Tm4sf1結合蛋白及其使用方法

Tm4sf1結合蛋白及其使用方法
【專利摘要】本發明涉及在包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的表位特異性結合多肽的化合物(如TM4SF1結合蛋白，例如抗TM4SF1抗體)。特別是，本發明的化合物在結合包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的表位之后能夠被內化入TM4SF1表達細胞(例如，腫瘤細胞或生成血管的脈管內皮細胞)。本發明還提供用本發明的化合物治療患有與病理性血管生成相關的病癥的受試者的方法。
【專利說明】TM4SF1結合蛋白及其使用方法
[0001] 關于聯邦政府資助研究的聲明
[0002] 本發明是在美國國立衛生研究院(NIH)授予的批準號P01CA92644下部分由政府支 持進行的。政府對本發明享有一定的權利。
[0003] 發明背景
[0004] 血管生成是其中血管內皮細胞化C)增殖、減少(prune)和重組W從先前存在的血 管網絡形成新血管的重要的細胞事件。有令人信服的證據表明血管供給的發展對于正常和 病理性增生過程是必不可少的。氧氣和營養物的輸送W及分解代謝產物的去除，代表了發 生在多細胞生物體內的大多數生長過程中的限速步驟。因此，已普遍認為血管隔室不但對 于胚胎生成期間器官的發育和分化是必要的，而且對于成人傷口的愈合和再生功能也是必 要的。
[0005] 血管生成還牽設多種病癥的發病機制，包括但不限于:癌癥、肥胖癥、增殖性視網 膜病、年齡相關性黃斑變性、腫瘤、紅斑瘦瘡、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎(RA)、細胞免 疫和牛皮癖。血管生成是由蛋白酶釋放后局部位置(local venue)的胞外基質的降解、毛細 血管內皮細胞的增殖和毛細血管向血管生成刺激物的遷移組成的級聯過程。鑒于血管生成 的顯著的生理和病理重要性，許多工作一直被致力于闡明能夠調節該過程的因素。
[0006] 于1986年發現了為"L6抗原"或"腫瘤細胞抗原"的跨膜-化6家族成員-UTM4SF1) 化ellstrom等Cancer Res. 46:3917-3923，1986)，因為它在許多癌細胞上大量表達。出乎意 料的是，還發現它在供應正常組織的血管的血管內皮細胞上有少量表達(De化rdo等Int J Rad Appl Instrum B.18:621-631,1991;Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000; Richman等Cancer Res .5916s-5920s,1995;O'Donne11等Prostate .37:91-97,1998)。 TM4SF1被內襯于供應幾種人類癌癥的血管的EC(SMh等Cancer Res . 69:3272-3277，2009; Zukauskas等Angiogenesis . 14 : :345-354,2011)、被發育視網膜脈管的EC化ngl ish等J Biomed Inform.42:287-295，2009)W及被由表達VEGF-A的腺病毒在小鼠中誘導的新生血 管的EC(Shih等Cancer Res.69:3272-3277，2009)高度表達，但是并不被許多其它類型的細 胞高度表達（Shih等(Mincer Res.69:3272-3277,2009;Zukauskas等Angiogenesis. 14:345- 354,2011)。
[0007] 盡管結果表明TM4SF1有潛力作為用于治療與病理性血管生成相關的病癥如癌癥 的血管祀標，但是對于祀向TM4SF1 (例如，TM4SF1特異性結合多膚，如抗TM4SF1抗體，如抗人 TM4SF1抗體)并用于商業和治療目的規模化的化合物仍存在未滿足的需要。
[000引發明概述
[0009] 本發明部分基于特異性結合TM4SF1 (例如，在TM4SF1的ECL2結構域上的特定表位） 的化合物(例如抗體)的鑒定，該化合物具有表明它們特別有利于治療(例如，與病理性血管 生成相關的病癥如癌癥的治療)的性質。
[0010] 在第一方面，本發明的特征在于一種化合物，其包含與多膚的表位特異性結合的 結合結構域，其中所述表位包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTW沈CTEPKHIVEWNVS(沈Q ID NO: 1)。在一些實施方案中，多膚是跨膜-4L6家族成員-UTM4SF1)。在一些實施方案中， TM4SF1是人TM4SF1。在一些實施方案中，人TM4SF1是糖基化(例如N-糖基化）的人TM4SF1。在 一些實施方案中，糖基化的人TM4SF1在殘基N129或殘基N159處糖基化。在一些實施方案中， 糖基化的人TM4SF1在殘基N129和殘基N159處糖基化。在一些實施方案中，化合物能夠W lOnM 或更小（例如 10nM、5nM、2nM、lnM、500pM、100pM、50pM、lpM或500fM或更小）的Kd值特異 性結合糖基化的人TM4SF1。在一些實施方案中，化合物的結合結構域包括選自W下的至少 一個氨基酸序列（例如1、2、3、4、5或6個氨基酸序列）：GFTFSSFAMS(SEQ ID N0:2)、 TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)、RGIYYGYDGYAMDY(沈Q ID N0:4)、RSSQSLVHSNGNTTLH (沈Q ID N0:5)、KVSNRFS(沈Q ID N0:6)和SQSTHVYT(沈Q ID N0:7)。在一些實施方案中，結 合結構域包括選自W下的至少一個、至少兩個或所有Ξ個氨基酸序列:GFTFSSFAMS(SEQ ID N0:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)和RGIYYGYDGYAMDY(沈Q ID N0:4)。在一些實施 方案中，化合物包括包含選自W下的至少一個、至少兩個或所有Ξ個氨基酸序列的結合結 構域:RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID N0:5)，KVSNRFS(沈Q ID Ν0:6)，和SQSTHVYT(序列ID NO: 7)。在一些實施方案中，化合物包括含有W下六個氨基酸序列的結合結構域:GFTFSSFAMS (SEQ ID N0:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)、RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID N0:4)、 RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID N0:5)、KVSNRFS(沈Q ID N0:6)和SQSTHVYT(沈Q ID N0:7)。
[0011] 在一些實施方案中，該化合物是抗體。在一些實施方案中，該抗體由雜交瘤小鼠細 胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523 )產生。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括與 EVILVESGG化VKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQT陽KRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTIS畑NAKN TVHLQMSSLR沈DTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(沈Q ID N0:8)具有至少60%、65%、 70%、75%或80%的序列同一性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的同一性）的氨基酸序 列。在一些實施方案中，抗體的輕鏈包括與AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWY MQKPGQSPK化IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID肋：9)具有至少60%、65%、70%、75%或80%的序列同一性（例如81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%的同一性）的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體的重鏈包括與 EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASG巧FSSFAMSWVRQTP邸RLEWVATIS SG SIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKNTVHLQMS SLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID肋：8)具有至少60%、65%、70%、75%或80%的序列同一性（例如81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%的同一性)的氨基酸序列，W及抗體的輕鏈包括與AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQ化V服NGNTYLHWYMQKPGQSPK化IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA孤LGIYFCSQSTHIPL AFGAGTKL化K(SEQ ID N0:9)具有至少60%、65%、70%、75%或80% 的序列同一性（例如、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%的同一性)的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體是單克隆 的、人源化的、嵌合的或合成的。在一些實施方案中，抗體是抗體片段。在一些實施方案中， 化合物(例如抗體)是裸露的(naked)、未偶聯的和/或未修飾的。
