一種胃癌基因工程疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及基因工程疫苗，具體涉及一種新型的胃癌基因工 程疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。目前胃癌的治療手 段主要有手術切除和化療，但均不能有效解決腫瘤轉移、復發等問題。近年來，腫瘤疫苗的 研究給胃癌的防治帶來了希望。但是因為缺乏高效、特異的胃癌特異性抗原或胃癌相關抗 原，使胃癌疫苗的研制發展緩慢。
[0003] 腫瘤疫苗主要包括如下五種：
[0004] -、腫瘤細胞疫苗
[0005] 傳統的瘤苗是通過自體或同種異體腫瘤細胞或其粗提物，經過物理、化學或生物 方法處理后，抑制其生長能力，保持并增強其免疫原性。但這種疫苗的免疫原性弱，難以引 起免疫應答。后來，將腫瘤細胞加入佐劑如卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌或弗氏佐劑等以增 強其免疫原性，但效果仍不理想。而且這種疫苗制備耗時較長，不能滿足快速免疫的需要。 近年來對全細胞瘤苗進行了改進，已嘗試用建株的的腫瘤細胞系作為其替代物。動物實驗 證實，使用處理過的建株腫瘤細胞作為全細胞瘤苗具有以下優點：（a)腫瘤細胞表達多種抗 原，避免了分離、鑒定抗原的煩瑣；（b)用作疫苗的腫瘤細胞表達的MHC可以與患者不匹配， 可作為同種異體抗原，激發免疫應答；（c)用建株腫瘤細胞制備疫苗，簡單易行，大大縮短了 患者從確診到接種疫苗的時間。
[0006] 二、腫瘤基因工程疫苗
[0007] 腫瘤基因工程疫苗是一種通過基因重組技術將目的基因導入受體細胞而制備的 疫苗。隨著免疫基礎理論的發展，各種疫苗的研制也日新月異。國內外學者己將不同的目的 基因導入受體細胞，提高其免疫原性或活化效應細胞的能力。這種疫苗主要從以下幾個方 面來實現其抗瘤效應：（a)提高機體抗瘤能力；（b)增強腫瘤免疫原性；（c)基因產物直接殺 傷瘤細胞。近幾年有關腫瘤基因工程疫苗研究的熱點主要集中在GM-CSF基因疫苗、多基因 聯合修飾疫苗、基因修飾樹突狀細胞和構建樹突狀細胞疫苗，以及免疫修飾基因與自殺基 因的聯合。如將B7-1和IL-4，B7-1和11^-7，1?1￥、61-03?和87-1，幾-12、87-1和腫瘤抗原等 多細胞因子基因進行聯合修飾。多種細胞因子與自殺基因的聯合轉染能揚長避短相互協 同，具有更好的免疫效應。
[0008] 三、樹突狀細胞(DC)疫苗
[0009] 目前用腫瘤抗原肽、腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞RNA體外沖擊DC或將TAA基因轉入 DC內，均被認為是頗有前途的瘤苗制備方案。但各種體外沖擊手段均有半衰期短的缺點，若 要誘導出高水平的持久的抗腫瘤免疫反應，需反復多次體內回輸致敏DC。另外一種用腫瘤 cDNA或mRNA體外沖擊DC的方法可以解決抗原丟失或抗原變異的問題，而且又避免了分離大 量腫瘤抗原肽的困難。現代分子生物學技術己可以較容易地大量擴增腫瘤mRNA及構建腫瘤 的cDNA文庫，這為我們提供了龐大的腫瘤抗原庫，也為應用cDNA、mRNA體外沖擊DC細胞提供 了原料。體外用腫瘤cDNA或mRNA沖擊DC細胞無須確定腫瘤抗原，而且理論上講沖擊后的DC 細胞可以表達任何一種可能的腫瘤相關抗原，因而被一些研究采用并取得了良好的效果。 [0010]四、肽疫苗
[0011]抗原提呈過程和免疫識別的研究，己證實腫瘤抗原須在APC胞內降解為短肽，最后 形成肽-MHC-TCR復合物才能為T細胞識別，并激發CTL反應，這為肽疫苗的研究提供了理論 依據。所用腫瘤抗原多肽可分為兩類:人工合成多肽和自然源性多肽。合成多肽疫苗是隨著 腫瘤抗原表位的確定發展起來的。根據腫瘤抗原表位合成相應的多肽，然后與佐劑一起或 單獨免疫，可以誘導針對免疫原性表位的抗腫瘤免疫反應。合成多肽疫苗的優點在于:誘導 免疫反應的特異性較高;可以大量合成;抗原純度高;對各種組織型應用廣泛;僅需要少量 的病人腫瘤組織（用于確定抗原的表達）；可以激活CD+4T和CD+ST細胞。合成肽疫苗的這些 優點使之成為一種重要的的疫苗策略。
[0012] 五、核酸疫苗
[0013] 核酸疫苗是由能引起保護性免疫反應的抗原基因片段及其載體構建而成。包括 DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。與其他疫苗相比，DNA疫苗具有許多優點： 接種基因可以長期表達，誘導的免疫反應持久高效;制備簡單，容易構建，經濟省時;與重組 蛋白相比，基因疫苗更接近于自然感染狀態;免疫反應強烈，特異，廣泛，全面，且能夠產生 交叉免疫保護；核酸疫苗能同時激發機體細胞免疫和體液免疫反應，能誘導許多亞單位疫 苗所不能誘導的CTL效應;穩定性好，容易保存;可以誘導不成熟免疫系統產生T細胞免疫應 答;無感染復制危險，不會產生回復突變;可用同一載體制備針對多種疾病的基因疫苗，研 制多價疫苗。
