中藥黃連與吳茱萸的提取物聯合5-氟尿嘧啶在制備治療腸癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及中藥復方左金方與化療藥物聯合治療的新用途。
【背景技術】
[0002] 大腸癌是消化系統中常見的惡性腫瘤之一，包括結腸癌和直腸癌，每年全球有約 120萬名患者被確診為結直腸癌，而有超過60萬名患者直接或間接死于結直腸癌，其發病率 和死亡率分別位于第三位和第四位。男性結直腸癌的發病率高于女性，結直腸癌發病率在 40歲以下年齡段較低，但會隨著年齡的增大而增加。大腸癌是中國最常見也是目前最受關 注的惡性腫瘤之一。從90年代開始，發達國家的結直腸癌發病率開始逐年下降，但是中國等 亞洲發展中國家仍逐年上升，在男性患者中這一流行病學特征更加明顯，嚴重威脅著人類 的身體健康。
[0003] 手術被認為是目前治療結腸癌的主要手段，但由于結腸癌發病的隱蔽性和診療手 段的局限性，多數結腸癌發現時已進入結腸癌發病中晚期，不適于手術治療。目前臨床上對 腸癌一般采取以化療為主、放療、生物免疫治療等為輔的治療手段。但化療有巨大的不良反 應，導致急性肝損傷和腎臟損傷等，大大限制了化療藥物用量，阻礙了藥物功效的發揮，此 外放療治療容易導致放射性腦、脊髓損傷、放射性腦神經損傷、放射性唾液腺損傷以及放射 性的后誘發癌等并發癥。
[0004] 因此，中醫藥結合化療治療中晚期腸癌越來越顯出優勢。中醫藥對大腸癌的治療 研究已經涉及腫瘤發生、發展、死亡、衰老等領域，在大腸癌治療中發揮了積極的作用。大量 醫療實踐證明：中醫藥配合大腸癌手術切除后的輔助治療(化學、靶向、基因、放射、內分泌、 生物療法等），對降低復發、減輕毒副反應、延長病人生存期、提高患者生活質量都有明顯的 優勢.此外，中醫藥的成本相對較低，實用性廣。但是中藥抗腸癌制劑單調，療效不確切，目 前尚無具有廣泛治療作用的臨床制劑問世，大多數中藥制劑為輔助治療用藥，其臨床應用 缺乏規范，且應用效果不理想，嚴重制約了抗腸癌中藥及其復方的廣泛應用和得到國際社 會的認可。
[0005] 左金方（Zou jinPerscription)出自《丹溪心法》，由君藥黃連（Coptischinensis ?1')和佐使藥吳茱萸化￥0(1丨31'11丨36〇3印(]\188.外6111：11.)按6:1重量比例組成，被各藥典收 載，其藥性偏寒，主治肝郁化火，胃失和降，脅痛脘痞、嘔吐吞酸、嘈雜似饑、脈弦數而口苦舌 赤等偏于胃火較甚者。現代醫理研究表明左金方有保護胃粘膜、抑制胃酸分泌、抗潰瘍、影 響胃腸運動的作用。目前臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍。近來，研究證明左金方能誘 導體外培養腸癌細胞HT-29的凋亡，它通過上調腫瘤組織中的Bax蛋白的表達，降低Bcl-2和 Survivin蛋白的表達，顯著抑制了人腸癌裸小鼠移植瘤的生長。
[0006] 目前以術前氟尿嘧啶(5-FU)為基礎的放化療是局部晚期直腸癌的標準治療。5-FU 是放療增敏劑，但對有遠處轉移患者的治療效果不佳，會帶來一些如肛門和性功能損傷的 問題，且不能使生存期進一步延長。所以，由于5-FU具有生物利用度低，對腫瘤細胞選擇性 小，毒副作用大，治療劑量與中毒劑量接近等缺點，大大限制了其臨床應用。
[0007] 中國專利申請101785807A公開了質量比為6:1的中藥黃連與吳茱萸的提取物在制 備治療胃癌藥物中的應用，以及中藥復方左金方在制備治療胃癌藥物中的應用。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU(5-氟脲嘧啶)聯合在制 備治療腸癌藥物中的用途。
[0009] 根據本發明的一方面，中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU(5-氟脲嘧啶)聯合用于 治療腸癌，優選的是將質量比為6:1的中藥黃連與吳茱萸的提取物與化學治療劑5-氟脲嘧 啶聯合應用，更優選的是以中藥復方左金方的制備方式制備所述提取物，因此復方左金方 以及依據該復方制備的左金丸均包含在本發明范圍內，此外，本領域技術人員可以理解的 是，以左金方為基礎藥方，添加其他輔助藥材制備的復方藥物也包含在本發明中。在腸癌的 治療中，所述聯合是指同時給藥或者序慣給藥，即在給予患者提取物之前或者同時或者之 后給予5-FU。
[0010]本發明通過細胞體外試驗證明，中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU聯合用藥比提 取物單獨，或者5-FU單獨用藥對腸癌的治療效果更好。中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU 聯合用藥，顯著提高了 FHC人正常結腸直腸粘膜上皮細胞的存活率，大幅降低了 5-FU的細胞 毒性作用，通過促進HT-29細胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2、Survivin蛋白的低表達，促進 人腸癌細胞的凋亡。本發明的研究成果對降低臨床抗腸癌化療藥物的毒副作用，提高治療 效果，具有重大的意義。
【附圖說明】
[0011]圖1是本發明左金方作用于FHC人結腸直腸粘膜上皮細胞的CCK-8試驗結果，顯示 提取物濃度、作用時間與FHC存活率的關系；
