治療類風濕性關節炎的干細胞制劑及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，一種治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，包括間充質干細胞、人血白蛋白和NSADs。本發明通過采用間充質干細胞結合人血白蛋白和NSADs，能夠在減輕患者疼痛的同時提高類風濕性關節炎的治療效果，并且縮短了治療時間，對類風濕性關節炎的臨床診治具有重要意義。
【專利說明】
治療類風濕性關節炎的干細胞制劑及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種治療類風濕性關節炎的干細胞制劑及其 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 類風濕性關節炎(RA)是一種慢性炎癥性免疫性疾病，以血管炎和滑膜炎為基本病 理特征，隨著病情的發展，繼而以滑膜增殖和贅生、關節軟骨及軟骨下骨侵蝕為主要病理改 變，最終導致關節強直畸形和功能喪失；目前認為自身抗原介導的超敏反應以及非抗原特 異性炎癥反應是導致破壞性病變的主要原因。對于RA的治療，傳統主要使用非留體類抗炎 藥物(NSADs)和慢作用抗風濕藥（SAARDs)，但病情復發率高，副作用很明顯，而且不能改變 病情的進展。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中類風濕性關節炎治療效率差等缺 陷，提供一種能夠提高治療效率且不易復發的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑及其制備 方法和應用。
[0004] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種治療類風濕性關節炎的干 細胞制劑，包括間充質干細胞、人血白蛋白和NSADs。
[0005] 在本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑中，所述間充質干細胞的濃度 為(1 ~5) X107個/ml。
[0006] 在本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑中，所述干細胞制劑中，所述 干細胞制劑中，所述人血白蛋白的質量分數為〇. 5~2 %。
[0007] 在本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑中，NSADs的濃度為15~50mg/ ml〇
[0008] 本發明提供一種治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 獲取間充質干細胞，用基礎培養基重懸間充質干細胞后加入人血白蛋白，獲得干 細胞混懸液，然后向干細胞混懸液中逐滴添加 NSADs，邊加邊混合均勻。
[0010] 在本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法中，所述間充質干 細胞為第3~5代任一代的臍帶血間充質干細胞。
[0011] 在本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法中，所述干細胞懸 液與NSADs的體積比為(1~3): 1。
[0012] 本發明進一步保護上述干細胞制劑在制備治療類風濕性關節炎的藥物中的應用。
[0013] 實施本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑及其制備方法和應用，可以 達到以下有益效果:本發明通過采用間充質干細胞結合人血白蛋白和NSADs，能夠阻止炎性 介質的釋放，減輕炎癥反應，從而減輕組織損傷;并且，在減輕患者疼痛的同時提高類風濕 性關節炎的治療效果，不僅縮短了治療時間，而且不易復發，對類風濕性關節炎的臨床治療 具有重要意義。
【具體實施方式】
[0014] 本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，包括間充質干細胞、人血白蛋 白和NSADs。
[0015] 其中，間充質干細胞在體外能夠分化為成骨、軟骨、脂肪、腱、肌肉等細胞，能夠參 與受損組織的再生修復;關節病變能夠促進間充質干細胞向病變滑膜聚集，并促使間充質 干細胞分化為軟骨細胞等，從而修復損傷的關節組織；另外，間充質干細胞能夠分泌多種細 胞因子，具有營養作用，能夠促進干細胞的增殖和分化;且間充質干細胞具有獨特的免疫調 節作用，自體或異體的間充質干細胞加入到有絲分裂原刺激的外周血淋巴細胞培養體系 中，均能明顯抑制T淋巴細胞的增殖活化，對免疫網絡的調節起重要作用，能夠從根本上調 整患者病態免疫系統;此外，研究發現間充質干細胞分化成其他類型的細胞，也繼續保留它 的免疫調節作用；除此之外，間充質干細胞具有趨化作用，可以阻止炎性介質的釋放，減輕 炎癥反應，從而減輕組織損傷，有利于組織病情進展。優選地，間充質干細胞的濃度為（1~ 5) X107個/ml。
