一種二聯滅活疫苗制備方法

一種二聯滅活疫苗制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種二聯滅活疫苗制備方法，本發明制備的二聯滅活疫苗用于預防豬O型口蹄疫、豬圓環病毒2型，本發明制備方法簡單，疫苗的抗原含量高，免疫方便，與現有技術中的分次免疫相比，減少了免疫次數，減少了應激反應，降低了免疫成本。其次，通過二聯疫苗與單價疫苗免疫仔豬的效力比較發現，兩種抗原成分在同一針二聯疫苗中不僅相互沒有干擾，而且二聯疫苗單次注射仔豬的免疫效果高于兩種單苗先后注射的免疫效果。
【專利說明】一種二聯滅活疫苗制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及疫苗【技術領域】，具體涉及一種二聯滅活疫苗制備方法。

【背景技術】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一種急性和高度接觸性的動物傳染病。FMDV感染對象 為牛、羊、豬等家養以及野生的偶蹄動物。流行病學調查和感染實驗證明，約有100多種動 物可感染此病毒。該病的臨床特征是傳播速度塊、流行范圍廣，成年動物的口腔黏膜、蹄部 和乳房等處發生水泡和潰爛，幼齡動物多因心肌受損導致較高的死亡率。除動物死亡造成 直接經濟損失外，動物在患病期間肉和奶的生產停止，哺乳期產奶量降低，耐過動物生長緩 慢，種用價值喪失，也可造成嚴重的經濟損失。本病分布于世界各地，在亞洲、非洲、南美洲 和中東等地區廣泛流行，而已消滅口蹄疫的國家和地區常有重新爆發本病的例證。鑒于口 蹄疫對世界經濟發展、生態和諧及社會安全等方面危害極大，國際獸醫局（OIE)和聯合國 糧農組織（FAO)將其列為必須通報的疫病之一，我國也將其列為一類動物傳染病的第一 位。
[0003] 豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV)是迄今發現的一種最小的動物病毒。現 已知PCV有兩個血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒，而PCV2為致病性的病 毒，PCV2 除導致仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome， PMWS)外，還能導致母豬的繁殖障礙，PCVD廣泛存在于世界各地的豬群中，造成很大的經濟 損失。
[0004] 近年來，我國豬群中PCV2和豬0型FMDV流行十分嚴重，發病率和死亡率也不斷提 高，給養豬業造成巨大經濟損失。當前對這2種病毒性疫病的防控主要采用滅活疫苗，但 PCV2滅活疫苗存在病毒難培養的現實，FMDV滅活疫苗存在因滅活不徹底而散毒的危險。研 宄表明，利用生物反應器培養的PCV2病毒可提高病毒滴度和重組蛋白研制的亞單位疫苗 對FMDV感染具有良好的免疫效果，FMDV的結構蛋白Vpl包含FMDV的主要抗原位點，是病毒 的主要免疫保護性抗原，能誘導動物機體產生保護性中和抗體，可用于FMDV亞單位疫苗的 研制。因此，研制同時預防這兩種病毒性疫病的二聯疫苗具有重要意義。急需FMDV和PCV2 的二聯滅活疫苗，以同時預防0型口蹄疫和PCV2引起的PMWS綜合癥。


【發明內容】

[0005] 本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種二聯滅活疫苗制備方法，該方法 采用原核表達系統表達純化FMDV-Vpl蛋白，結合現有PCV-2全病毒滅活疫苗生物反應器懸 浮培養的高滴度病毒，制備出豬〇型口蹄疫VPl亞單位、PCV-2二聯滅活疫苗。
[0006] 為了實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：
[0007] 一種二聯滅活疫苗制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主細胞進行病毒擴增，確保病毒效價彡107_°TCID 5(l/ml， 收獲細胞毒液；
[0009] 2)將步驟1)得到的細胞毒液，利用中空纖維濾柱進行澄清濃縮處理；
[0010] 3)將步驟2)濃縮處理后的病毒在攪拌狀態下按0. 1?0. 3% (v/v)的比例加入 0 -丙內酯滅活，得到第一抗原原液；
[0011] 4)取pET28a-FMDV VPl菌株進行培養擴增，而后向培養體系中加入0. 1?Immol/ L的IPTG進行誘導，誘導時間為4?6h，誘導溫度為25?37°C，而后收集菌體，破壁，收集 包涵體；
[0012] 5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15?25mg/mL的濃度重懸步驟4)得到的包 涵體，收集上清液，再用Ni 2+柱純化蛋白，復性蛋白，再過濾除菌，即得到第二抗原原液；