[0012] 在一些實施方案中，化合物還包含試劑。在一些實施方案中，試劑是治療劑或診斷 劑。在一些實施方案中，治療劑是生物活性部分。在一些實施方案中，生物活性部分選自：細 胞毒素劑、化療劑、蛋白質、膚、抗體、生長抑制劑和抗激素劑。在一些實施方案中，細胞毒素 劑選自：核糖體失活蛋白，組蛋白脫乙酷酶化DAC)抑制劑，微管蛋白抑制劑，燒化劑，抗生 素，抗腫瘤劑，抗增殖劑，抗代謝物，I或II型拓撲異構酶抑制劑，激素激動劑或括抗劑，免疫 調節劑，DNA小溝結合劑，和放射性試劑。在某些實施方案中，核糖體失活蛋白是皂草素。在 一些實施方案中，診斷劑是標記物。在一些實施方案中，標記物是巧光標記物、生色標記物 或放射性標記物。在一些實施方案中，試劑直接偶聯至化合物。在其它實施方案中，試劑任 選地通過接頭間接地偶聯至化合物。
[0013] 在第二方面，本發明的特征在于包括第一方面的化合物的藥物組合物。在一些實 施方案中，藥物組合物還包括藥學上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。在一些實施方案 中，藥物組合物被配制為用于治療受試者中與病理性血管生成相關的病癥。
[0014] 在第Ξ方面，本發明的特征在于編碼第一方面的一種或多種多膚的多核巧酸。第 Ξ方面的一種或多種多核巧酸可W任選地包括在載體(例如，重組表達載體)中。
[0015] 在第四方面，本發明的特征在于包括第Ξ方面的一種或多種多核巧酸和/或載體 的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞（例如HUVEC、CH0、化La、3T3、 B皿、C0S、293和化rkat細胞）。在其它實施方案中，宿主細胞是原核細胞（例如，大腸桿菌 化.coli)細胞）。
[0016] 在第五方面，本發明的特征在于生產第一方面的化合物的方法，其包括在培養基 中培養第四方面的宿主細胞。在一些實施方案中，該方法還包括從宿主細胞或培養基回收 多膚。在一些實施方案中，在體外或離體進行該方法。
[0017] 在第六方面，本發明的特征在于治療患有與病理性血管生成相關的病癥(例如癌 癥)的受試者的方法，其包括向受試者施用治療有效量的第二方面的組合物，從而治療受試 者。在一些實施方案中，W約O.Olmg/kg/4天至約lOmg/kg/4天的劑量向受試者施用組合物。 在一些實施方案中，W約0. lmg/kg/4天至約lOmg/kg/4天的劑量向受試者施用組合物。在一 些實施方案中，W每周約3mg/kg/至約lOmg/kg的劑量向受試者施用組合物。
[0018] 在第六方面的任何實施方案中，與病理性血管生成相關的病癥可W是癌癥。在一 些實施方案中，癌癥選自：乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、胃癌（gastric cancer)、胃癌（stomach cancer)、皮膚癌、食道癌、腎癌、腦癌、甲狀腺癌、前列腺癌、膜腺癌 和肺癌、睪丸癌、小腸癌、唾液腺癌和腎上腺癌。在其它實施方案中，與病理性血管生成相關 的病癥為肥胖癥、黃斑變性、糖尿病性視網膜病、牛皮癖、類風濕性關節炎、細胞免疫、動脈 粥樣硬化或紅斑瘦瘡。
[0019] 在第六方面的任何實施方案中，該化合物在結合包含氨基酸序列 NYTFASTEGQY1XDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(沈Q ID NO: 1)的表位之后能夠被內化至TM4SF1 表 達細胞內。在一些實施方案中，化合物被內化至TM4SF1表達細胞的細胞質中。在一些實施方 案中，化合物被內化至TM4SF1表達細胞的細胞核中。在一些實施方案中，TM4SF1表達細胞是 腫瘤血管EC或腫瘤細胞。
[0020] 在一些實施方案中，第二方面的組合物通過肌肉內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、 腹膜內、病灶內、煩內、關節內、前列腺內、胸腔內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、 局部、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊內、粘膜、屯、包內、廝帶內、眼內、口服、局部、局部、通過吸 入、通過注射、通過輸注、通過連續輸注、通過直接局部灌注浸浴祀細胞、通過導管、通過灌 洗、在霜劑或脂質組合物中施用。在一些實施方案中，組合物可w通過局部藥物遞送施用。 在一些實施方案中，局部藥物遞送系統導致組合物的緩慢釋放。在一些實施方案中，向受試 者施用至少一種劑量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種劑量）的組合物或向受試者每 天、每周、每月或每年施用至少一種劑量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種劑量）。給藥 期間可W被定義(例如，1-4周、1-12個月、1-20年)或者可W是受試者的壽命期。在其它實施 方案中，向受試者施用至少兩種劑量(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種劑量)的組合物。 在其它實施方案中，向受試者施用組合物每周一次至屯次。當治療與病理性血管生成相關 的病癥(例如癌癥)時，在與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥)的癥狀發生或明確診斷 之前或診斷或癥狀變得明顯后可將本發明的第二方面的組合物施用至受試者。該組合物可 W在例如診斷或臨床確認癥狀后立即施用或癥狀診斷或檢測后的2小時、4小時、6小時、10 小時、15小時或24小時、2天、3天、5天或7天、2周、4周、6周或8周、或甚至3個月、4個月、6個月 后施用。
[0021 ]在第屯方面，本發明的特征在于檢測生物樣品中包含氨基酸序列 NYTFASTEGQY1XDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO: 1)的多膚的方法，該方法包括W下步 驟：（a)提供生物樣品和對照樣品；（b)將生物樣品和對照樣品與第一方面的化合物或第二 方面的藥物組合物接觸;和(C)確定生物樣品中和對照樣品中存在的化合物與多膚的絡合 物的量。在一些實施方案中，從疑似患有與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥）的受試 者獲得生物樣品。
[0022] 在最后一個方面，本發明的特征在于一種試劑盒，其包括：（a)本發明的第二方面 的藥物組合物;和(b)用于將藥物組合物施用至受試者W治療與病理性血管生成相關的病 癥(例如癌癥)的說明書。
[0023] 在本發明的所有方面的優選的實施方案中，受試者是哺乳動物，優選人。
[0024] 附圖簡要說明
[0025] 圖1A是TM4SF1的示意圖，示出被四個跨膜結構域(M1、M2、M3和M4)分隔的兩個胞外 環化化1和E化2)、N端和C端W及胞內環（I化）dE化2包含兩個N-糖基化位點，其表示為V'。
[0026] 圖1B是TM4SF1蛋白結構域和每個結構域中氨基酸數目的表。
[0027] 圖2A是描繪使用8G4抗體用免疫細胞化學進行的初始篩選的一系列圖像，其中鑒 另IJ出針對冊VEC((a)左圖）和皿F(人真皮成纖維細胞）（（b)，右圖）呈陽性的15個克隆，中間 的圖為HDF對照），其已被轉導W過表達人TM4SF1 (TM4SF1-0E)，但W非常低水平(約5mRNA拷 貝/細胞)表達TM4SF1的天然皿F不染色。
[0028] 圖2B是表位作圖實驗中所用的TM4SF1野生型、突變體和小鼠-人TM4SF1嵌合構建 體的圖表。通過免疫細胞化學對被轉導入不W可檢測水平表達TM4SF1的皿Μη(人類表皮黑 素細胞，新生兒)細胞的各種TM4SF1構建體進行表位作圖。從人類蛋白質參考數據庫獲得結 構域信息。FL(全長)TM4SF1蛋白；Ε化1，表達胞外環1的突變體;Ε化2,表達胞外環2的突變 體;N129/159G，兩個用于在氨基酸位置129和159N-糖基化的天冬酷胺突變為甘氨酸。在 N129/159G的情況下，制備兩個單獨的PCR片段，用Drain限制性內切酶切割，然后用T4DNA 連接酶連接。該鼠-人嵌合體(MU-HU-TM4SF1)含有從氨基酸117處開始的人TM4SF1序列，并 通過集成的DNA技術(CoravilleJA)化學合成。每種構建體W每個細胞約500個mRNA拷貝表 達。
[0029] 圖2C是示出8G4抗體W糖基化依賴性的方式特異性結合于ECL2上的表位的一系列 圖像。肥Μη用W下轉導：（i)空載體對照、（ii)化-TM4SFl、（iii化化l、（iv化化2或(V)用于用 8G4和鬼筆環膚染色的N129/159G。當E化2缺乏（iii)或當兩個N-糖基化區域發生突變(V)時 染色喪失。
[0030] 圖 2D是被轉染 W表達（i)空載體對照、（i i)鼠 TM4SF1 (MU-TM4SF1)或（i i i )Mu-Hu TM4SF1嵌合體的肥K293細胞的8(M免疫染色的一系列圖像。8G4識別Mu-Hu TM4SF1嵌合體而 不識別天然鼠 TM4SF1。
[0031] 圖沈是人、猴和小鼠 TM4SF1ECL2結構域的氨基酸序列的比較序列比對。每個ECL2 序列內的兩個N-連接糖基化位點用下劃線標出，并且劃分出（demarcate)由8G4抗體識別的 人TM4SF1上的表位。8G4表位包括跨越第一和第二糖基化位點（即，人TM4SF1的129-161氨基 酸）的人TM4SF1 E化2的氨基酸序列。
[0032] 圖3A是生長在玻璃圓盤上、用8G4、鬼筆環膚和DAPI免疫染色而不經化iton X-100 提取的HUVEC的圖像。8G4將TM4SF1定位至質膜和細胞質和細胞核位點（白色箭頭）。比例尺， 10微米。
[0033] 圖3B是圖3A的框(i)的放大圖像，示出F-肌動蛋白（鬼筆環膚染色，黃色箭頭)僅延 伸到nanopodia的最近端部分，nanopodia是從細胞表面的薄的、易碎的膜突起且在細胞運 動和細胞間相互作用中起作用。
[0034] 圖3C是圖3A的框（i)的放大圖像，示出8G4將TM4SF1定位至nanopodia(粉紅色箭 頭）。該圖像還示出了圖3B中描繪的F-肌動蛋白的鬼筆環膚染色(黃色箭頭）。
[00巧]圖3D是生長在玻璃圓盤上、用8G4、鬼筆環膚和DAPI免疫染色并W指定濃度化iton X-100提取的HUVEC的一系列圖像。由8G4識別的TM4SF1在很大程度上用0.05%(而不是 0.01%)的Triton X-100提取，但是殘留的核周和細胞核染色（白色箭頭）需要0.1%的 Triton X-100用于完全除去。比例尺，10微米。
[0036] 圖3E是用8G4抗體對TM4SF1染色的免疫印跡，示出用0.05%(而不是0.01%) Triton X-100提取的所有Ξ個主要（28-，25-，和22-40)了145。1條帶；較長的暴露證明用 0.1 % Triton提取殘留的28-kD的TM4SF1。