[0016] NSADs(非留體類抗炎藥物)是一類非類固醇激素類的能夠消除疼痛、腫脹、四肢僵 直及炎癥的藥物，配合人血白蛋白和間充質干細胞使用，用于減輕炎癥反應，調節免疫反 應，以提尚治療效率；另外，人血白蛋白同時能夠為間充質干細胞提供一定的營養支持，以 使間充質干細胞保持其細胞活性，延長其存活時間，并提高干細胞制劑的生物相容性，減輕 免疫排除反應。優選地，人血白蛋白的質量分數為〇. 5~2%，NSADs的濃度為15~50mg/ml。
[0017] 進一步地，本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法，包括以 下步驟：
[0018] S1、獲取間充質干細胞；
[0019] 步驟S1中，本發明優先采用第3~5代任一代的臍帶血間充質干細胞，具體獲取過 程為：
[0020] S11、原代臍帶間充質干細胞的分離培養；
[0021] S12、對原代臍帶間充質干細胞進行傳代培養至收獲第3~5代任一代臍帶血間充 質干細胞。
[0022] S2、間充質干細胞混懸液的制備；
[0023]步驟S2中，采用基礎培養培養基重懸步驟S12中獲得的第3~5代任一代臍帶血間 充質干細胞，然后將人血白蛋白滴加進臍帶血間充質干細胞內，邊加邊混合，獲得干細胞混 懸液。
[0024] S3、干細胞制劑的混合制備。
[0025] 向步驟S2中獲得的干細胞混懸液中滴加 NSADs溶液，每2~5秒滴加一滴，邊加邊混 合均勻，優選地，干細胞混懸液和NSADs的體積比為（1~3): 1，即收獲本發明提供的治療類 風濕性關節炎的干細胞制劑。
[0026] 本發明進一步保護該干細胞制劑在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用。
[0027] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限 定本發明。
[0028] 實施例1
[0029] 本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0030] S1、獲取間充質干細胞；
[0031] S11、獲取原代間充質干細胞；
[0032] 取正常足月健康嬰兒臍帶，浸泡于生理鹽水(每毫升含25U肝素鈉）中。超凈臺內取 出臍帶，以含有1 %青-鏈霉素的ros液充分沖洗臍帶外表面，20ml注射器沖洗臍帶動、靜脈 管腔后，將其置于1%青鏈霉素的PBS液中10分鐘，取出后將其剪切成lmmXlmmXlmm大小的 組織塊，在剪切時向所操作的組織上滴加1-2滴培養液，以保持組織濕潤。將組織塊接種于 培養瓶中，均勻鋪放，上置蓋玻片，待2h后，再加入間充質干細胞生長培養液，置入37°C且含 有5%C0 2的細胞培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞自組織塊周邊游出、貼壁后，每 隔3d更換培養液。當細胞貼壁生長達70 %以上匯合后，棄組織塊，以0.25 %的胰酶/0.02 % EDTA消化。輕輕搖動培養瓶，使消化液覆蓋所有細胞表面，倒置顯微鏡下觀察，見細胞間隙 增大，胞質回縮，用血清終止消化，即獲得原代間充質干細胞。
[0033] S12、傳代培養；
[0034]反復輕吹瓶壁細胞，制成單細胞懸液，取一滴消化后的細胞懸液，加入苔盼藍染 液，顯微鏡觀察細胞活性，活細胞率大于98%時，其余單細胞懸液置于離心管中，lOOOrpm， 離心3min。用間充質干細胞生長培養液重懸細胞，按1:2~1:3的比例傳代培養，并標記為 Passage 1 (P1 )，每3d換液，倒置相差顯微鏡下觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重 復上述操作，反復傳代擴增。傳至P3后，剩下形態較為單一的細胞。
[0035] S2、制備P3代間充質干細胞混懸液；
[0036]用間充質干細胞生長培養基重懸P3代間充質干細胞;然后，取5ml人血清白蛋白勻 速滴加于間充質干細胞中，邊加邊混合均勻，獲得干細胞混懸液。
[0037] S3、干細胞制劑的制備；
[0038]向步驟S2中獲得的干細胞混懸液中滴加 NSADs溶液，干細胞懸液與NSADs的體積比 為1:1，每3s滴加一滴，邊加邊混合均勻，然后，用生理鹽水重懸混合液，使得間充質干細胞 的細胞濃度為3 X 107個/ml，人血白蛋白的質量分數為1 %，NSADs的濃度為25mg/ml;然后， 分裝到預充注射器中，放到-80°C冰箱中凍存，待用。