[0012]圖2是本發明5-FU作用于FHC人結腸直腸粘膜上皮細胞的CCK-8試驗結果，顯示5-FU濃度、作用時間與FHC存活率的關系；
[0013]圖3是本發明左金方作用于結腸癌細胞HT-29的流式細胞儀檢測結果，顯示提取物 濃度、作用時間與HT-29凋亡率的關系；
[0014]圖4是本發明5-FU作用于結腸癌細胞HT-29的流式細胞儀檢測結果，顯示5-FU濃 度、作用時間與HT-29凋亡率的關系；
[0015] 圖5是空白對照，1.00yg/mL左金方，50.0yg/mL 5-FU以及1.00yg/mL左金方聯合 50 . Oyg/mL 5-FU分別作用FHC細胞24h的CCK-8試驗結果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提 取物聯合5-FU與FHC存活率的關系；
[0016] 圖6是空白對照，1 ·00yg/mL左金方，100·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL左金方聯合 100.Oyg/mL 5-FU分別作用FHC細胞24h的CCK-8試驗結果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提 取物聯合5-FU與FHC存活率的關系；
[0017] 圖7是空白對照，1 · 00yg/mL提取物，50 · Oyg/mL 5-FU，1 · 00yg/mL提取物聯合50 · ομ g/mL 5-FU分別作用HT-29細胞的流式細胞儀檢測結果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提取 物聯合5-FU與HT-29凋亡率的關系；
[0018] 圖8是空白對照，1.00yg/mL提取物，100.0 yg/mL 5-FU，1.00yg/mL提取物聯合 100.Oyg/mL 5-FU分別作用HT-29細胞的流式細胞儀檢測結果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提取物聯合5-FU與HT-29凋亡率的關系；
[0019] 圖9是空白對照，1.00yg/mL左金方，100.0yg/mL 5-FU，1.00yg/mL左金方聯合 100.0yg/mL 5-FU分別作用HT-29細胞24h，調節細胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表達的 Western Blotting凝膠電泳圖（n = 6);
[0020] 圖 10是空白對照，1.00yg/mL提取物，50.0yg/mL 5-FU，100.00yg/mL 5-FU，1.00y g/mL提取物聯合50·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL提取物聯合100·0yg/mL5-FU分別作用HT-29細胞的細胞形態學顯微鏡觀察圖（X 200)。
【具體實施方式】 [0021] -、試驗材料
[0022]細胞株:FHC細胞(人正常結腸直腸粘膜上皮細胞）、HT-29細胞(人結腸癌細胞)購 自中山大學動物實驗部細胞中心。用含有體積分數為10 %的FBS的DMEM完全培養基，于37 °C，5%的C02孵箱中培養3天進行一次傳代，傳代按1:3進行。取生長期細胞進行實驗。
[0023]中藥黃連與吳茱萸的提取物（下稱提取物或左金方）：中藥黃連（Coptis chinensis Fr)與吳茱萸(Evodiarutaecarp(Juss. )benth.)為市售購買，按6:1 質量混合， 經水煎、濃縮和冷凍干燥制成水提物。原藥材經水提后，得到水提物260(mg)/生藥(g)。
[0024] 左金方傳統湯劑凍干粉：由本實驗室提供，取30g黃連與5g吳茱萸，加8倍蒸餾水浸 泡30min，加水煎煮3次，每次30min，過濾，合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98g; 經HPLC法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿 0.17%，吳茱萸次堿0.19%。
[0025] 制備成試驗中給藥濃度的左金方的方法:將左金方凍干粉溶于去離子水中，配置 成lmg/mL的母液，實驗時用細胞培養液稀釋成所需濃度。
[0026] 5-FU:購自天津金耀氨基酸有限公司，規格：10ml: 0.25g，批號：1412011。
[0027]制備成試驗中給藥濃度的5-FU的方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細胞培養 液配制成lmg/m 1母液，實驗時用細胞培養液稀釋成所需濃度。
[0028]二、檢測方法及數據統計方法 [0029] l、CCK-8檢測細胞活性
[0030] 采用CCK-8檢測試劑盒在規定時間內觀察左金方或者5-FU或者左金方聯合5-FU對 培養FHC細胞的存活率的影響，其中將未經處理的對照組細胞的存活率設定為100%。
[0031] 2、流式細胞儀檢測細胞凋亡率
[0032] 調整HT-29細胞密度為2X105/mL，以1.5mL/well種入6孔板。每組6個復孔。藥物作 用24h后，細胞刷刮取細胞，800r · m