[0037] 圖3F是用8G4抗體對TM4SF1染色的免疫印跡，示出TM4SF1的亞細胞分布。
[003引圖4A是用8G4XD144和DAPI免疫染色人胃癌相關的血管內皮細胞化C)(粉紅色箭 頭)的免疫巧光圖像。人胃癌相關的血管EC表現出很強的8G4染色。右圖是左側框(i)的放大 圖像。L，內腔。比例尺，10皿。
[0039] 圖4B是與圖4A中的胃癌相關的血管E討目鄰的正常組織的免疫巧光圖像，其表明 CD144陽性血管（白色箭頭）的弱染色性。L，內腔。比例尺，ΙΟμπι。
[0040] 圖4C是免疫-納米金-透射電子顯微照片（ΤΕΜ)的圖像，示出內襯于腫瘤血管的EC 的8G4染色。
[0041] 圖4D和4E是圖4C的框（i)和（ii)的放大圖像，示出間隔的金顆粒(粉紅色箭頭 比化)腔外質膜大得多的程度布置(D)管腔質膜。比例尺，lOOnm。
[0042] 圖4F是圖4C的框（iii)的放大圖像，藍色箭頭指示在核質中的金顆粒。比例尺， lOOnm。
[0043] 圖4G是另一腫瘤血管的EC的免疫-納米金-ΤΕΜ 8G4染色的圖像，示出8G4標記的 nanopodia(綠色箭頭)和延伸至血管內腔內并形成經腔橋的基質填充的腸套疊狀突起。
[0044] 圖4H是圖4G的框（i)的放大圖像，示出延伸至血管內腔內并形成經腔橋的基質填 充的腸套疊狀突起。比例尺，lOOnm。
[0045] 圖41是胃中相鄰的正常血管EC的免疫-納米金-TEM 8G4染色的圖像。
[0046] 圖4J是圖41的框（i)的放大圖像，示出胃中的相鄰的正常血管EC缺乏nanopodia并 顯示出低的多的管腔(粉紅色箭頭)和缺少的腔外8G4標記。比例尺，lOOnm。
[0047] 圖5A是于4°C在懸浮液中用8G4或對照小鼠 IgG預溫育1小時、用冷PBS洗涂3次并在 指示的時間(〇-24h)再涂板的膜蛋白酶化的皿VEC的一系列流式細胞儀直方圖，示出通過流 式細胞術測量的細胞表面8G4強度（104個細胞/測量），在24小時的過程中從95.1 %下降到 4.9%。
[004引圖5B是示出在2、4或24小時再涂板并用8G4、鬼筆環膚和DAPI染色的冊VEC細胞的 一系列免疫細胞化學圖像。該圖像表明在2小時時8G4的細胞質沉積，在4小時時沉積增加， W及在24小時時可忽略不計的染色。
[0049] 圖5C是共焦-3D Z-堆疊（22帖；從細胞表面到基質220nm/帖）圖像，其定位8G4于 GFP轉導的HUVEC的核質(帖-6,白色箭頭）W及在2小時時定位于核周細胞質(帖-15,黃色箭 頭)。
[0050] 圖加是示出從0、4和24小時培養的8G4標記的冊VEC中制備的核提取物中8G4抗體 的重鏈和輕鏈的免疫印跡。
[0051 ] 圖祀是8G4標記2小時后HUVEC的免疫-納米金-TEM圖像。如在培養2小時時8G4在細 胞質、核孔(紅色箭頭)和核質（藍色箭頭）的顯著沉積的出現所證明，8G4已被內吞。
[0052] 圖5F是圖祀的框(i)的放大圖像，示出8G4能夠被內化入表達TM4SF1的HUVEC中。
[0053] 圖6A和6B是冊VEC的共焦-3D Z-堆疊圖像（33帖；從細胞表面到基質220nm/帖）， HUVEC在24孔板中的玻璃圓盤上培養，培養4小時后，接著暴露于(A)200ng 8G4和對照(Ctl) ADC(皂草素偶聯的山羊IgG Fab片段)或(B)200ng 8G4和實驗巧xp)ADC(皂草素偶聯的山羊 抗-小鼠化b片段），隨后免疫細胞化學前用(A)8G4/Ctl-ADC或(B)8G4/Exp-ADC繼續培養72 小時，示出相比（i)8G4/Ctl-ADC，HUVEC中的應力纖維高水平暴露于（ii)8G4/E邱-ADC。單個 帖顯示在細胞核(帖-12和-16;白色箭頭)和核周細胞質(帖-20;黃色箭頭）中的陽性Alexa- 594信號。
[0化4] 圖6C是在MTT測定第5天相比Ctl-ADC用8G4/EXP-ADC殺傷〉80%HUVEC的曲線圖（P， <0.0001，學生t-檢驗）（見下文實施例1)。抗體單獨培養的HUVEC不受影響。
[0055] 圖7是示出8G4-皂草素絡合物誘導的殺傷限于TM4SF1表達細胞的曲線圖。W類似 于冊VEC的水平表達TM4SF1的PC3腫瘤細胞，或不表達可檢測的TM4SF1的肥K293細胞，分別 在96孔板培養(5X103個細胞/孔）用于MTT測定。用200ng 8G4/Ctl-ADC或8G4/E邱-ADC培養 細胞5天。MTT測定顯示8G4的存在下用8G4/E邱-ADC而不是8G4/Ctl-ADC殺傷巧0%的PC3細 胞(p，<0.00001，學生t檢驗）d8G4/Exp-ADC在HEK293細胞中不誘導可檢測的細胞毒性。
[0056] 本發明的其它特征和優點將從下面的詳細描述和權利要求書中顯而易見。
[0057] 本發明實施方案的詳細描述 [0化引一、定義
[0059]如本文所用，術語"約"是指所引用的數值的+/-10%。
[0060] "跨膜-化6家族成員-UTM4SF1)"、"L6"、"L6抗原"、"M3sr、"腫瘤相關抗原L6 (TAAL6)"是指跨膜4超家族/四跨膜蛋白家族的多膚，其在腫瘤血管的內皮細胞化C)、腫瘤 細胞(TC)、發育視網膜血管的EC和新生血管上高度表達。TM4SF1包括，例如，人TM4SF1蛋白 (NCBI RefSeq N〇.NP_055035.1)，其長度為202個氨基酸。
[0061] 術語"抗體"和"免疫球蛋白（Ig)"在廣義下可互換使用并包括單克隆抗體(例如， 全長或完整的單克隆抗體）、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只 要它們表現出期望的生物活性），并且還可W包括某些抗體片段(如本文中更為詳細地描述 的）。抗體通常既包含"輕鏈"也包含"重鏈"。來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白）的 輕鏈基于其恒定結構域的氨基酸序列可被歸入兩種完全不同的類型之一，被稱為卡帕（K) 和拉姆達(λ)。根據其重鏈恒定結構域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類別。免疫 球蛋白有五大類：IgA、I曲、I姐、IgG和IgM，其中一些可被進一步分為亞類（同種型），例如 1邑61、1邑62、1邑63、1邑64、1邑4巧日1邑42。對應于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別被稱 為α、δ、ε、丫和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和Ξ維構型是眾所周知的。
[0062] "抗體片段"或"片段"只包含完整抗體的一部分，其中該部分優選保留當存在于完 整抗體時通常與該部分相關聯的至少一種、優選大多數或所有的功能。抗體片段的實例包 括化b、hb '、F(ab '）2和Fv片段(例如，單鏈可變片段（scFv));雙抗體;線性抗體;單鏈抗體 分子;和由抗體片段形成的多特異性抗體。抗體的木瓜蛋白酶消化產生被稱為"Fab"片段的 兩個相同的抗原結合片段，其每個片段都有一個抗原結合位點；和殘余的"Fc"片段，其名稱 反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原的 F(ab'）2片段。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，并因此保留了 結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含化區的抗體片段，保留當存在 于完整抗體中時通常與化區相關聯的至少一種生物學功能，如Fc化結合、抗體半衰期調控、 ADCC(抗體依賴性細胞毒作用）功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是具有與完 整抗體基本上類似的體內半衰期的單價抗體。例如，運樣的抗體片段可W包含連接至能夠 賦予該片段體內穩定性的化序列的抗原結合臂(binding arm)。
[0063] 如本文所用，抗體或其片段的"可變區"是指抗體分子的輕鏈和重鏈的部分，其包 括互補決定區（CDR;即CDR-UCDR-2和CDR-3)和框架區(FR)的氨基酸序列。VH是指重鏈的可 變結構域。化是指輕鏈的可變結構域。根據本發明所用的方法，可W根據Kabat(Sequence of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda, Md. ,1987和1991))來定義分配給CDR和FR的氨基酸位置。抗體或抗原結合片段的氨基酸編 號也是根據Kabat的編號。
[0064] 如本文所用，術語"互補決定區"或乂DR"是指抗體可變結構域的氨基酸殘基，它的 存在對于抗原結合是必要的。每個可變結構域通常具有3個CDR區，確定為CDR-1XDR-2和 CDR-3。每個互補決定區可W包括來自根據Kabat定義的"互補決定區"的氨基酸殘基（即在 輕鏈可變結構域中的大約殘基24-34化03-1^)、50-56化01?-1^2)和89-97(〔01?-1^3)，和在重鏈 可變結構域中的31-35(CDR-H1)、50-65 (CDR-H2)和95-102 (CDR-冊）；Kabat，等Sequence of Proteins of Immunological Interest,5*^ Ed.Public Health Service，National Institutes of Health,Be1:hesda MD. (1991))，和/或來自"高變環"的殘基（即在輕鏈可變 結構域中的大約殘基26-32化03-1^)、50-52化01?-1^2)和91-96化01?-1^3)，和在重鏈可變結構 域中的26-32 (CDR-Hl)、53-55 (CDR-H2)和96-10 1( CDR-H3) ;Chothia和Lesk， J.Mol. Biol. 196:901-917( 1987))。在一些情況下，互補決定區可W包括來自根據Kabat定 義的CDR區和高變環的氨基酸。
[0065] 如本文所用，術語抗體的"恒定結構域"是指非可變結構域(例如CH1、C肥、CH3和化 結構域)的任何結構域。
