一種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種以凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌的混合微生物發酵，來生產飼用微生態制劑替代抗生素物的生產方法。屬于微生物發酵技術領域。方法包括(1)凝結芽孢桿菌的種子液培養；(2)凝結芽孢桿菌的有氧固體發酵；(3)植物乳桿菌的種子液培養；(4)凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵等步驟、工藝。本發明利用在生產凝結芽孢桿菌的同時生產植物乳桿菌，而且采用不滅菌的生料混合發酵方法，顯著降低了產品的生產成本，可推動該產品在畜禽、水產等飼料中的應用。
【專利說明】
一種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其涉及以凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌的一種 混合微生物發酵，來生產飼用微生態制劑替代抗生素物的生產方法。 技術背景
[0002] 抗生素在畜禽上的廣泛使用，使養殖場能夠限制牲畜的飼養空間和活動，同時保 持動物處于最佳健康狀態，抗生素的應用促進了畜牧業的發展，讓更多人以低廉的價格購 買更多的肉制品。就畜禽養殖業而言，長期或超標濫用抗生素，尤其是把抗生素作為飼料添 加劑所帶來的危害也日益凸顯。歐盟、日本和韓國分別于2006年和2008年禁止在飼料中使 用抗生素，美國已計劃在2017年禁止飼料中使用抗生素。我國雖沒有明確提出禁止使用抗 生素的時間表，但已開展了大量飼用抗生素替代品的研究與生產示范，近年來在抗生素替 代品中飼用微生物制劑顯示出良好的發展勢頭顯示出良好的發展勢頭。
[0003] 凝結芽孢桿菌是一種能產乳酸又能形成芽孢的益生菌，在有氧和厭氧的條件下均 能生長。具有抗逆性強、耐高溫高熱、易貯藏等特性，能順利通過胃酸和消化酶的雙重作用 進入腸道定殖。并在腸道迅速萌發生長成為營養體活菌并代謝產生乳酸，從而改善其腸道 菌群平衡，能顯著降低動物腸道中有害微生物的數量和腹瀉率，能提高日增重、飼料轉化 率，因此，凝結芽孢桿菌在飼料工業中具有廣泛的應用前景。
[0004]植物乳桿菌這一類的乳酸菌已證實具有改善動物腸道健康和提高免疫力的作用， 其產的乳酸和乳酸菌素可以直接作用于病源細菌。被認為是理想的促生長替代抗生素的有 益微生物，具有廣闊的發展應用前景。
[0005]由于植物乳桿菌的營養條件要求苛刻，目前主要是以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡 萄糖等物質為培養基，再添加一些生長刺激物。這些用來做培養基的物質其市場售價較麩 皮、豆柏、玉米粉等普通農副產品貴出許多倍，用這些物質來生產植物乳桿菌，其成本對養 殖行業作為飼料添加劑來說較高，在一定程度上阻礙了植物乳桿菌的生產與在養殖行業的 推廣、應用。
【發明內容】
[0006] 本發明目的在于，提供一種以價格低廉、材料易得的農副產品為原料，輔以合理的 發酵工藝，在生產凝結芽孢桿菌的同時，以較低成本混合生產植物乳桿菌的方法。本發明目 的通過以下技術方案來實現。
[0007] -種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法，該方法按以下步驟進行：
[0008] (1)凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans菌株編號ACCC00403)(本發明所涉及的凝 結芽孢桿菌(BaciIlus coagulans)的菌株編號為00403,從中國農業微生物菌種保藏管理 中心(ACCC)引進)液體種子培養:將凝結芽孢桿菌斜面菌種接入三角瓶培養基中，500ml三 角瓶培養基裝量為100mL，經35~38°C，180~200rpm搖床培養14~18h后成為三角瓶液體種 子，備用;所述三角瓶的種子培養基為(g/L):乳糖1，蛋白胨1，牛肉浸膏0.5,氯化鈉0.5,調 pH為7.0~7.5，121°C 滅菌 15min;