[0013] 6)將步驟3)得到的第一抗原原液與步驟5)得到的第二抗原原液按比例混合，即 得到混合抗原原液，上述按比例是確保得到的混合抗原原液中PCV2含量為10 7_°TCID50/頭 份、FMDV VPl蛋白含量為80 y g/頭份或PCV2蛋白含量為107 5TCID50/頭份、FMDV VPl蛋 白含量為100 U g/頭份；
[0014] 7)將步驟6)得到的混合抗原原液與疫苗佐劑攪拌混勻，即得到一種二聯滅活疫 苗。
[0015] 優選的，步驟1)的具體流程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染復數為0. 005?0. 02 接種于PK-15細胞，34?39°C吸附25?35min，加入含2?5%犢牛血清和0. 5?2mmol/ L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細胞維持液，34?39°C培養，而后反復凍融，確保病毒效價 彡10 7°TCID5Q/ml，收獲病毒。
[0016] 優選的，步驟7)混合抗原原液與疫苗佐劑的混合比例為I: I (v/v)。
[0017] 優選的，步驟2)濾柱澄清處理之前先利用菲托濾板進行一步過濾處理。
[0018] 優選的，步驟3)滅活條件為：加入0-丙內酯后置于4°C條件下攪拌滅活48? 72h，然后置于37°C水浴2h。
[0019] 優選的，步驟4)所述的擴增培養具體包括以下流程：取pET28a-FMDV VPl菌株劃 線至Kan+抗性培養板，37°C過夜培養，挑取單個菌落接入IOmL含有Kan+的液體LB培養基 中，37°C 220r/min 振蕩培養 ll-16h。
[0020] 優選的，步驟4)所述的破壁具體包括以下流程：用1/10菌液體積的wash buffer 重懸菌體，加100 U g/mL溶菌酶，于冰上超聲破碎菌體。
[0021] 優選的，步驟4)具體包括以下流程：IPTG誘導濃度為0. 8mmol/L，誘導時間為5h， 誘導溫度為，37°C。
[0022] 優選的，步驟5)所述的Ni2+柱為Ni-NTA柱。
[0023] 優選的，步驟5)所述的復性方法為：稀釋復性結合超濾濃縮。
[0024] 優選地，步驟7所述疫苗佐劑為ISA206、ISA201、Gel01、ISA28VG等的一種或幾種 組合物；更優選地，為ISA201。上述名稱為商品名，其中帶有ISA字樣的佐劑為賽比克公司 制造的ISA系列疫苗佐劑。
[0025] 以上技術方案所述的pET28a-FMDV VPl表達菌株，其保藏編號為CCTCC M2014406。
[0026] 本發明制備的二聯滅活疫苗用于預防豬0型口蹄疫、豬圓環病毒2型，本發明制備 方法簡單，疫苗的效價含量高，免疫方便，與現有技術中的分次免疫相比，減少了免疫次數， 減少了應激反應，降低了免疫成本。
[0027] 其次，通過二聯疫苗與單價疫苗免疫仔豬的效力比較發現，兩種抗原成分在同一 針二聯疫苗中不僅相互沒有干擾，而且二聯疫苗單次注射仔豬的免疫效果高于兩種單苗先 后注射的免疫效果。
[0028] 即本發明的PCV2、PPV的二聯滅活疫苗，具有以下有益效果：
[0029] 1)二聯滅活疫苗免疫仔豬后，副反應降低，安全性更佳，避免了多次接種免疫出現 的不良反應。
[0030] 2)二聯滅活疫苗免疫母豬后，通過母源抗體，仔豬獲得被動免疫，明顯降低了仔豬 的死亡率，提高了存活率，增加了經濟效益。
[0031] 4)二聯滅活疫苗免疫仔豬，與現有技術中的分次免疫相比，降低了免疫成本，節約 了免疫程序，更加經濟可靠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明實施例1的疫苗制備流程圖。

【具體實施方式】
[0033] 實施例1豬圓環病毒2型、豬口蹄疫VPl亞單位二聯滅活疫苗
[0034] 1生產用毒種的制備
[0035] I. 1PCV2ZJ/C株的制備：將毒種用病毒稀釋液（無血清的MEM培養基）作適當稀 釋，按感染復數（M. 0. I.)為0. 01接種于PK-15細胞培養，37°C吸附30min，加入含3% (v/ v)犢牛血清和lmmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細胞維持液，37°C培養5日，反復凍融 3次，收獲病毒，病毒效價》10 7_ciTCID5ciAil。
[0036] I. 2VP1蛋白表達菌種的活化：將保存的原核表達菌種劃線至Kan+抗性培養板， 37°C過夜培養。挑取單個菌落接入IOmL含有Kan+的液體LB培養基中，37 °C 220r/min振 蕩培養ll-16h，作為誘導表達用菌種。
[0037] 2制苗抗原的制備
[0038] 2.1PCV2抗原的制備
[0039] 2. I. 1病毒液培養：選擇動物細胞用生物反應器IOL至42L消化放大接毒、低血清 懸浮培養工藝技術，〇. 25% EDTA-胰酶消化，用含3%低血清的MEM專用細胞生長液制備成 4 X IO5個/mL的細胞懸液，按1 %比例接種生產用毒種，37°C，攪拌轉速35rpm/h，接種后每 日觀察1-2次，培養至72-96h棄營養液，凍融收獲細胞及培養液，于-20°C保存備用。