[0066] "框架區"（下文稱FR)是除CDR殘基之外的那些可變結構域殘基。每個可變結構域 通常具有四個FR，被確定為FR1、FR2、FR3和FR4。如果根據Kabat定義CDR，輕鏈FR殘基被定位 在大約殘基 1-23 化CFR1)、35-49(LCFR2)、57-88 (LCFR3)和98-107 化CFR4)處，重鏈FR殘基被 定位在重鏈殘基的大約殘基 1-3(KHCFR1)、36-49WCFR2)、66-94WCFR3WP103-113WCFR4) 處。如果CDR包含來自高變環的氨基酸殘基，輕鏈FR殘基被定位在輕鏈中大約殘基1-25 化CFR1)、33-49化CFR2)、53-90^CFR3)和97-107化CFR4)處，重鏈FR殘基被定位在重鏈殘基 的大約殘基1-25化CFR1)、33-52化CFR2)、56-95化CFR3)和102-113化CFR4)處。在一些情況 下，當CDR包含來自由Kabat定義的CDR的氨基酸和高變環的那些氨基酸時，FR殘基會相應地 調整。例如，當CDR-H1包含氨基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基處于位置1-25且FR2殘基處于位 置36-49。抗體或其功能性片段的可變區之間的共同結構特征是本領域公知的。編碼特定抗 體的DNA序列通常可通過下列公知方法找到，例如Kabat,等2987 Sequence of Proteins of Immunological Interest，U.S. Department of Health and Human Services , Bethesda MD中描述的那些，其通過引用并入本文。此外，用于克隆來自抗體的功能可變區 的一般方法可見于化au化ary，V. K.，等，1990 Proc.化tl. Acad. Sci . USA 87:1066，其通過 引用并入本文。
[0067] 本文所用的術語"單克隆抗體"指從基本上同質性的抗體群獲得的抗體，即包含該 群的各個抗體除了可能的突變W外是相同的，例如可能W少量存在的天然發生的突變。因 此，修飾語"單克隆"表示抗體的特征是不為獨立抗體的混合物。在某些實施方案中，該單克 隆抗體通常包括包含結合祀標的多膚序列的抗體，其中通過包括從多個多膚序列篩選單個 祀標結合的多膚序列的方法獲得祀標結合多膚序列。例如，篩選方法可W是從眾多克隆如 雜交瘤克隆、隧菌體克隆或重組DNA克隆的庫篩選獨特的克隆。應當理解，所選擇的祀標結 合序列可進一步改變，例如，W提高對祀標的親和力、人源化祀標結合序列、提高其在細胞 培養物中的生產、降低其體內免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變后的祀標結合 序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多 克隆抗體制劑相反，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除它們 的特異性之外，單克隆抗體制劑由于它們通常不受到其它免疫球蛋白的污染而是有利的。
[0068] 修飾語"單克隆"表示抗體的特征是從基本上同質性的抗體群獲得，而不應被理解 為要求通過任何特定方法生產抗體。例如，根據本發明待使用的單克隆抗體可通過多種技 術來制備，包括，例如：雜交瘤方法（如，Kohler and Milstein.,Nature 256:495-497 (1975) ;Hongo等，Hyb;ridomal4(3) :253-260(1995) 'Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press ,第二版，1988); Hammerl ing等，in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hyb;ridomas563-68UElsevie;r,N.Y., 1981))，重組 DNA方法（參見例如U.S.專利號4,816,567)，隧菌體展示技術（參見，例如(：13〇43〇11等， 化 ture 352:624-628(1991) ;Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992) ;Sidhu 等， J.Mol. Biol. 338(2): 299-310( 2004); Lee 等，J. Mol. Biol. :340( 5) :1073-1093(2004); 化House,PNAS USA 101(:34): 12467-12472(2004);和Lee等，111111111111〇1.]^1}1〇(18 284(1- 2) :119-132(2004),?及用于在動物中產生具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人 免疫球蛋白序列的基因的人或類人型抗體的技術（參見，例如W0 1998/24893;W0 1996/ 34096;W0 1996/33735;W0 1991/10741;化kobovits等，PNAS USA 90:2551(1993); Jakobovits等，Nature 362:255-258(1993);I3;ruggemann等，Year in Immunol.7:33 (1993) ;美國專利號5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625，126;5,633,425;和5,661， 016;Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg等，Nature 368:856-859 (1994) sMorrison,化 1:ure 368:812-813(1994) ;Fishwild等，Nature Biotechnol. 14:845- 851(1996) ;Neuberge;r,Nature Biotechnol. 14:826(1996); W及Lonberg和Huszar, Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
[0069] "嵌合"抗體(免疫球蛋白）具有與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的 抗體中的對應序列相同或同源的重鏈和/或輕鏈的一部分，而鏈的剩余部分與衍生自另一 物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體W及此類抗體的片段（只要它們表現出期望的生物 學活性）的對應序列相同或同源（美國專利號4，8 1 6，5 6 7 ;和Μ 0 r r i S 0 η等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))〇
[0070] 非人類(例如，鼠）抗體的"人源化"形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列 的嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體的高 變區的殘基被來自非人物種(供體抗體)的高變區的殘基替換，非人物種如小鼠、大鼠、兔或 具有所需特異性、親和力和能力的非人靈長類。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(FR) 殘基被相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現 的殘基。運些修飾是為了進一步改進抗體的性能。在一般情況下，人源化抗體會包含基本上 至少一個、通常兩個可變結構域，其中高變環的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白 的那些，和FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選還將包含 免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。更多細節參見化nes 等Nature 321:522-525(1986);Riechmann等Nature 332:323-329(1988);and Presta.Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596( 1992)。還參見如下綜述文章和其中引用的參考 文南犬：Vaswani and Kami 1 ton . Ann . A1 ler邑y , Asthma&Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris .Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038( 1995)；Hurle and Gross. Qirr. Op. Biotech.5:428-433(1994)。
[0071] "結合結構域"是指特異性結合祀表位、抗原、配體或受體的化合物或分子的一部 分。結合結構域包括但不限于:抗體(例如單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人源化抗體 和嵌合抗體）、抗體片段（例如化b片段、Fab ' 2、scFv抗體、SMIP、域抗體、雙抗體、微抗體、 ScFv-Fc、親和體(af門bodieS)、納米抗體和域抗體）、受體、配體、適體和具有確定的結合伴 侶的其它分子。
[0072] 本文中可互換使用的"多核巧酸"或"核酸"指任何長度的核巧酸的聚合物，包括 DNA和RNA。核巧酸可W是脫氧核糖核巧酸、核糖核巧酸、修飾的核巧酸或堿基、和/或它們的 類似物，或通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應可滲入聚合物中的任何底物。多核巧酸可 W包含修飾的核巧酸，如甲基化的核巧酸和它們的類似物。如果存在的話，可W在聚合物組 裝之前或之后對核巧酸的結構進行修飾。核巧酸序列可w被非核巧酸成分中斷。多核巧酸 可W在合成后進一步修飾，如通過與標記物偶聯。其它類型的修飾包括，例如，"加帽"，用類 似物替代一個或多個天然存在的核巧酸，核巧酸間修飾諸如:具有不帶電的連接(例如，甲 基麟酸醋、憐酸Ξ醋、憐酸酷胺、氨基甲酸醋等)和帶電的連接(例如硫代憐酸醋、二硫代憐 酸醋等）的那些，含有側基部分的那些，諸如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信號膚、聚k 賴氨酸等），具有嵌入劑(例如，叮晚、補骨脂素等）的那些，包含馨合劑(例如，金屬、放射性 金屬、棚、氧化性金屬等），含有燒化劑的那些，具有修飾的鍵(例如，α異頭核酸等）的那些， W及未修飾形式的多核巧酸。此外，通常存在于糖中的任何徑基基團可W被例如麟酸醋基 團、憐酸醋基團取代，用標準保護基團保護，或活化W制備與額外的核巧酸的額外連接，或 者可偶聯至固體或半固體支撐物。5'和3'末端0Η可W被憐酸化或被胺或1-20個碳原子的有 機加帽基團部分取代。其它徑基也可衍生成標準保護基團。多核巧酸還可W包含本領域中 通常已知的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如：2'-0-甲基-、2'-0-締丙基、2'- 氣-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-端基異構糖、差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來 蘇糖、化喃糖、巧喃糖、景天庚酬糖、非環類似物和堿性核巧類似物如甲基核糖核巧。一個或 多個憐酸二醋鍵可W被備選的連接基團取代。運些備選的連接基團包括，但不限于，其中憐 酸醋被Ρ (0) S Γ硫醋"）、Ρ (S) SΓ二硫醋"）、"(0)NR2 Γ酷胺化物"）、Ρ(0) R、Ρ (0) OR '、CO或C出 Γ甲縮醒"）替代的實施方案，其中每個R或R'獨立地為Η或取代的或未取代的烷基（1-20C)， 其任選地含有酸(-〇-)鍵、芳基、締基、環烷基、環締基或芳烷基(araldyl)。并不是多核巧酸 中的所有鍵都需要相同。前面的描述適用于本文中提及的所有多核巧酸，包括RNA和DNA。