[0009] (2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養：固體發酵培養基為豆柏，加豆柏重量0.6倍 的水配制而成，將步驟（1)每瓶三角瓶液體種子按每瓶種子：以固形物重量計的20~30公斤 豆柏的比例接種，無需滅菌，裝入曲盤至發酵物料厚度為5~7cm后，于35~38 °C室溫條件下 發酵培養20~24h，備用；
[0010] (3)植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum菌株編號ACCCl 1016)(本發明所涉及 的植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)的菌株編號為11016,從中國農業微生物菌種保 藏管理中心(ACCC)引進)的種子液培養:在500ml三角瓶中裝入300ml液體MRS培養基，接入 植物乳桿菌菌種，經35~38°C培養12~14h后，于0~4°C保存，備用；所述MRS培養基為（g/ L):葡萄糖2,蛋白胨1，牛肉浸膏1，酵母浸膏0.5,磷酸氫二鉀0.2,檸檬酸二銨0.2,乙酸鈉 0 · 5，吐溫0 · 1，硫酸鎂 0 · 058，硫酸錳 0 · 025，調pH為5 · 8 ~6 · 2，121°C滅菌 15min;
[0011] (4)凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵:混合固體發酵培養基為:脫脂米糠 :步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養物(按發酵前豆柏重量計）：碳酸鈣按重量份70~ 90:10~30:4~10比例配制而成，并按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的0.5~0.7倍加入 自來水，無需滅菌，將步驟(3)的植物乳桿菌種子液，按該混合發酵培養基中脫脂米糠的重 量的1%~3%接種，拌勻，直接轉入塑料袋中，扎緊塑料袋，盡量趕走袋中的空氣，繼續在35 ~38°C培養條件下培養30~36h后停止發酵;在不高于50°C條件下將發酵物烘干、粉碎成40 目后，檢驗、包裝成產品。
[0012] 另一方面，本發明提供一種通過權利要求1所述方法生產的復合微生態制劑在制 備斷奶仔豬飼料中來替代抗生素的用途。優選的，其中，所述的飼料由以下成分組成:玉米 60.8 %、豆柏15.0 %、膨化大豆10.0 %、魚粉5.0 %、乳清粉6.0 %、磷酸氫鈣1.2 %、石粉 0.6 %、鹽0.3 %、賴氨酸0.1 %、預混料1.0 %，0.4的如權利要求1所述方法生產的復合微生 態制劑。
[0013] -方面，本發明提供一種斷奶仔豬用復合飼料，其中，該飼料由如下成分組成：玉 米60.8%、豆柏15.0%、膨化大豆10.0%、魚粉5.0%、乳清粉6.0%、磷酸氫鈣1.2%、石粉 0.6 %、鹽0.3 %、賴氨酸0.1 %、預混料1.0 %，0.4 %的如權利要求1所述方法生產的復合微 生態制劑。
[0014] 本發明的有益效果
[0015] 1、本發明工藝先將凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌分別制備成種子后，再將它們按一 定比例混合接種，進行混合固體發酵。當凝結芽孢桿菌進行發酵時，能產生一定量淀粉酶和 蛋白酶，能將豆柏中的蛋白和脫脂米糠中的淀粉進行分解，生成氨基酸和單糖等小分子物 質，這樣植物乳桿菌就能利用的蛋白質和淀粉分解而成的氨基酸和單糖等小分子物質，為 植物乳桿菌的高效生長繁殖能連續不斷地提供所需營養物質；其次，凝結芽孢桿菌在生長 和形成芽孢的同時產生蛋白酶、淀粉酶等生物活性物質，這些物質能與凝結芽孢桿菌芽孢、 植物乳桿菌及其代謝產物同時作為添加劑加入飼料后，就更能促進畜禽的健康和加強腸道 對營養物質的消化吸收，從而也提高了本發明混合發酵產品的應用優勢。
[0016] 2、本發明以豆柏、脫脂米糠等易得、廉價農副產品替代了以往如牛肉膏、蛋白胨、 酵母膏、葡萄糖等的發酵原料，在生產凝結芽孢桿菌的同時生產植物乳桿菌，而且采用不滅 菌的生料混合發酵方法，顯著降低了產品的生產成本，可推動該產品在畜禽、水產等飼料中 的應用。
【具體實施方式】
[0017] 通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但其
【發明內容】
