一種建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法及應用

一種建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法及應用
【專利摘要】本發明公開一種斷奶仔豬炎癥反應模型的建立方法及應用。它是用致病性大腸桿菌攻毒斷奶仔豬來探討該病原菌對仔豬血液中白細胞數量和血清中腫瘤壞死因子?α（TNF?α）濃度的影響。致病性大腸桿菌菌液濃度為1×1010~1×1011cfu結果表明：試驗組顯著提高仔豬血液中白細胞數量和血清中TNF?α的濃度。由此可見，適當劑量的致病性大腸桿菌攻毒斷奶仔豬能夠誘導仔豬發生炎癥反應。
【專利說明】
-種建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于畜牧業動物醫學技術研究領域，設及一種W致病性大腸桿菌為病原菌 的斷奶仔豬炎癥模型，更具體的說是用于研究藥物的抗炎作用、評價抗炎藥物的作用效果 和研究抗炎藥物的作用機制等方面的應用。
【背景技術】
[0002] 炎癥是臨床常見的一個病理過程，是機體血管系統的活體組織對損傷因子所產生 的一種重要防御機制，也是機體最基本的抗損傷過程。適度的炎癥反應可W促進傷口愈合、 便于捕獲微生物，對于病理性感染的控制非常重要，但是過度的炎癥反應能夠引起廣泛的 組織損傷，加劇感染性休克，甚至危及生命，因此抗炎藥應運而生。萬物是具有兩面性的，抗 炎藥物也不例外。抗炎藥只有使用得當它的功效才能發揮出來，否則就會適得其反。所W， 如何選擇合適的動物模型來研究藥物的抗炎作用、初步評價抗炎藥的作用效果和研究抗炎 藥物的作用機制是我們待研究的重要課題之一。
[0003] 目前，建立的體內炎癥模型較多，主要集中在大鼠、小鼠和雞等小型動物上，而在 大型動物，比如斷奶仔豬上建立體內炎癥模型的案例還未見報道。
[0004] 斷奶仔豬營養健康一直是養豬領域的研究重點，仔豬抗炎藥物添加劑的篩選、作 用機制及其合理使用是目前很多研究人員的主攻方向。通過致病性大腸桿菌灌服斷奶仔豬 建立仔豬炎癥反應模型，將為抗炎藥物作為飼料添加劑在仔豬上的開發及應用研究提供實 驗室技術支持，也會在一定程度上提高養豬業的經濟效益。

【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是公開了一種斷奶仔豬炎癥反應模型的建立方法。
[0006] 本發明的另一個目的是公開了所建立的炎癥模型對斷奶仔豬血液中白細胞數目 和促炎性細胞因子生成的影響。
[0007] 為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容 一種建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其特征在于在病原菌使用中選擇致病性大腸 桿菌，對仔豬進行灌服，按如下的步驟進行： (1) 致病性大腸桿菌攻毒用菌液的制備： 將致病性大腸桿菌甘油菌液按照0 . l%(w/w)的接種量轉接入小量新鮮LB培養液中，培 養18小時后，再按照0. l%(w/w)的接種量接種入大量新鮮LB培養液中，37°C，150 rpm，培養 18小時后，4°C，30(K)rpm離屯、集菌，離屯、時間W大腸桿菌沉下來為準，棄去培養液，用無菌生 理鹽水洗涂1次，4°C，30(K)rpm離屯、集菌，棄去洗涂液，加入適量的巧~10 mL)生理鹽水，4°C 保存，待攻毒用;將待攻毒用的大腸桿菌，用生理鹽水倍比稀釋后，在LB瓊脂板中進行CRJ計 數，確定攻毒用大腸桿菌的濃度； (2) 試驗動物及分組： 采用單因子試驗設計，選取健康去勢杜X長X大Ξ元雜交斷奶仔豬6頭，隨機分為2組， 每組3頭豬，試驗組每公斤體重灌服致病性大腸桿菌，菌液濃度為1 X l〇w~1 X IQiicfu，對照 組每公斤體重灌服等體積的生理鹽水； (3) 試驗規程： 1) 試驗在一個100 m2的動物房里進行，每頭豬單籠飼養，試驗期5天，飼養管理按照仔 豬常規程序進行，仔豬自由采食飲水4天，攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水，攻毒 前對每頭豬進行前腔靜脈采血，攻毒時對每頭豬稱重，根據體重計算攻毒劑量，試驗組仔豬 灌服致病性大腸桿菌，對照組仔豬灌服生理鹽水； 2) 攻毒后2 h開始供水，仍繼續停止供料直至實驗結束;攻毒后3、6、12和24 h分別對每 頭豬進行前腔靜脈采血； (4) 測定指標： 1) 血液中白細胞數目測定：用含有乙二胺四乙酸二鐘的抗凝血真空管采集前腔靜脈血 1 mL，顛倒4~5次充分混勻，進行血常規檢測； 2) 血清中促炎性細胞因子測定:采用5 滅菌注射器前腔靜脈采血1 mL，室溫放置2 h 后，常規方法分離血清，測定血清中的細胞因子。