[0073] 本文中所用的術語"載體"意指能夠轉運已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種 類型的載體是"質粒"，它是指環狀雙鏈DNA環，其中可W連接另外的DNA片段。某些載體能夠 在引入其的宿主細胞中自主復制（例如，具有細菌復制來源的細菌載體和附加體哺乳動物 載體）。其它載體(例如，非附加體哺乳動物載體)可W在引入至宿主細胞后整合到宿主細胞 的基因組中，從而隨宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的 基因的表達。此類載體在本文中稱為"重組表達載體"（或簡稱"重組載體"）。一般而言，在重 組DNA技術中有用的表達載體常常是質粒的形式。在本說明書中，"質粒"和"載體"有時可W 互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。
[0074] 根據本發明的"表位"是指是極大地有助于抗體的結合的祀多膚或抗原的氨基酸 殘基。祀多膚或抗原（例如，TM4SF1，或其片段或變體）與抗體（例如，抗TM4SF1抗體，例如 8G4)的結合可W通過免疫細胞化學分析來確定。在一些實施方案中，祀多膚的極大地起作 用的殘基的任意一個的突變（例如通過丙氨酸或同系物突變或通過缺失或截短的野生型 TM4SF1的突變)可W破壞抗體的結合，使得抗體的相對親和力比（I巧0突變體TM4SF1^^0 野生型 TM4SF1)可 W大于 1(例如2、3、4、5、10、50、100、500、1000或更大）。
[0075] "結合"目的祀多膚或抗原的本發明化合物是指W足夠親和力結合祀多膚或抗原 使得該化合物在祀向表達祀蛋白或抗原的細胞或組織中用作診斷和/或治療劑，并且不顯 著地與其它蛋白質交叉反應。在該實施方案中，化合物與"非祀"蛋白的結合程度將小于該 化合物與其特定祀蛋白結合的約10%，例如可通過巧光激活細胞分選(FACS)分析、免疫組 織化學、放射免疫測定(RIA)、化ISA或本領域中已知的任何其它標準的定量或半定量技術 確定。
[0076] 關于本發明的化合物(例如抗TM4SF1抗體)與祀標分子(例如TM4SF1多膚)的結合， 關于特定多膚祀標或特定多膚祀標上的的表位的術語"特異性結合"、"特異性結合于"和 "特異于"是指可測量地不同于非特異性相互作用（例如，非特異性相互作用可W是結合牛 血清白蛋白或酪蛋白）的結合。特異性結合可W通過例如確定相較于對照分子結合的分子 的結合來測定。例如，特異性結合可通過與類似于祀標的對照分子競爭來確定，例如，過量 的未標記祀標。在運種情況下，如果標記的祀標與探針的結合被過量的未標記祀標競爭性 抑制，則指示為特異性結合。本文中所用的術語"特異性結合"或"特異性結合"或"特異于" 特定多膚祀或特定多膚祀上的表位可表現為例如對祀標的Kd為約1微米至約IfM，或者約 200nM至約IfM，或者約200nM至約IpM，或者約150nM至約IfM，或者約150nM至約IpM，或者約 lOOnM至約IfM，或者約lOOnM至約IpM，或者約60nM至約IfM，或者約60nM至約IpM，或者約 50nM至約IfM，或者約50nM至約IpM，或者約30nM至約IfM，或者約30nM至約IpM，或者約20nM 至約IfM，或者約20nM至約IpM，或者約lOnM至約IfM，或者約lOnM至約IpM，或者約加 Μ至約 IfM，或者約8ηΜ至約IpM，或者約6ηΜ至約IfM，或者約6ηΜ至約IpM，或者約4ηΜ至約IfM，或者 約4nM至約IpM，或者約2nM至約IfM，或者約化Μ至約500pM時，或者約InM至約IfM，或者約InM 至約IpM。在一個實施方案中，術語"特異性結合"是指其中化合物結合特定多膚祀標或特定 多膚祀標的表位而基本上不結合任何其它多膚或多膚表位祀標的結合。
[0077] "與病理性血管生成相關的病癥"是指特征在于疾病狀態下新血管的生長過度、不 足或不適當（例如，正在從醫學角度來看不希望的血管生成的位置、時間或開始）或W至于 它會造成疾病狀態的任何病癥，運將受益于用本發明化合物或其藥物組合物的治療。本文 中待治療的病癥的非限制性例子包括:癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、胃 癌和肺癌;肥胖癥;黃斑變性;糖尿病性視網膜病變;銀屑病;細胞免疫;類風濕性關節炎;和 紅斑瘦瘡。
[0078] 術語"癌癥"和"癌性的"指或描述哺乳動物中特征通常在于不受調控的細胞生長 的生理病癥。良性和惡性癌癥W及休眠腫瘤或微轉移包括在該定義中。癌癥的例子包括但 不限于:乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、胃癌、胃癌、皮膚癌、食道癌、腎癌、腦癌、 甲狀腺癌、前列腺癌、膜腺癌癌和肺癌。
[0079] 本文所用的"腫瘤"是指所有寶生性細胞生長和增殖，無論是惡性的或良性的，W 及所有的癌前和癌性的細胞和組織。術語"癌癥"、"癌性的"、"細胞增殖性病癥"、"增殖性病 癥"和"腫瘤"在本文中并不互相排斥。
[0080] "化療劑"是用于癌癥治療的化學化合物。化療劑的實例包括，例如紫杉醇或托泊 替康或聚乙二醇化脂質體多柔比星(PLD)。化療劑的其它實例包括:烷基化劑如塞替派和 CYTOXAN狼環憐酷胺;烷基橫酸鹽，如白消安、英丙舒凡和嗦消安;氮丙晚，如苯并多 己（benzodopa)、卡波釀、美特多己(meturedopa)和脈多己（uredopa);亞乙胺和甲基Ξ聚氯 胺，包括六甲蜜胺、Ξ乙撐蜜胺、Ξ乙撐憐酷胺、Ξ乙撐硫代憐酷胺和Ξ甲基Ξ聚氯胺;番慕 枝內醋(尤其是泡番慕枝辛和泡番慕枝辛酬）；喜樹堿;苔薛抑素;callystatin;CC-1065(包 括其阿多來新，卡折來新和比折來新合成類似物）；念珠藻素(特別是念珠藻素1和念珠藻素 8);多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);五加素； pancratistatin; sa;rcodict5dn;軟海綿素；氮芥類，如苯下酸氮芥、糞氮芥、環憐酷胺、雌莫 司汀、異環憐酷胺、氮芥、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興、苯芥膽醬醇、潑尼氮芥、Ξ 芥環憐酷胺、尿喀晚氮芥;亞硝基脈，如卡莫司汀、氯脈霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀 和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，如締二烘類抗生素（如卡奇霉素，特別是卡奇霉素丫 1 和卡奇霉素 ω 1(見例如Agnew,化em. Inti .Ed.Engl. ,33:183-186(1994));達內霉素，包括 達內霉素 A;二麟酸鹽如氯麟酸鹽;埃斯培拉霉素；W及新制癌菌素生色團和相關色素蛋白 締二烘抗生素生色團）、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、阿奇霉素、重氮絲氨酸、 博來霉素、放線菌素 D、辣椒素、鄉氨霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比 星、6-重氮-5-氧代-k正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑩《柔比星飽括嗎嘟代多柔比星、氯 基嗎嘟代-多柔比星、2-化咯嘟-多柔比星和脫氧多柔比星）、表阿霉素、依索比星、伊達比 星、麻西羅霉素、絲裂霉素如絲裂霉素 C、霉酪酸、諾加霉素、橄攬霉素、培洛霉素、絲裂霉素、 嚷嶺霉素、Ξ鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脈菌素、結核菌素、烏苯美司、凈司他下、佐 柔比星；代謝括抗劑，如甲氨蝶嶺和5-氣尿喀晚（5-即）；葉酸類似物，如二甲葉酸、甲氨蝶 嶺、蝶羅嶺，Ξ甲曲沙;嚷嶺類似物，如氣達拉濱、6-琉基嚷嶺、硫咪嚷嶺、硫鳥嚷嶺；喀晚類 似物，如安西他濱、阿扎胞巧、6-氮尿巧、卡莫氣、阿糖胞巧、二脫氧脈巧、去氧氣尿巧、依諾 他濱、氣尿巧;雄激素，如卡魯睪酬、屈他雄酬丙酸、環硫雄醇、美雄燒、睪內醋；腎上腺括抗 劑，如魯米特、米托坦、曲洛司坦;葉酸補充劑，如亞葉酸;醋葡醒內醋;醒憐酷胺糖巧;氨基 乙酷丙酸；恩尿喀晚；安日丫晚；bestrabuci 1;蔥雙咪腺；edatraxate; def ofamine;地美可辛； 地亞釀;elformithine;依利醋胺(elliptinium);埃博霉素；依托格魯;硝酸嫁;徑基脈;香 茹多糖；lonidainine;美登素類，如美登素和安絲菌素;米托脈腺;米托蔥釀;mopidanmol; nitraerine;噴司他下；苯來美特；化柔比星；洛索蔥酬；足葉草酸；2-乙酷阱；甲基節阱； PSK⑧《糖復合物(JHS天然產品，Eugene ,0reg.);雷佐生;根霉素；sizofuran;螺環錯;菌 酬酸;Ξ亞胺釀;2，2 '，2"-Ξ氯Ξ乙胺;單端抱霉締(尤其是T-2毒素 、verracurin A、桿抱毒 素 A和蛇形菌素）；烏拉坦;長春地辛;達卡己嗦;甘露醇氮芥;二漠甘露醇;二漠衛矛醇;贓泊 漠燒;gacytosine;阿糖胞巧（"阿糖胞巧"）；環憐酷胺;塞替派;紫杉燒類，如TAXOL?紫 杉醇（Bristol-Myers Sqidbb Oncology,Princeton,N.J.)，ΑΒ扶AX.ANE⑥無聚氧乙締 藍麻油，白蛋白工程化的納米顆粒紫杉醇制劑（American Pharmaceutical Partners , Schaumberg, 111.)