并不受這些內容所 限止。
[0018] 本發明所涉及的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)的菌株編號為00403,植物 乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)菌株編號為11016均從中國農業微生物菌種保藏管理 中心(ACCC)引進。
[0019] 實施例1:(一種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法1)
[0020] 本發明具體工藝如下：
[0021] (1)凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans菌株編號ACCC00403)的種子液培養:將凝 結芽孢桿菌斜面菌種接入三角瓶培養基中，500ml三角瓶培養基裝量為100mL，經35~38°C， 180~200rpm搖床培養14~18h后成為三角瓶液體種子，備用；所述三角瓶的種子培養基為 &凡）：乳糖1，蛋白胨1，牛肉浸膏0.5，氯化鈉0.5，調?!1為7.0~7.5，121°(：滅菌151^11;
[0022] (2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養：固體發酵培養基為豆柏，加豆柏重量0.6倍 的水配制而成，將步驟（1)每瓶三角瓶液體種子按每瓶種子：以固形物重量計的20公斤豆柏 的比例接種，無需滅菌，裝入曲盤至發酵物料厚度為5~7cm后，于35~38°C室溫條件下發酵 培養20~24h，備用；
[0023] (3)植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum菌株編號ACCCl 1016)(本發明所涉及 的植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)的菌株編號為11016,從中國農業微生物菌種保 藏管理中心(ACCC)引進)的種子液培養:在500ml三角瓶中裝入300ml液體MRS培養基，接入 植物乳桿菌菌種，經35~38°C培養12~14h后，于0~4°C保存，備用；所述MRS培養基為（g/ L):葡萄糖2,蛋白胨1，牛肉浸膏1，酵母浸膏0.5,磷酸氫二鉀0.2,檸檬酸二銨0.2,乙酸鈉 0 · 5，吐溫0 · 1，硫酸鎂 0 · 058，硫酸錳 0 · 025，調pH為5 · 8 ~6 · 2，121°C滅菌 15min;
[0024] (4)凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵:混合固體發酵培養基為:脫脂米糠 :步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養物(按發酵前豆柏重量計）：碳酸鈣按重量份90: 10:10比例配制而成，并按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的0.5倍加入自來水，無需滅菌， 將步驟(3)的植物乳桿菌種子液，按該混合發酵培養基中脫脂米糠的重量的1%接種，拌勻， 直接轉入塑料袋中，扎緊塑料袋，盡量趕走袋中的空氣，繼續在35~38°C培養條件下培養30 ~36h后停止發酵;在不高于50°C條件下將發酵物烘干、粉碎成40目后，檢驗、包裝成產品。 [0025] 實施例2:(-種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法2)
[0026]本例中，步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養：固體發酵培養基為豆柏，加豆 柏重量0.6的水比例配制而成，將步驟（1)每瓶三角瓶液體種子按每瓶種子：以固形物重量 計的25公斤豆柏的比例接種，裝入曲盤至發酵物料厚度為5~7cm后，于35~38°C室溫條件 下發酵培養20~24h，備用；