[0040] 2. L 2病毒含量測定
[0041] 以0. 25%的EDTA-胰酶將生長良好的PK15細胞進行消化分散，并以細胞生長液 重懸（8% NBCS MEM)為濃度為2 X IO5個/ml的細胞懸液，接種于96孔細胞培養板，IOOul/ 孔，置于37°C，5% 0)2細胞培養箱中。
[0042] 取病毒液以無血清MEM進行10倍倍比梯度稀釋，將稀釋后各梯度（KT4?KT 7)病 毒液接種于步驟1已經加入細胞懸液的96孔細胞培養板中，IOOul/孔，每個梯度6或8個 重復孔，設置陽性與陰性對照，37 °C，5 % CO2細胞培養箱中培養72h。
[0043] 維持培養結束后，棄盡板孔內維持液，以甲醇/丙酮固定液（1:1)對細胞進行固 定，IOOul/孔，-20°C，5?lOmin。棄盡固定液，將細胞板風干；以1 %的牛血清白蛋白（BSA) 溶液進行封閉處理，IOOul/孔，37°C，孵育60min。以0. OlM PBS洗3遍，200ul/孔。將1000 倍稀釋的一抗添加于細胞培養板，IOOul/孔，37°C，孵育60min。以0. OlM PBS洗5遍，200ul/ 孔次。添加200倍稀釋的熒光色素（FITC標記的二抗，IOOul/孔，37°C，孵育60min。棄盡 二抗，以0. OlM PBS洗5遍，200ul/孔，熒光顯微鏡下觀察。統計出現特異熒光孔的數目，按 Reed-Muench法計算對病毒滴度（TCID 5tl)。
[0044] 2. 1. 3抗原的澄清和純化
[0045] 將PCV2ZJ/C株合格的細胞毒液，分別用菲托濾板（澄清裝置）進行澄清處理，而 后澄清毒液再用GE公司的中空纖維純化系統（300KDa中空纖維柱）進行雜蛋白進一步去 除和濃縮處理。
[0046] 2. L 4病毒液的滅活
[0047] 病毒滅活：將病毒液置于滅活容器中，在攪拌狀態下按1:2000比例緩慢加入 0-丙內酯，置于4°C條件下攪拌滅活48h，然后置于37°C水浴2h，2-8°C保存，不超過1個 月。
[0048] 滅活檢驗：取滅活病毒液1份與9份PK15細胞懸液（2 X IO5個/mL)充分混勻，接 種5個不小于25cm2的細胞培養瓶，同時設置病毒陽性對照。于37°C、5% CO 2培養箱培養 72h，收獲細胞及培養液，凍融3次作為盲傳的接種物，盲傳2代，IFA方法檢驗產物，滅活病 毒的接種細胞均應無綠色熒光，病毒接種的對照細胞均應有綠色熒光。
[0049] 無菌檢驗：滅活病毒液接種TG小管、GA斜面各2支，每支0. 2mL，l支置37°C培養， 一支置于25°C培養，另取0. 2mL接種1支GP小管置于25°C培養，均培養7d，應無菌生長。
[0050] 2. 2VP1蛋白抗原的制備
[0051] 2. 2. IVPl蛋白的誘導表達：按1:100比例接種新鮮菌液至含Kan+的LB液體培養 基，37°C，180rpm/min，培養 3. 5h，測定 0D6QQ，加入 0? 8mmoL/L IPTG 誘導，37°C，培養 5h。收 集菌體。用1/10菌液體積的wash buffer重懸菌體，加IOOy g/mL溶菌酶，于冰上超聲破 碎菌體，收集包涵體。
[0052] 2. 2. 2VP1蛋白的純化：CAPS裂解液或尿素裂解液裂解包涵體：按20mg/mL的比例 用裂解液重懸包涵體（必要時需要超聲混勻），收集含有可溶蛋白的上清。Ni 2+柱純化蛋 白，稀釋復性蛋白，結合超濾濃縮獲得足量的蛋白。測定內毒素含量< 50EU，蛋白濃度達到 lmg/mL。經過0. 22um濾膜過濾除菌，保存備用。
[0053] 2. 4 配苗
[0054] 將濃縮、純化后的2抗原液按合適比例混合，然后混合液與ISA201佐劑（法國賽 比克SEPPIC公司生產）按I : I (V/V)混合，以300轉/分鐘攪拌30min即可。
[0055] 本發明實施例1中上述制備二聯疫苗的方法可參照圖1。
[0056] 2. 5性狀檢驗
[0057] 外觀：乳白色乳劑，久置后后，上層有少量油析出，振搖后呈均勻乳劑。劑型：水包 油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應呈云霧狀擴散。穩定性：吸取疫 苗IOmL加入離心管中，2500rpm離心3min，乳液未分明，即達到使用要求。黏度：用ImL吸 管（下口內徑I. 2mm，上口內徑2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其垂直自然流出0. 4mL， 記錄所需時間，應在8s以內。將上述制備的3批（批號為：201401、201402、201403)。性狀 檢驗結果符合要求。將上述制備的3批（批號為：201401、201402、201403)。性狀檢驗結果 符合要求。性狀檢驗結果見表1。