和TAXOTE民E⑩多西他賽（I^i〇ne-F*oulenc Rorer,Antony,法國）； 苯下酸氮芥；GEMZA民⑥吉西他濱;6-硫鳥嚷嶺;琉基嚷嶺；甲氨蝶嶺；銷類似物，如順 銷、奧沙利銷和卡銷；長春堿；銷；依托泊巧（VP-16);異環憐酷胺；米托蔥釀；長春新堿； NAVELBINE⑧長春瑞濱;諾肖林；替尼泊巧;依達曲沙;柔紅霉素;氨噪嶺;希羅達;伊 班麟酸鋼;伊立替康(依立替康，CPT-11)(包括伊立替康與5-RJ和亞葉酸的治療方案）；拓撲 異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氣甲基鳥氨酸(DMF0);類視黃醇，如視黃酸;卡培他濱;考布他 汀;亞葉酸(LV);奧沙利銷，包括奧沙利銷治療方案(F0LF0X);拉帕替尼(Tykerb @);PKC- α，Raf，H-Ras，EGFR(例如，埃羅替尼(Tykerb⑥）)和降低細胞增殖的VEGF-A抑制劑，和上 述任何的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0081]本文所用的術語"細胞毒素劑"指抑制或阻止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物 質。該術語意圖包括放射性同位素(例如，4*211、1131、1125、￥ 9*\1^186、1^188、5111153前21 2、口3哺 Lu的放射性同位素），化療劑，例如甲氨蝶嶺、阿霉素、長春花生物堿(長春新堿、長春堿、依 托泊巧）、阿霉素、美法侖、絲裂霉素 C、苯下酸氮芥、柔紅霉素或其它嵌入劑、酶及其片段，諸 如溶核酶、抗生素，和毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括 其片段和/或其變體，和下文公開的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。其它細胞毒素劑描述如下。殺 腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。
[0082] 用于本文時"生長抑制劑"是指在體外或體內抑制細胞(例如，表達TM4SF1的細胞） 的生長和/或增殖的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可W顯著降低TM4SF1表達細胞的百 分比。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期進程(除了 S期W外的位置)的試劑，諸如誘導G1 停滯和Μ期停滯的試劑。傳統的Μ期阻斷劑包括:長春花(長春新堿和長春堿）、紫杉燒類和拓 撲異構酶II抑制劑，如蔥環類抗生素多柔比星（（8S-反)-10-[(3-氨基-2,3,6-S脫氧-αΑ- 來蘇-己化喃基)氧基]-7,8,9，10-四氨-6,8，11-Ξ徑基-8-巧圣乙酷)-1-甲氧基-5,12-并四 苯二酬）、表柔比星、柔紅霉素、依托泊巧和博萊霉素。阻止G1的那些試劑也深入至S期停滯， 例如DNA燒化劑，如他莫昔芬、強的松、達卡己嗦、氮芥、順銷、甲氨蝶嶺、5-氣尿喀晚和阿糖 胞巧。更多信息可見于Murakami等的The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和 Israel，eds.，第一章，標題為"Cell cycle regulation,oncogenes ,and antineoplastic 化ugs" (WB Saunders:Philadelphia, 1995)，特別是第13頁。紫杉燒類（紫杉醇和多西他賽） 是來自紅豆杉樹的抗癌藥物。來自歐洲紅豆杉的多西他賽（?ΑΧΟΤΕ民&?，Rhone- 化ulenc Rorer)是紫杉醇（TA.XOL·⑥，Bristol-Myers Squ;Lbb)的半合成類似物。紫杉醇 和多西他賽促進來自微管蛋白二聚體的微管的裝配并通過防止解聚穩定微管，運導致細胞 中有絲分裂的抑制。
[0083] 本文中所用的"抗激素劑"指的是調節、降低、阻斷和/或抑制能促進癌癥生長的激 素的效果的化合物或組合物，而且往往為系統或全身治療形式。它們可W是激素本身。實例 包括抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，包括，例如：他莫昔芬（包括 NOLVADE文霞他莫昔芬）、E VIST A⑥古洛昔芬、屈洛昔芬、4-徑基他莫西芬、曲沃西 芬、雷洛昔芬、LY117018、奧那司酬、和FARESTQN⑥托瑞米芬;抗孕酬;雌激素受體下調 劑化RD);發揮抑制或關閉卵巢作用的試劑，例如，黃體生成素釋放激素化HRH)激動劑，如 LU P民ON返)和E LIG A R D⑧醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲譜瑞林； 其它抗雄激素，如氣他胺、尼魯米特和比卡魯胺;和抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調節腎 上腺中生成的雌激素，例如，4(5)-咪挫、氨魯米特、MEGASE⑩醋酸甲地孕酬、 AROMASIN⑩依西美坦、formestanie、法個挫、民IVISO民⑩化站I坐、FEMA民A⑩ 來曲挫、和A民IMIDEX⑩阿那曲挫。另外，化療劑的運種定義包括二麟酸鹽如氯麟酸鹽 (例如，BONEFOS⑥巧OSTAC⑩）、DID民OCAL⑥依替麟酸、NE -5 8 0 9 5、 ZOMETA ?挫來麟酸/挫來麟酸鹽、FOSAMAXd)阿侖麟酸鹽、A_RJBDIA?帕米麟 酸鋼、SKELID⑥替魯麟酸鹽或ACTONEL⑥利塞麟酸鋼；W及曲沙他濱（1，3-二氧戊 環核巧胞喀晚類似物）；反義寡核巧酸，特別是抑制在牽設異常細胞增殖的信號轉導通路中 的基因的表達的那些，例如，PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體化GF-R);疫苗，如 THE民ATOPE⑥疫苗和基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN⑥疫苗、LEUVECTIN⑧疫 苗和VAXID⑧疫苗；LU民TOTECAN⑧拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX⑥GnRH 括抗劑；拉帕替尼二甲苯橫酸醋化rbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為 GW572016);和上述任何的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0084] 本文所用的術語"接頭"是指化學連接劑(例如，同雙功能和異雙功能交聯劑(偶聯 劑）），其可W包括柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個碳原子，或一個或 多個氨基酸，即通過膚鍵將一個分子(例如，本發明的化合物，例如抗TM4SF1抗體)共價連接 到另一個分子(例如試劑，例如治療劑如皂草素，或診斷劑如巧光或放射性標記物）。
[0085] 術語"樣品"和"生物樣品"可互換使用，是指獲自個體包括體液、體組織(例如腫瘤 組織）、細胞或其它來源的任何生物樣品。體液是例如淋己、血清、全新鮮血液、外周血單核 細胞、冷凍全血、血漿(包括新鮮或冷凍的）、尿液、唾液、精液、滑液和脊髓液。樣品也包括乳 房組織、腎組織、結腸組織、腦組織、肌肉組織、滑膜組織、皮膚、毛囊、骨髓和腫瘤組織。用于 從哺乳動物獲得組織切片和體液的方法是本領域眾所周知的。
[0086] 如本文所用，"治療"（及其語法變化諸如"治療（treat)"或"治療（treating)")是 指試圖改變被治療的個體的自然進程的臨床介入，并且可W是為了預防或在臨床病理學過 程中執行，可能導致受試者(例如人受試者）中疾病或病癥的進展或嚴重程度(例如，與病理 性血管生成相關的病癥，例如癌癥）、或疾病或病癥的一種或多種癥狀的進展、嚴重性或頻 率的降低（例如，至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、 80%、90%、95%、99%或甚至100% )。治療的期望效果包括但不限于:預防疾病的發生或復 發，癥狀的減輕，疾病的任何直接或間接病理學后果的減輕，預防轉移，減緩疾病進展的速 率，改善或緩和疾病狀態，及緩解或改善預后。
[0087] "藥物組合物"是指含有本文所述的化合物的組合物，其與藥學上可接受的載體一 起配制，并經政府管理機構批準作為治療哺乳動物中疾病的治療方案的一部分制造或出 售。藥物組合物可被配制為例如W單位劑量形式(例如，片劑、膠囊、囊片、軟膠囊或糖漿)用 于口服給藥；用于局部給藥(例如作為乳膏、凝膠、洗劑或軟膏）；用于靜脈內施用（例如，作 為無顆粒栓子的無菌溶液，和在適合于靜脈內使用的溶劑體系中）；或本文所述的任何其它 制劑。
[0088] "藥學上可接受的載體"是指對被治療的哺乳動物(例如人)生理學上可接受的載 體，同時保留與其一起施用的化合物的治療性質。示例性的藥學上可接受的載體是生理鹽 水。其它生理上可接受的載體和它們的制劑是本領域技術人員已知的，并描述于例如 Remington's Pharmaceutical Sciences(第18片反，A.Gennaro,1990,MackPublishing Company，Easton，PA)，其通過引用并入本文。
[0089] "序列同一性"或"序列相似性"是指兩個或更多個氨基酸序列、或兩個或更多個核 巧酸序列之間的同一性或相似性，用序列之間的同一性或相似性來表示。序列同一性可W 同一性百分比來衡量;百分比越高，序列相同的越多。序列相似性可W相似性百分比（其考 慮保守氨基酸取代)來衡量;百分比越高，序列越相似。使用標準方法比對時核酸或氨基酸 序列的同系物或同源物具有相對高的序列同一性/相似性。
[0090] 用于比較的序列比對方法在本領域中是公知的。各種程序和比對算法描述于 Smith&Waterman'Adv.Appl.Math.2:482,1981;化edleman&Wunsch'J.Mol.Biol.48:443, 1970;Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene, 73: 237-44,1988 ;Higgins&化arp ,CABI0S 5:151-3,1989 ;Co;rpet等，Nuc. Acids Res . 16: 10881-90,1988;Huang等Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992;和 Pearson等，Meth.Mol.Bio.24:307-31，1994〇Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990提 出了序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。