[0008] 本發明所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其中所述的建立斷奶仔豬炎癥反 應指的是:斷奶仔豬血液中白細胞數目和促炎性細胞因子生成的影響。
[0009] 本發明所述的仔豬特征為：健康去勢公豬，體重在6~8kg。所述的致病性大腸桿菌 使用濃度優選是仔豬每公斤體重灌服1 X lo^c化/mL。
[0010] 本發明所使用的致病性大腸桿菌特征為:購自中國獸醫藥品監察所，菌種保藏編 號為 CVCC3732。
[0011] 本發明進一步公開了建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法在研究制備致病性大腸 桿菌誘導斷奶仔豬炎癥反應上的應用。主要指的是:提高斷奶仔豬血液中白細胞數量和血 清中TNF-a濃度方面的應用。致病性大腸桿菌攻毒仔豬實驗結果表明： (1)仔豬灌服致病性大腸桿菌后，血液中白細胞數目顯著增加，表明該致病性大腸桿菌 能夠促使白細胞滲出到血管外，呈現出細菌感染所致炎癥反應最重要的特征。
[0012] (2)仔豬灌服致病性大腸桿菌后，血清中TNF-a濃度顯著增加，表明致病性大腸桿 菌能夠激活免疫細胞使其產生炎癥介質，比如TNF-a等，介導機體炎癥反應。試驗結果表明 建立的斷奶仔豬炎癥反應模型是成功的。
[0013] 為了更進一步說明本發明的模型效果，提供更加詳細的試驗： 1.致病性大腸桿菌攻毒用菌液的制備 將致病性大腸桿菌甘油菌液按照0.1%的接種量轉接入小量新鮮LB培養液中，培養18小 時后，再按照0.1%的接種量接種入大量新鮮LB培養液中，37°C，150巧m，培養18小時后，4 °C，300化pm離屯、集菌，離屯、時間W大腸桿菌沉下來為準，棄去培養液，用無菌生理鹽水洗涂 1次，4°C，300化pm離屯、集菌，棄去洗涂液，加入適量的生理鹽水，4°C保存，待攻毒用。
[0014] 將待攻毒用的大腸桿菌，用生理鹽水倍比稀釋后，在LB瓊脂板中進行CFU計數，確 定攻毒用大腸桿菌的濃度。
[0015] 2.試驗動物及分組 采用單因子試驗設計，選取體重7.12 ± 0.48 kg的健康去勢杜X長X大Ξ元雜交斷 奶仔豬6頭，隨機分為2組，每組3頭豬。試驗組每公斤體重灌服致病性大腸桿菌IX lO^c化 (菌液濃度為IX lO^c化/mL)，對照組每公斤體重灌服等體積的生理鹽水。致病性大腸桿菌 購自中國獸醫藥品監察所，菌種保藏編號為CVCC3732。
[0016] 3.試驗規程 試驗在一個100 m2的動物房里進行，每頭豬單籠飼養，試驗期5天。飼養管理按照仔豬 常規程序進行。
[0017] 仔豬自由采食飲水4天。攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水。攻毒前對每頭 豬進行前腔靜脈采血。攻毒時對每頭豬稱重，根據體重計算攻毒劑量，試驗組仔豬灌服致病 性大腸桿菌，對照組仔豬灌服生理鹽水。
[0018] 攻毒后2 h開始供水，仍繼續停止供料直至實驗結束;攻毒后3、6、12和24 h分別對 每頭豬進行前腔靜脈采血。
[0019] 4.測定指標 血液中白細胞數目測定：用含有乙二胺四乙酸二鐘的抗凝血真空管采集前腔靜脈血1 mL，顛倒4~5次充分混勻，進行血常規檢測。儀器為日本Sysmex公司XE-2100全自動血液分析 儀;進口專用配套試劑、質控品和校準品。嚴格按照操作規程進行檢測。
[0020] 血清中促炎性細胞因子測定:采用5 mL滅菌注射器前腔靜脈采血1 mL，室溫放置2 h后，常規方法分離血清。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中的細胞因子，試劑盒購 自上海蠢樂生物公司。嚴格按照試劑盒操作說明書進行檢測。
[0021] 5.統計分析 采用Excel數據分析中的單因素方差分析比較組間差異顯著性，代0.05為差異顯著。
[0022] 本發明的使用方法:用致病性大腸桿菌灌服6~8 kg仔豬，灌服劑量為每公斤體重1 Xl〇ie~IXlQiicfu。