[0027]步驟(4)凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵:混合固體發酵培養基為:脫脂 米糠:步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養物(按發酵前豆柏重量計）：碳酸鈣按重量份 80:20:7比例混合，并按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的0.6倍加入自來水，無需滅菌，將 步驟(3)的植物乳桿菌種子液按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的2%接種，拌勻，直接轉 入塑料袋中，扎緊塑料袋，盡量趕走袋中的空氣，繼續在35~38°C培養條件下培養30~36h 后停止發酵;在不高于50°C條件下將發酵物烘干、粉碎成40目后，檢驗、包裝成產品。
[0028]其余工藝、步驟同實施例1。
[0029] 實施例3:(-種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法3)
[0030]本例中，步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養：固體發酵培養基為豆柏，加豆 柏重量0.6的水比例配制而成，將步驟（1)每瓶三角瓶液體種子按每瓶種子：以固形物重量 計的30公斤豆柏的比例接種，裝入曲盤至發酵物料厚度為5~7cm后，于35~38°C室溫條件 下發酵培養20~24h，備用；
[0031]步驟(4)凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵:混合固體發酵培養基為:脫脂 米糠:步驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養物(按發酵前豆柏重量計）：碳酸鈣按重量份 70:30:4比例混合，并按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的0.7倍加入水，無需滅菌，將步驟 (3)的植物乳桿菌種子液按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的3%接種，拌勻，直接轉入塑 料袋中，扎緊塑料袋，盡量趕走袋中的空氣，繼續在35~38°C培養條件下培養30~36h后停 止發酵;在不高于50°C條件下將發酵物烘干、粉碎成40目后，檢驗、包裝成產品。
[0032]其余工藝、步驟同實施例1。
[0033] 實施例4(斷奶仔豬喂養效果對比試驗)
[0034]本例中采用的預混料：由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所生產并提供。選用35 日齡斷奶三元雜交仔豬120頭，分為三個處理組，每組40頭：
[0035]負對照組(不添加抗生素）、正對照組(抗生素組)和試驗組(不加抗生素，添加本發 明產品）。試驗期間自由采食，自由飲水。計算試驗起始平均體重、試驗結束平均體重、平均 日增重、平均日采食量、料肉比，每日觀察記錄腹瀉情況，計算腹瀉概率。
[0036] 負對照組日糧配方為：玉米60.8%、豆柏15.0%、膨化大豆10 · 0 %、魚粉（秘魯） 5.0 %、乳清粉6.0 %、磷酸氫鈣1.2 %、石粉0.6 %、鹽0.3 %、賴氨酸0.1 %、預混料(一些微量 元素、維生素，氨基酸，填充料載體混合物)1.0% (不加抗生素）。
[0037] 正對照組(抗生素組)為負對照組日糧基礎上添加抗生素(抗生素為黃霉素和金霉 素）（400克/1000公斤的負對照日糧配）（先和勻混料混合，然后在和其它組分混合）。
[0038] 試驗組(添加本發明產品）日糧配方為負對照組日糧配方基礎上添加0.4%實施例 1的發酵產品，分別于添加后30天統計測定仔豬生長性能。結果見表1。
[0039] 結果分析:本發明產品與不添加抗生素組相比，在增重和腹瀉率方面有顯著的改 善，與使用抗生素組相比，防治腹瀉率有所改善，在增重方面接近抗生素的水平。本發明產 品能替代抗生素在斷奶仔豬上應用。
[0040]表1:復合微生態制劑對斷奶仔豬生產性能的影響(實施例子1)。
[0042] 另外，按照以上方法，對試驗組（添加本發明產品）日糧配方為負對照組日糧配方 基礎上添加0.4%實施例2或3的發酵產品，分別于添加后30天統計測定仔豬生長性能，結果 也表明，實驗組的平均日增重(kg/d)為523.14± 134.91 (實施例2)和521.14± 134.91(實施 例3)，腹瀉分別為3.1和3.5%。