[0091] NCBI 基本局部比對捜索工具（BLAST) (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403-10, 1990)可從幾個來源獲得，包括國家生物信息中屯、(NCBI，國家醫學圖書館，大廈38A，8N805 室，Bethesda，MD 20894)和互聯網上，用于與序列分析程序blastp、blastn、blasts、 tblastn和tblastx結合使用。運些軟件程序通過對各種置換、缺失和其它修飾分配同源性 程度來匹配相似的序列。保守取代通常包括下組內的取代:甘氨酸、丙氨酸;鄉氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺;絲氨酸、蘇氨酸;賴氨酸、精氨酸;和苯 丙氨酸、酪氨酸。更多信息可W在NCBI網址上找到。
[0092] BLASTN用于比較核酸序列，而BLASTP用于比較氨基酸序列。為了比較兩個核酸序 列，運些選項可W設置如下：-i設置為包含待比較的第一核酸序列的文件（如C:\ seql . txt) ;-j設置為包含待比較的第二核酸序列的文件（如C:\seq2. txt) ;-p設置為 blastn; -0設置為任何希望的文件名（如C: \output. txt); -q設定為-1; -r設定為2;所有其 它選項保留默認設置。例如，下面的命令可用來生成包含兩個序列之間的比較的輸出文件： C:\B12seq-i c:\seql.txt-jc:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r 2〇
[0093] 為了比較兩個氨基酸序列，B12seq的選項可W進行如下設置:-i設置為包含待比 較的第一氨基酸序列的文件(如C:\seql. txt) ;-j設置為包含待比較的第二氨基酸序列的 文件（如C:\seq2.txt) ;-p設定為blas1:p;-〇設置為任何希望的文件名（如C:\output.txt); 所有其它選項保留默認設置。例如，下面的命令可用來產生含有兩個氨基酸序列之間的比 較的輸出文件：C:\B12seq-i c:\seql.txt-jc:\seq2.txt-p blastp-〇 c:\output.txt。如 果兩個比較的序列具有同源性，那么指定的輸出文件將呈現與比對序列同源的那些區域。 如果兩個比較的序列不具有同源性，那么指定的輸出文件將不呈現比對序列。
[0094] -旦比對，即可通過對其中在兩個序列中出現相同的氨基酸或核巧酸殘基的位置 的數目計數來確定匹配的數目。序列同一性百分比是通過將匹配的數目除W被鑒定的序列 中所示的序列長度或者較接長度(如鑒定的序列中所示的序列的100個連續核巧酸或氨基 酸殘基），隨后將所得值乘W100來確定。在一些實例中，對于多膚，比較序列的長度一般為 至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、125、150、200、 250、300或350個連續的氨基酸。
[0095] 術語"治療有效量"是指在受試者中治療疾病或病癥，如與病理性血管生成相關的 病癥的本發明的化合物或組合物(例如，藥物組合物）的量。在癌癥的情況下，如癌性腫瘤， 治療有效量的化合物或組合物可減少癌細胞的數目；減少原發腫瘤大小；抑制（即，一定程 度上減緩和優選停止)癌細胞滲入到外周器官中；抑制（即，一定程度上減緩和優選停止)月中 瘤轉移;在一定程度上抑制腫瘤的生長;和/或在一定程度上減輕與癌癥相關的一種或多種 癥狀。至化合物或組合物可W阻止存在的癌細胞的生長和/或殺傷存在的癌細胞的程度，該 化合物或組合物可能是抑制細胞的和/或細胞毒性的。對于癌癥治療，體內功效可W例如通 過評估存活持續時間、疾病進展時間（TTP)、響應速度(RR)、響應持續時間和/或生活質量來 測量。
[0096] "減少或抑制"是指引起總體減少優選20 %或更大、更優選50 %或更大和最優選 75%、85%、90%、95%或更大的能力。減少或抑制可^指所治療的病癥(例如，與病理性血 管生成相關的病癥，例如癌癥）的癥狀、轉移的存在或大小，原發腫瘤的大小或血管生成疾 病中血管的大小或數量。
[0097]本文所用的"施用"是指給予受試者一定劑量的化合物或組合物（例如藥物組合 物)的方法。本文描述的方法中使用的組合物可W通過W下給藥，例如:肌內、靜脈內、皮內、 經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、煩內、關節內、前列腺內、胸腔內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰 道內、直腸內、局部、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、泡內、粘膜、屯、包內、廝帶內、眼內、口服、外 用、局部、通過吸入、通過注射、通過輸注、通過連續輸注、直接通過局部灌注浸浴祀細胞、通 過導管、通過灌洗、W霜劑或脂質組合物。優選的給藥方法可根據各種因素(例如，施用的化 合物或組合物和所治療的狀況、疾病或病癥的嚴重程度)而變化。
[009引貫穿本說明書和權利要求書，詞語"包含"或變形如"包括"或"包會'將被理解為暗 示包括列出的整數或整數組，但不排除任何其它整數或整數組。
[0099] "受試者"是指哺乳動物(例如人）。
[0100] II.跨膜-化6家庭成員-UTM4SF1)
[0101] 于1986年發現了為"L6抗原"或"腫瘤細胞抗原"的跨膜-化6家族成員-UTM4SF1) 化ellstrom等Cancer Res. 46:3917-3923，1986)，因為它在許多癌細胞上大量表達。出乎意 料的是，發現它在供應正常組織的血管的內皮上有少量表達(DeNardo等Int J Rad Appl Instrum B.18:621-631,1991;Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000;Richman等 (Mincer Res. 5916s-5920s, 1995 ;0'Donnell等P;ros1:ate. 37:91-97,1998)。
[0102] TM4SF1是具有四跨膜蛋白拓撲結構但不同源的小質膜糖蛋白（NCBI RefSeq No. NP_055035.1) (Wright等Protein Sci . 9:1594-1600，2000)。它在質膜上形成TM4SF1 富 集的結構域(TMED)，其中如真正的四跨膜蛋白，它作為分子促進劑募集功能上相關的膜和 胞質分子（Shih等(Mincer Res. 69: 3272-3277,2009; Zukauskas等，4叫;[0旨6]16313.14:345- 354,2011)，并在癌細胞生長化ells化om等Cancer Res.46:3917-3923,1986)、運動（化ang 等Int J (Mincer. 116:243-252,2005)和轉移（Richman等化ncer Res.5916s-5920s,1995) 中發揮重要作用。
[0103] TM4SF1通過內襯于供應幾種人類癌癥的血管的EC(Shih等化11。日'1^3.69:3272- 3277,2009; Zukauskas 等 Angiogenesis. 14 ::345-354,2011)、通過發育視網膜的血管 化ngl ish等J Biomed Inf orm. 42:287-295，2009) W及通過小鼠中由表達VEGF-A的腺病毒 誘導的新生血管（Shih等Cancer Res.69:3272-3277，2009)而高度表達，但是并不通過許多 其它類型的細胞高度表達（Shih 等 Cancer Res. 69 :3272-3277,2009; Zukauskas 等 Angiogenesis. 14:345-354，2011)。而且，TM4SF1通過培養的EC而高度表達，其中它被定位 于質膜和薄的伸長的質膜突起nanopod ia，其從細胞表面向上延伸多達50微米（Shih等 Cancer Res.69:3272-3277,2009;Z址auskas等Angiogenesis.14:345-354,2011)〇TM4SFl 調節EC分化、增殖和定向遷移（Shih等Cancer Res . 69 : 3272-3277，2009 ; Zukauskas等 Angiogenesis.14:345-354,2011)。
[0104] 總之，運些發現提示TM4SF1具有作為用于治療癌癥的血管祀標的潛力。在運里，我 們報告了支持運種可能性的證據。我們制備了抗TM4SF1的一組鼠單克隆抗體。我們選擇了 運些抗體之一8G4用于進一步研究。8G4特異性結合胞外環2化CL2)上的唯一表位（SEQ ID NO: 1)。重要的和出人意料的是，在加入到培養基后，8G4被逐步內化入EC，當與治療劑(例如 皂草素)絡合時，引起廣泛的EC殺傷。因此，我們的結果有力地表明，在8G4抗體和與其共享 TM4SF1的E化2上的唯一的且新穎的結合表位的化合物，可用于診斷和治療的療法，例如治 療患有與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥)的受試者的方法。
[0105] III.本發明的化合物