[0023] 本發明模型的評估:致病性大腸桿菌灌服仔豬后3~12 h血液中白細胞數量在18~ 28 X 1 〇9ce 11 s/mL，血清中 TNF-a的濃度在80~180 ng/L。
[0024] 本發明各項指標的檢測：按照常規方法檢測血液中白細胞數量和血清中TNF-a的 濃度。
[0025] 本發明公開的建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法在斷奶仔豬炎癥反應中的作用 效果，主要包括： 1.血液中白細胞數量 由表1可知，攻毒前試驗組和對照組血液中白細胞數量無差異(A0.05);致病性大腸桿 菌攻毒仔豬后3、6和12 h試驗組血液中白細胞數量顯著高于對照著(代0.05)，尤其是大腸 桿菌攻毒后6 h試驗組血液中白細胞數量比對照組增加了 1.04倍，大腸桿菌攻毒后24 h試 驗組和對照組血液中白細胞數量無差異(A0.05)。
[00%]表1對血液中白細胞數量的影響
2.血清中TNF-α的濃度 由表2可知，攻毒前試驗組和對照組血清中TNF-a的濃度無差異(A0.0 5);致病性大腸 桿菌攻毒仔豬后3、6、12和24 h血清中TNF-a的濃度顯著高于對照著(代〇.〇5)，尤其是大腸 桿菌攻毒后6 h和1化試驗組血清中TNF-a的濃度比對照組分別增加了2.92倍和1.68倍。 [0027] 表2對血清中TNF-a濃度的影響
試驗結果表明：致病性大腸桿菌攻毒仔豬后，顯著提高血液中白細胞數量和血清中 TNF-a的濃度，其中，血液中白細胞數量在大腸桿菌攻毒后6 h，試驗組比對照組增加了 1.04 倍，血清中TNF-a的濃度在大腸桿菌攻毒后化和12h，試驗組比對照組分別增加了 2.92倍和 1.68倍。表明建立的斷奶仔豬炎癥反應模型是成功的。
[002引【附圖說明】： 圖1仔豬攻毒后24 h病理變化； 對照組:小腸表面、腸系膜、腸系膜淋己結正常無病變； 試驗組:小腸水腫、顏色發紅、腸系膜充血明顯、腸系膜淋己結出血腫脹，可見明顯出血 點。
【具體實施方式】
[0029] 下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的 范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和范圍的前提下，對運些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發明的保護范圍。
[0030] 本發明的實施例中所述的LB培養液、LB瓊脂板、抗凝采血管、血常規試劑和細胞因 子檢測試劑盒均由市售，也可根據實驗室實際情況加 W調換。
[0031 ]本發明用到的LB培養液、LB瓊脂板具體的配方如下： LB培養液：1%蛋白腺，ο. 5%酵母膏，1%氯化鋼，pH=7. ο; LB瓊脂板：1%蛋白腺，0.5%酵母膏，1%氯化鋼，1.8%瓊脂粉，ρΗ=7.0。
[0032] 本發明所用到原料的來源統計：
實施例1 方法:仔豬選擇6.85 ± 0.37 kg的健康去勢斷奶仔豬，試驗期5天。致病性大腸桿菌使 用劑量是仔豬每公斤體重灌服2Xl〇Wcfu(菌液濃度為lXl〇Wcfu/mL)。攻毒前和攻毒后3、 6、12和24 h對仔豬進行前腔靜脈采血。
[0033] 步驟:采用全自動血液分析儀測定血液中白細胞數量;采用化ISA測定血清中TNF- α的濃度。
[0034] 結果：白細胞數量（109cells/mL):攻毒前和攻毒后3、6、12和24 h試驗組分別是： 14.2、19.3、30.3、22.32、15.4，攻毒前和攻毒后3、6、12和24 11對照組分別是：13.92、14.28、 14.12、13.87、14.01。
[0035] TNF-a濃度(ng/L):攻毒前和攻毒后3、6、12和24 h試驗組分別是：34.28、83.29、 182.21、125.32、100.98，攻毒前和攻毒后3、6、12和24 h對照組分別是：35.32、42.39、 44.01、46.43、41.28。
[0036] 結論:致病性大腸桿菌灌服仔豬后，能夠顯著增加血液中白細胞數量，提高血清中 TNF-a濃度。
[0037] 實施例2 方法:仔豬選擇7.25 ± 0.58 kg的健康去勢斷奶仔豬，試驗期5天。致病性大腸桿菌使 用劑量是仔豬每公斤體重灌服6 X lO^cfu(菌液濃度為6 X l〇Wcfu/mL)。攻毒前和攻毒后3、 6、12和24 h對仔豬進行前腔靜脈采血。
[003引步驟:采用全自動血液分析儀測定血液中白細胞數量;采用化ISA測定血清中TNF- α的濃度。