[0014] GM-CSF(粒巨細胞集落刺激因子)是一種主要由巨噬細胞和活化細胞產生的細胞 因子，其可通過促進分化成熟樹突狀細胞、巨噬細胞等抗原呈遞細胞分化、成熟和活化進而 促進Th、Tc、NK識別腫瘤相關抗原，在腫瘤部位浸潤，引起系統性抗腫瘤反應，殺傷腫瘤的同 時還可促進細胞CD45T細胞分化成熟及黏附分子B7/BB1的表達，提高其抗原呈遞能力。另 外還可增加巨噬細胞主要組織相容性復合物II (MHCII)的表達，提高其抗原呈遞能力。GM-CSF基因修飾的腫瘤細胞被放射線滅活后往體內注射，可增加局部炎性反應，大量多核細 胞、巨噬細胞和DC浸潤，促進腫瘤抗原呈遞，能夠誘導強烈的抗腫瘤免疫反應。
【發明內容】
[0015] 本發明的目的在于提供一種新型的胃癌基因工程疫苗，該基因工程疫苗包括GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞和佐劑；其中，GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞可穩定表達GM-CSF，殺傷腫瘤細胞;佐劑可以顯著增強GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞對胃癌細胞的殺傷 力，二者具有顯著的協同作用。
[0016] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0017] -種胃癌基因工程疫苗，包括GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞和佐劑；
[0018] 所述GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞通過如下步驟制備：
[0019] 步驟S1，用含GM-CSF基因的重組仙臺病毒上清液感染人胃癌細胞，得到GM-CSF基 因修飾的人胃癌細胞；
[0020]步驟S2,對步驟S1得到的GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞滅活并進行熱休克處理； [0021]所述佐劑通過如下步驟制備：
[0022] 步驟S1，取對數生長期的人胃癌細胞接種于含體積百分比10%FBS的RPMI 1640細 胞培養液中，加入15~25ymol/mL的如下結構式的化合物（I)培養36~48h得細胞培養液，
[0024]步驟S2，將細胞培養液離心棄上清液，沉淀懸浮于生理鹽水中，再放入液氮中冷凍 5~10分鐘，再將冷凍物取出，放入37°C溫水融化，如此反復凍融3~5次，即可得所述佐劑。
[0025] 進一步地，所述佐劑通過如下步驟制備：步驟S1，取對數生長期的人胃癌細胞5X 1〇7個接種于lml含體積百分比10%FBS的RPMI 1640細胞培養液中，加入20ymol/mL的所述 化合物（I)培養42h得細胞培養液;步驟S2，將細胞培養液離心棄上清液，沉淀懸浮于lml生 理鹽水中，再放入液氮中冷凍5~10分鐘，再將冷凍物取出，放入37°C溫水融化，如此反復 凍融3~5次，即可得所述佐劑。
[0026]進一步地，所述人胃癌細胞為SGC-7901人胃癌細胞系。
[0027]進一步地，所述滅活方法為采用6()C〇照射滅活。
[0028]進一步地，所述熱休克處理方法為：將人胃癌細胞置于42 °C~65 °C條件下溫浴 0.5h~2h。
[0029] 所述的胃癌基因工程疫苗在制備預防或治療胃癌的藥物中的應用。
[0030] 本發明的優點：
[0031] 本發明提供的基因工程疫苗包括GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞和佐劑;其中，GM-CSF基因修飾的人胃癌細胞可穩定表達GM-CSF，殺傷腫瘤細胞;佐劑可以顯著增強GM-CSF基 因修飾的人胃癌細胞對胃癌細胞的殺傷力，二者具有顯著的協同作用，能夠協同預防和治 療胃癌，特別是反復多次接種能夠進一步提高預防或治療腫瘤的效果。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。未詳 細描述的試驗方法均為本領域常規試驗操作，未特別強調的儀器和試劑均為本領域常規儀 器和試劑。
[0033] 實施例1 :GM_CSF基因修飾的人胃癌細胞的制備
[0034] 第一步:含信號肽的粒巨細胞集落刺激因子cDNA的制備
[0035] 1、粒巨細胞集落刺激因子mRNA的制備：
[0036] (1)人外周血淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，共約IX 106細胞，經誘導刺激30 小時，使細胞因子基因表達，以備抽提mRNA。
[0037] (2)mRNA的抽提:離心收集細胞，懸浮于1.5ml RNA抽提緩沖液，用注射器反復抽打 勻漿細胞，然后再補加3ml抽提緩沖液，充分混合，離心lOOOcpm 5分鐘，收集上清。取01 igo (dT)-Cellylose Spun Column，混合內容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內液體，取4ml上清上 柱，混勻，棄去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經65°C預