。其中，三萜皂苷的苷元主要為齊墩果烷型三 萜，而黃酮苷元類化合物種類很多，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、異黃酮、二氫異黃酮、 異黃烷、紫檀烷、查爾酮以及香豆素等。目前對于甘草中化學成分的藥理活性研究主要集中 于甘草中的一些含量較高的化合物，比如甘草酸、甘草素、異甘草素、甘草苷以及異甘草苷 等，而對于其他成分的藥理活性研究卻很少有報道。
[0003] 甘草西定（英文名：licoricidin;CAS號：30508-27-1;分子式：C26H3205;分子量： 424)、Angus tone A(CAS號:90686-13-8;分子式:C25H26〇6;分子量:422)和粗毛甘草素 D (英文 名：glyasperin D; CAS號：142561-10-2;分子式:C22H26O5;分子量:370)是甘草的化學成分， 它們的化學結構相似，均屬于異戊烯基化的異黃酮或異黃烷類化合物，在其C-5，C-7，C-2 ' 和C-4 '上均有羥基或甲氧基取代，在C-6上有異戊烯基取代，此外，在甘草西定和angustone A的C-3 '上有第二個異戊烯基取代。
[0004] 甘草西定曾被報道具有抑制c A Μ P磷酸二酯酶（K u s a η ο A等， Chem.Pharm. Bui 1 · 1991，39,930-933)、抑制溶血血小板活化因子乙酰轉移酶(Nagumo S等， Biol .Pharm.Bull · 1999，22，1144-1146)、抗菌（Hatano T等，Chem.Pharm.Bull · 2000,48， 1286-1292;Tanaka Y等，J.Nutr.Sci .Vitaminol .2001,47,270-273 ;Fukai T等，Life Sci.2002,71，1449-1463;Tanabe S等，J Breath Res.2012,6,016006;Villinski JR等，J Nat Prod.2014,77,521-526;Eerdunbayaer等，Molecules 2014,19,13027-13041; Kirmizibekmez H等，Fitoterapia 2015，103,289_293)、抗腎炎和氧化（卩111^;[1'等， Fitoterapia 2003,74,720-724)、治療牙周炎等口腔疾病（1^￥0等，1?640(101^01.2011， 82，122-128;Messier C等，Oral Dis.2012，18,32-39;Gafner S等，J Nat Prod.2011，74， 2514-2519)等活性，也曾有報道稱含有甘草西定的甘草提取物可以抑制前列腺癌細胞 DU145的轉移能力（Park SY等，Br J恥杜.2010，104，1272-1282)，但未見關于甘草西定直 接抑制腫瘤細胞增殖和PTP1B活性的報道。
[0005] 關于Angustone A的活性尚未見任何報道，而其C-6上的異戊烯基與C-7上的羥基 脫氫環化而生成的衍生物Angustone C具有抗菌和胃腸道保護（Quesada L等，Nat Prod Commun. 2012，7,1187-1188)作用。
[0006] 粗毛甘草素 D曾被報道具有較弱的抗幽門螺桿菌活性（Fukai T等，Life Sci . 2002，71，1449-1463)，此外未見其它活性報道。
[0007] 蛋白酪氨酸磷酸酶ΙΒ(ΡΤΡΙΒ)在體內專一水解芳香族磷酸，通過對胰島素受體或 其底物上的酪氨酸殘基去磷酸化作用，對胰島素信號轉導進行負調節，PTP1B抑制劑可用于 治療II型糖尿病。近年來的研究表明PTP1B也參與了癌癥發生發展，而其抑制劑在抗癌方面 具有巨大潛力（Lessard L等，Biochim Biophys 六(^&.2010，1804,613-619)。乙醜膽喊酯酶 (AChE)在體內選擇性地水解乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，降低膽堿能神經的生理效應，AChE 抑制劑可用于治療神經系統退行性疾病如阿爾茲海默病等。酪氨酸酶是皮膚中黑色素合成 的關鍵酶，酪氨酸酶抑制劑能夠抑制體內黑色素的合成，具有祛斑美白的作用。這些靶點和 甘草的藥理作用密切相關，也有報道一些來源于甘草和化合物或提取物可以抑制這些靶 點，但本發明所公開的三種化合物相關活性均未見報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供甘草中三種異戊烯基異黃酮類化合物（即甘草西定、 angustone A和粗毛甘草素 D)的藥物新用途。此三種化合物的結構式如下：
[0009]
(1.)甘草西定（Iicoricidin) (2)粗毛甘草素 (glyasperin.D:) (3) angustone A 〇
[0010] 本發明所提供的三種化合物的藥物新用途指這些化合物本身或其藥學上可接受 的鹽、酯、溶劑化物、立體異構體、互變異構體、前藥中的至少一種，以及它們的混合物在制 備具有如下（1)-(5)中至少一種功能的藥物中的應用：（1)抗癌藥物；（2)抗糖尿病藥物；（3) PTP1B抑制劑；（4)乙酰膽堿酯酶抑制劑;或(5)酪氨酸酶抑制劑。
[0011] 本發明人通過對甘草化學成分的系統分離純化和多種活性篩選驗證，發現了若干 個具有顯著活性的化合物。其中本發明所公開三種化合物，即甘草西定、angustone A和粗 毛甘草素 D，為結構相近的異戊烯基異黃酮類化合物，具有突出的抑制腫瘤細胞存活和抑制 PTP1B的活性以及抑制乙酰膽堿酯酶的活性，粗毛甘草素 D還具有抑制酪氨酸酶的顯著活 性。進一步研究發現，甘草西定能夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡。 Angustone A可以通過誘導細胞凋亡和自途徑抑制多種腫瘤細胞活力，其活性與其抑制 腫瘤細胞糖酵解能力相關。