[0043] 同樣，當采用單獨本發明的凝結芽孢桿菌發酵或者植物乳桿菌（即在實施例子1中 把植物乳桿菌的量替換為凝結芽孢桿菌，或者把凝結芽孢桿菌的量替換為植物乳桿菌）的 發酵產物進行如實施例子4同樣的實驗，使用的配方一致，獲得的結果如下：當單獨采用凝 結芽孢桿菌發酵產物的時候，實驗組的平均日增重(kg/d)為510.14± 140.91，腹瀉分別為 6.2%;當單獨采用植物乳桿菌發酵產物的時候，實驗組的平均日增重(kg/d)為494.14土 134.91，腹瀉分別為5.1 %。從而說明凝結芽孢桿菌發酵和植物乳桿菌混合發酵的產物，不 僅可以想對提高平均日增重，而且降低腹瀉率，進一步說明他們有相互協同增效作用。從 而，二者最好一起配合使用，一起混合發酵可以發揮他們更好的替換抗生素的作用。
【主權項】
1. 一種斷奶仔豬用復合微生態制劑的生產方法，該方法按以下步驟進行： (1) 保藏號為ACCC No .00403菌株的凝結芽孢桿菌(BaciIlus coagulans)液體種子培 養:將凝結芽孢桿菌斜面菌種接入三角瓶培養基中，500ml三角瓶培養基裝量為100mL，經35 ~38°C，180~200rpm搖床培養14~18h后成為三角瓶液體種子，備用;所述三角瓶的種子培 養基為（g/L):乳糖1，蛋白胨1，牛肉浸膏0.5，氯化鈉0.5，調pH為7.0~7.5，121°C滅菌 15min； (2) 凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養：固體發酵培養基為豆柏，加豆柏重量0.6倍的水 配制而成，將步驟（1)每瓶三角瓶液體種子按每瓶種子：以固形物重量計的20~30公斤豆柏 的比例接種，無需滅菌，裝入曲盤至發酵物料厚度為5~7cm后，于35~38°C室溫條件下發酵 培養20~24h，備用； (3) 保藏號為ACCC No · 11016菌株的植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)的種子液 培養:在500ml三角瓶中裝入300ml液體MRS培養基，接入植物乳桿菌菌種，經35~38°C培養 12~Hh后，于0~4°C保存，備用;所述MRS培養基為(g/L):葡萄糖2,蛋白胨1，牛肉浸膏1，酵 母浸膏〇 . 5，磷酸氫二鉀0.2，檸檬酸二銨0.2，乙酸鈉0.5，吐溫0.1，硫酸鎂0.058，硫酸錳 0.025,調 pH為5.8 ~6.2，121°C 滅菌 15min; (4) 凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌混合固體發酵:混合固體發酵培養基為:脫脂米糠:步 驟(2)凝結芽孢桿菌有氧固體發酵培養物(按發酵前豆柏重量計）：碳酸鈣按重量份70~90: 10~30:4~10比例配制而成，并按該發酵培養基中脫脂米糠的重量的0.5~0.7倍加入自 來水，無需滅菌，將步驟(3)的植物乳桿菌種子液，按該混合發酵培養基中脫脂米糠的重量 的1%~3%接種，拌勻，直接轉入塑料袋中，扎緊塑料袋，盡量趕走袋中的空氣，繼續在35~ 38°C培養條件下培養30~36h后停止發酵;在不高于50°C條件下將發酵物烘干、粉碎成40目 后，檢驗、包裝成產品。2. -種通過權利要求1所述方法生產的復合微生態制劑在制備斷奶仔豬飼料中來替代 抗生素的用途。3. 根據權利要求2所述的用途，其中，所述的飼料由以下成分組成：玉米60.8%、豆柏 15.0%、膨化大豆10.0%、魚粉5.0%、乳清粉6.0%、磷酸氫鈣1.2%、石粉0.6%、鹽0.3%、 賴氨酸〇. 1 %、預混料1.〇%，〇.4的如權利要求1所述方法生產的復合微生態制劑。4. 一種斷奶仔豬用復合飼料，其中，該飼料由如下成分組成：玉米60.8%、豆柏15.0%、 膨化大豆10.0%、魚粉5.0 %、乳清粉6.0%、磷酸氫鈣1.2 %、石粉0.6 %、鹽0.3 %、賴氨酸 0.1 %、預混料1.0%，〇.4%的如權利要求1所述方法生產的復合微生態制劑。
【文檔編號】A23K20/20GK105941899SQ201610269612
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】李孝輝, 劉偉, 皮雄娥, 王欣
【申請人】浙江省農業科學院