[0039] 結果：白細胞數量（109cells/mL):攻毒前和攻毒后3、6、12和24 h試驗組分別是： 12.84、17.98、26.68、20.02、14.08，攻毒前和攻毒后3、6、12和24 11對照組分別是：13.83、 14.42、14.02、13.95、13.80。
[0040] TNF-a濃度(ng/L):攻毒前和攻毒后3、6、12和24 h試驗組分別是:42.22、89.45、 207.86、121.20、108.28,攻毒前和攻毒后 3、6、12 和 24 h 對照組分別是：41.39、49.98、 48.30、46.39、46.89。
[0041] 結論:致病性大腸桿菌灌服仔豬后，能夠顯著增加血液中白細胞數量，提高血清中 TNF-a濃度。
【主權項】
1. 一種建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其特征在于在病原菌使用中選擇致病性大 腸桿菌，對仔豬進行灌服，按如下的步驟進行： (1) 致病性大腸桿菌攻毒用菌液的制備： 將致病性大腸桿菌甘油菌液按照O. l%(w/w)的接種量轉接入小量新鮮LB培養液中，培 養18小時后，再按照0. l%(w/w)的接種量接種入大量新鮮LB培養液中，37°C，150 rpm，培養 18小時后，4°C，3000rpm離心集菌，離心時間以大腸桿菌沉下來為準，棄去培養液，用無菌生 理鹽水洗滌1次，4°C，3000rpm離心集菌，棄去洗滌液，加入5~10 mL生理鹽水，4°C保存，待攻 毒用;將待攻毒用的大腸桿菌，用生理鹽水倍比稀釋后，在LB瓊脂板中進行CFU計數，確定攻 毒用大腸桿菌的濃度； (2) 試驗動物及分組： 采用單因子試驗設計，選取健康去勢杜X長X大三元雜交斷奶仔豬6頭，隨機分為2組， 每組3頭豬，試驗組每公斤體重灌服致病性大腸桿菌，菌液濃度為IX 101()~IX IO11Cfu,對 照組每公斤體重灌服等體積的生理鹽水； (3) 試驗規程： 1) 試驗在一個100 m2的動物房里進行，每頭豬單籠飼養，試驗期5天，飼養管理按照仔豬 常規程序進行，仔豬自由采食飲水4天，攻毒前12 h停止供料，攻毒前2 h停止供水，攻毒前 對每頭豬進行前腔靜脈采血，攻毒時對每頭豬稱重，根據體重計算攻毒劑量，試驗組仔豬灌 服致病性大腸桿菌，對照組仔豬灌服生理鹽水； 2) 攻毒后2 h開始供水，仍繼續停止供料直至實驗結束;攻毒后3、6、12和24 h分別對每 頭豬進行前腔靜脈采血； (4) 測定指標： 1) 血液中白細胞數目測定：用含有乙二胺四乙酸二鉀的抗凝血真空管采集前腔靜脈血 I mL，顛倒4~5次充分混勻，進行血常規檢測； 2) 血清中促炎性細胞因子測定:采用5 mL滅菌注射器前腔靜脈采血I mL，室溫放置2 h 后，常規方法分離血清，測定血清中的細胞因子。2. 權利要求1所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其中所述的仔豬特征為:健康去 勢公豬，體重在6~8kg。3. 權利要求1所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其中所述的致病性大腸桿菌使 用濃度是仔豬每公斤體重灌服IX 101()cfU/mL。4. 權利要求1所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其中所使用的致病性大腸桿菌 特征為:購自中國獸醫藥品監察所，菌種保藏編號為CVCC3732。5. 權利要求1所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法，其中所述的建立斷奶仔豬炎癥 反應指的是:斷奶仔豬血液中白細胞數目和促炎性細胞因子生成的影響。6. 權利要求1所述建立斷奶仔豬炎癥反應模型的方法在研究制備致病性大腸桿菌誘導 斷奶仔豬炎癥反應上的應用。7. 權利要求1所述的應用，其中所述的建立斷奶仔豬炎癥反應指的是:提高斷奶仔豬血 液中白細胞數量和血清中TNF-α濃度方面的應用。8. 權利要求1所述的應用，所述的應用指的是:在研究藥物的抗炎作用、評價抗炎藥物 的作用效果和機制方面上的應用。
【文檔編號】A61K49/00GK105920619SQ201610354931
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】李海花, 朱琪, 王世瓊, 張全紅, 陳龍賓, 喬家運, 王文杰
【申請人】天津市畜牧獸醫研究所