[0012]根據本發明，甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D可用于制備抗癌藥物或PTP1B 抑制劑和抗糖尿病藥物，甘草西定和粗毛甘草素 D可用于制備乙酰膽堿酯酶抑制劑，粗毛甘 草素 D還可用于制備酪氨酸酶抑制劑和祛斑美白產品。
[0013]以上述活性化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物、立體異構體、互變異構 體、前藥以及它們的混合物為有效成分制備的藥物也屬于本發明的保護范圍。
[0014] 需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體或輔料。 所述載體或輔料包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸 收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
[0015] 利用上述活性化合物或其藥學上可接受的鹽、酯、溶劑化物、立體異構體、互變異 構體以及前藥作為活性成分，單獨或組合使用，或與其它藥物、輔料等配合制備成各種劑 型，包括但不限于片劑、散劑、丸劑、注射劑、膠囊劑、膜劑、栓劑、膏劑、沖劑等多種形式。上 述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
【附圖說明】
[0016] 圖1為甘草西定的核磁共振氫譜(? NMR)。
[0017] 圖2為甘草西定的核磁共振碳譜(13C NMR)。
[0018]圖3為angustone A的核磁共振氫譜（? NMR)〇
[0019] 圖4為angustone A的核磁共振碳譜（13C NMR)。
[0020] 圖5為粗毛甘草素 D的核磁共振氫譜(? NMR)。
[0021] 圖6為粗毛甘草素 D的核磁共振碳譜(13C NMR)。
[0022] 圖7為甘草西定對SW480人結腸癌細胞周期的作用。
[0023] 圖8為甘草西定對SW480人結腸癌細胞凋亡的作用。
[0024] 圖9為angustone A對SW480人結腸癌細胞凋亡的作用。
[0025] 圖10為angustone A抑制SW480人結腸癌細胞克隆形成的作用。
【具體實施方式】
[0026] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0028]實施例1、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D的分離純化。
[0029] 一、實驗材料和方法。
[0030] 本方法中提及的所有化學試劑均購自北京化工廠。
[0031] 取35kg甘草藥材（內蒙古伊利科技實業股份有限公司甘草分公司），粉碎，以10倍 量95%乙醇和70%乙醇各提取兩次，每次2~3小時，減壓回收乙醇，將得到的浸膏（10L)混 懸于水中，用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯部位2500g。取1280g乙酸乙酯部位，經硅膠柱 色譜(200~300目，青島海洋化工有限公司）分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（1:0~1:1)， 得到流分A~J。流分E經MCI柱色譜(成都科普生物有限公司)分離，乙醇-水梯度洗脫(0:1~ 1:0)，得到流分EA~EG。流分EC經聚酰胺柱色譜(浙江臺州路橋四甲生化塑料廠)分離，二氯 甲烷-甲醇梯度先脫（1 :〇~1:1)，得到流分ECA~ECN。流分ECC、ECD和ECH分別經0DS C18柱色 譜(DAIS0公司，日本)分離，甲醇-水梯度洗脫(0:1~1:0)，再經半制備HPLC(Agilent公司， 美國）純化，得到angustone A 70mg，粗毛甘草素 D 14mg，甘草西定900mg。
[0032] 二、實驗結果。
[0033] 將得到的三個化合物的核磁共振譜圖與文獻對比，分別鑒定為甘草西定(楊莉等， 天然產物研究與開發。2009, 448, 438-440)、angustone A(Lane GA 等， Phytochemistry · 1987，26，295-300)和粗毛甘草素 D(Zeng L等，Heterocycles · 1992，34， 375-387)，它們的核磁共振氫譜(? NMR)和碳譜(13C NMR)如圖1~6所示。
[0034]實施例2、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D抑制多種癌細胞活力。
[0035] 一、實驗材料和方法。
[0036] HepG2人肝癌細胞、SW480人結腸癌細胞、A549人肺癌細胞、MCF7人乳腺癌細胞均購 自美國菌種保存中心(ATCC)，所有實驗均采用處于對數生長期的細胞。
[0037] (1)細胞接種于96孔板12小時后，分別加入指定甘草化合物至終濃度為ΙΟμΜ，繼續 培養24小時，再向每孔加入MTS溶液至終濃度為0.5mg/mL，繼續培養2~4個小時，然后用自 動酶標儀于490nm測定各孔吸光度，計算其相對于對照組的抑制率。
[0038] (2)細胞接種于96孔板12小時后，分別加入指定甘草化合物至指定濃度，繼續培養 24小時，再向每孔加入MTS溶液至終濃度為0.5mg/mL，繼續培養2~4個小時，然后用自動酶 標儀于490nm測定各孔吸光度，根據各化合物在指定濃度下相對于對照組的抑制率計算其 半數抑制濃度(IC 5Q)值。
[0039] 二、實驗結果。
[0040]