[0039]為進一步驗證本發明提供的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑具有顯著的有益 效果，設置以下實驗進行驗證。
[0040]選出60名患者，入選標準，1987年美國風濕病學會(ARA)修訂的診斷標準:①晨僵 至少1小時U 6周）；②腕掌指關節或近端指間關節腫U 6周）；③3個或者3個以上關節腫 U 6周）；④對稱性關節腫U 6周）；⑤皮下類風濕結節;⑥手線變化;⑦類風濕因子陽性;具 有其中四項即可診斷為類風濕性關節炎患者。
[0041 ]實驗組:20例患者均直接將本發明提供的細胞數為3 X 107的干細胞制劑30ml靜脈 輸注，同時，將部分干細胞制劑用生理鹽水按1:4比例稀釋，沿脊柱兩側豎脊肌及骶髂關節 區域點狀注射;并設置以下對照組：
[0042] 對照組1:與實驗組的不同之處在于，20例患者輸注的是單純間充質干細胞制劑。
[0043] 對照組2:與實驗組的不同之處在于，20例患者輸注的是單純NSADs制劑。
[0044] 28個關節的疾病活動度評分:檢查雙側近端指間關節、掌指關節、腕關節、肘關節、 肩關節及膝關節共計28個關節，得出關節觸痛數(T28)和腫脹關節數(SW28)，并結合紅細胞 沉降率（ESR)，采用以下公式計算：DAS28= [0 · 56 X T28+0 · 28 X SW28+0 · 70 X Ln(ESR) ] X 1.08+0.16 AAS28 < 2.6分提示病情處于緩解期；2.6~3.2分之間提示病情處于低活動度； 3.2~5.1分之間提示病情為中活動度;>5.1分提示病情為高活動度。
[0045] 表1:
[0047] 表1數據為各組患者在治療前的DAS28平均分
[0048] 以下數據為患者治療4-14個月內的隨訪記錄，表2為各組患者平均分；
[0049] 表2:
[0051] 結果顯示，實驗組患者在治療第10個月，DAS28S 2.6分，病情即處于緩解期；而對 照組1和對照組2患者在治療第14個月時仍未得到緩解，由此說明本發明提供的干細胞制劑 縮短了類風濕性關節炎的治療周期，提高了治療效率。
[0052]以上對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述的具體實施方 式，上述的【具體實施方式】僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發 明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發明的保護之內。
【主權項】
1. 一種治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，其特征在于，包括間充質干細胞、人血白蛋 白和NSADs。2. 根據權利要求1所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，其特征在于，所述間充質 干細胞的濃度為（1~5) X107個/ml。3. 根據權利要求2所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，其特征在于，所述人血白 蛋白的質量分數為0.5~2 %。4. 根據權利要求3所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑，其特征在于，NSADs的濃 度為 15 ~50mg/ml。5. -種如權利要求1~4任一項所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟： 獲取間充質干細胞，用基礎培養基重懸間充質干細胞后加入人血白蛋白，獲得干細胞 混懸液，然后向干細胞混懸液中逐滴添加 NSADs，邊加邊混合均勻。6. 根據權利要求5所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于， 所述間充質干細胞為第3~5代任一代的臍帶血間充質干細胞。7. 根據權利要求6所述的治療類風濕性關節炎的干細胞制劑的制備方法，所述干細胞 懸液與NSADs的體積比為（1~3): 1。8. 根據權利要求1~4任一項所述的干細胞制劑在制備治療類風濕性關節炎的藥物中 的應用。
【文檔編號】A61P19/02GK105833277SQ201610185696
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月29日
【發明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫學科技有限公司