[0058] 2. 6無菌檢驗：按《中華人民共和國獸藥典》（2010年版）附錄進行，疫苗應無菌生 長。無菌檢驗結果見表1，結果表明3批疫苗（批號為：201401、201402、201403)無菌生長， 疫苗成品合格。
[0059] 表13批二聯滅活疫苗的性狀檢驗、無菌檢驗和安全性檢驗結果
[0060]

【權利要求】
1. 一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取PCV2ZJ/C毒株感染宿主細胞進行病毒擴增，確保病毒效價多107_°TCID5(l/ml，收獲 細胞毒液； 2) 將步驟1)得到的細胞毒液，利用中空纖維濾柱進行澄清濃縮處理； 3) 將步驟2)濃縮處理后的病毒在攪拌狀態下按0. 1?0. 3% (v/v)的比例加入0 -丙 內酯滅活，得到第一抗原原液； 4) 取pET28a-FMDV VP1菌株進行培養擴增，而后向培養體系中加入0. 1?lmmol/L的 IPTG進行誘導，誘導時間為4?6h，誘導溫度為25?37°C，而后收集菌體，破壁，收集包涵 體； 5) 利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15?25mg/mL的濃度重懸步驟4)得到的包涵體， 收集上清液，再用Ni2+柱純化蛋白，復性蛋白，再過濾除菌，即得到第二抗原原液； 6) 將步驟3)得到的第一抗原原液與步驟5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到 混合抗原原液，上述按比例是確保得到的混合抗原原液中PCV2含量為107_°TCID50/頭份、 FMDV VP1蛋白含量為80 y g/頭份或PCV2蛋白含量為107 5TCID50/頭份、FMDV VP1蛋白含 量為100 u g/頭份； 7) 將步驟6)得到的混合抗原原液與疫苗佐劑攪拌混勻，即得到一種二聯滅活疫苗。
2. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟1)的具體流 程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染復數為0. 005?0. 02接種于PK-15細胞，34?39°C吸附 25?35min，加入含2?5%犢牛血清和0. 5?2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細胞 維持液，34?39°C培養，而后反復凍融，確保病毒效價彡107_°TCID5(l/ml，收獲病毒。
3. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟7)混合抗原原 液與疫苗佐劑的混合比例為1:1 (v/v)。
4. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟2)濾柱澄清處 理之前先利用菲托濾板進行一步過濾處理。
5. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟3)滅活條件 為：加入0 _丙內酯后置于4°C條件下攪拌滅活48?72h，然后置于37°C水浴2h。
6. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述的擴增 培養具體包括以下流程：取pET28a-FMDV VP1菌株劃線至Kan+抗性培養板，37°C過夜培養， 挑取單個菌落接入10mL含有Kan+的液體LB培養基中，37°C 220r/min振蕩培養ll-16h。
7. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)所述的破壁 具體包括以下流程：用1/10菌液體積的PBS緩沖液重懸菌體，加100 y g/mL溶菌酶，于冰上 超聲破碎菌體。
8. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟4)具體包括以 下流程：IPTG誘導濃度為0. 8mmol/L，誘導時間為5h，誘導溫度為，37°C。
9. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟5)所述的Ni 2+柱為Ni-NTA柱。
10. 根據權利要求1所述的一種二聯滅活疫苗制備方法，其特征在于步驟5)所述的復 性方法為：稀釋復性結合超濾濃縮。
【文檔編號】A61P31/14GK104474542SQ201410659965
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】呂茂杰, 梁武, 楊保收, 李亞杰, 邊程 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司