[0106] 因此，本發明的特征在于包括結合結構域的化合物，該結合結構域在包含氨基酸 序列NYTFASTEGQY化DTSTW沈CTEPKHIVEWNVS(沈Q ID NO: 1)的表位結合(例如，特異性結合） 多膚。所述化合物可W包括在包含SEQ ID NO: 1的表位特異性結合跨膜-4L6家族成員-1 (TM4SF1)或其片段，如人TM4SF1 (NCBI RefSeq No.NP_055035.1)或其片段的結合結構域。 在一些情況下，人TM4SF1多膚被糖基化(例如，N-糖基化），例如在殘基N129或殘基N159。在 一些情況下，糖基化的人TM4SF1多膚在兩個殘基N129和N159都糖基化。該化合物可WlOnM 或更小的 Kd 值（例如 10nM、5nM、2nM、lnM、500pM、100pM、50pM、lpM或500fM或更小）特異性結 合糖基化的人TM4SF1。所述化合物可W包括包含選自下組的至少一個氨基酸序列（例如1、 2、3、4、5或6個氨基酸的序列）的結合結構域：GFTFSSFAMS(SEQ ID N0:2)， TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)，RGIYYGYDGYAMDY(沈Q ID N0:4)，RSSQSLVHSNGNTTLH (沈Q ID N0:5)，KVSNRFS(沈Q ID N0:6)，和SQSTHVYT(沈Q ID N0:7)。化合物例如可W包括 包含選自下組的至少一個、至少兩個或所有Ξ個氨基酸序列的結合結構域:GFTFSSFAMS (沈9 10側：2)，1155651￥1￥￥了06￥撕（沈9 10側：3)，和1?61￥￥6￥06￥410￥(沈9 10側：4)。化 合物例如可W包括包含選自下組的至少一個、至少兩個或所有Ξ個氨基酸序列的結合結構 域：RSSQSLVHSNGNTTLH(SEQ ID N0:5)，KVSNRFS(沈Q ID N0:6)，和SQSTHVYT(SEQ ID NO: 7)。化合物例如可W包括包含下列六個氨基酸序列的結合結構域:GFTFSSFAMS(SEQ ID NO: 2),TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO：3),RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID N0：4), RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQIDN0:5)，KVSNRFS(沈QIDN0:6)，和SQSTHVYT(沈QIDN0:7)。
[0107] 在一些實施方案中，本發明的化合物可W是抗體或其抗體片段。該抗體可W是單 克隆的、人源化的、嵌合的或合成的。在一些情況下，該抗體通過雜交瘤小鼠細胞系864-5- 13-13F(PTA-1 20 523 )(即8G4抗體）產生。在一些情況下，抗體的重鏈包括與 EVILVESGG化VKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQT陽KRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTIS畑NAKN TVHLQMSSLR沈DTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(沈Q ID N0:8)具有至少60%、65%、 70%、75%或80%序列同一性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)的氨基酸序列。 在一些情況下，抗體的輕鏈包括與 AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLV 服 NGNTYLHWYMQKPGQS PKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO：9) 具有至少 60%、65%、70%、75%或80%序列同一性（例如81%、82%、83%、84%、85%、 86%'87%'88%'89%'90%'91%'92%'93%'94%'95%'96%'97%'98%'99%或 100% 同一性)的氨基酸序列。在一些情況下，抗體的重鏈包括與EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFT FSSFAMSWVRQTP邸RLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTIS畑NAKNTVHLQMSSLR沈DTAMYYCARRGIYYGY DGYAMDYWGQGTSVTVSS(沈Q ID NO: 8)具有至少60 %、65%、70%、75% 或80 % 的序列同一性 (例如81 %'82%'83%'84%'85%'86%'87%'88%'89%'90%'91%'92%'93%'94%、 95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %同一性）的氨基酸序列，抗體的輕鏈包括與 AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQ化V服NGNTYLHWYMQKPGQSPK化IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT 0(153￥64孤11；1￥尸〔595^1口1^\尸6461'1(1^0((沈9 10側:9)具有至少60%、65%、70%、75%或 80%的序列同一性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性）的氨基酸序列。在一些情況 下，化合物可W是裸露的、未偶聯的或者未經修飾的化合物，諸如裸露的、未偶聯的或未經 修飾的抗體。
[0108] 如上所述，本發明的特征在于化合物如本文所述的抗TM4SF1抗體，其與8G4抗體的 重鏈和輕鏈的氨基酸序列具有小于100%的氨基酸序列同一性。雖然變體化合物具有較低 程度的序列同一性（例如，小于100%的序列同一性，例如90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性），但具有足夠的相似性，W便由氨基酸序列執 行本文所描述的多膚所執行的一個或多個相同功能。多膚的相似性由保守氨基酸的取代來 確定。運種取代是由具有類似特性的另一氨基酸取代多膚中給定的氨基酸的那些。保守取 代可能是表型沉默的。通常脂族氨基酸Ala、Val、Leu和lie中的一個置換為另一個;徑基殘 基Ser和化r的互換，酸性殘基Asp和Glu的交換，酷胺殘基Asn和Gin之間的取代，堿性殘基 Lys和Arg之間的交換，芳族殘基化e、Tyr和化P中的替換被視為保守取代。關于哪些氨基酸 的變化可能是表型沉默的指導見于Bowie等(Science. 247:1306-1310,1990)和如下表1。
[0109]
[0110]
[0111]在一些實施方案中，本發明的化合物可W是偶聯物（即，偶聯的化合物），其還包含 一種或多種試劑(例如，1、2、3或4或更多種試劑），如治療劑，其與化合物加和或協同作用， 例如在與病理性血管生成相關的病癥例如癌癥的治療中殺傷或抑制腫瘤細胞(TC)和/或腫 瘤血管的內皮細胞化C)。治療劑例如可W是生物活性部分，例如細胞毒素劑、化療劑、蛋白 質、膚、抗體、生長抑制劑和/或抗激素劑。
[0112] 細胞毒素劑可W是例如核糖體失活蛋白（例如皂草素）、組蛋白脫乙酷基酶化DAC) 抑制劑、微管蛋白抑制劑、燒化劑、抗生素、抗腫瘤劑、抗增殖劑、抗代謝物、拓撲異構酶I或 II抑制劑、激素激動劑或括抗劑、免疫調節劑、DNA小溝結合劑和放射性試劑。可直接或間接 與本發明化合物偶聯的示例性微管蛋白抑制劑的實例包括但不限于下表2中列出的那些。
[0113] 表2.示例性微管蛋白抑制劑
[0114]
[0115]
[0116] 描述了用于偶聯至本發明化合物的化療劑。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉 毒素 A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素 A鏈（來自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa))、藍麻毒素 A鏈、相思豆毒素 A鏈、葫蓮根A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋 白，美洲商陸(陸^olaca americana)蛋白（ΡΑΡΙ,ΡΑΡΠ 和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋 白、己豆毒素、肥阜草抑制劑、白樹毒素，mitogellin、局限曲霉素、酪霉素、伊諾霉素和單端 抱菌素。參見例如1993年10月28日公開的W0 93/21232。多種放射性核素可用于制備本發明 的放射性偶聯化合物。例子包括21噸1、1311、131111、 9種和18嗦6。可替代地，本發明化合物可偶聯 至一種或多種小分子毒素，諸如卡奇霉素類、美登素生物堿類、海兔毒素類、aurostatins、 單端抱霉締族化合物和CC1065,并且運些毒素的具有毒素活性的衍生物在此也在本文中考 慮。可偶聯至本發明的化合物的其它治療劑(特別是抗癌劑)包括BCNU、鏈脈霉素、長春新堿 和5-氣尿喀晚，已知在美國專利號5，053，394、5，770，710中描述的統稱為化-E33288絡合物 的試劑家族，W及埃斯波霉素(esperamicins)(美國專利號5,877,296)。
[0117] 對于TC的選擇性破壞，本發明的化合物可包含高度放射性原子。多種放射性同位 素可用于生成放射性偶聯的化合物。例子包括At2ii、li3i、li25、YW、Rei 86、Re"8、Smi53、Bi2i2、 P32、Pb2i哺Lu的放射性同位素。放射性或其它標記可W已知的方式引入偶聯物中。例如，本 發明的放射性偶聯化合物可生物合成，或者可W通過化學氨基酸合成使用適合的氨基酸前 體來合成，包括例如氣-19代替氨。標記如tc"m或ii23、Rei86、Re"哺Iniii可通過膚中的半脫 氨酸殘基連接。錠-90可W通過賴氨酸殘基連接。I0D0GEN方法（Fraker等 Biochem. Biophys . Res . Commun .80:49-57,1978)可用于引入艦-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigra地y"(Qiatal,CRC Press 1989)詳細記載了其它方法。
[0118] 在一些實施方案中，本發明的化合物可W是偶聯物（即，偶聯的化合物），其還包括 一種或多種試劑(例如1、2、3、或4或更多種試劑），如診斷劑。診斷劑例如可W是標記物，如 巧光標記物、生色標記物或放射性標記物。因此，該標記物可用于檢測目的，并且可W是巧 光化合物、酶、輔基、巧光材料、生物發光材料或放射性材料。放射性標記物例如可W包含用 于閃爍照相研究的放射性原子，例如Tc"m或II23,或用于核核磁共振(N1R)成像(也稱為磁共 振成像，MRI)的自旋標記物，諸如艦-123、艦-131、銅-111、氣-19、碳-13、氮-15、氧-17、禮、 車孟或鐵。
[0119] 在一些實施方案中，本發明的化合物可W是偶聯物（即，偶聯的化合物），它包括一 種W上的試劑(例如2、3或4或更多種試劑），其中至少一種試劑是治療劑，至少一種試劑是 診斷劑，如如上所述的治療劑和診斷劑。
[0120] -種或多種試劑（例如，治療劑和/或診斷劑）可直接偶聯至本發明的化合物（例 如，通過直接的共價或非共價相互作用的方式），W使得該試劑立即偶聯至化合物。試劑可 直接偶聯至本發明的化合物，例如通過直接的膚鍵。在其它情況下，直接偶聯是通過直接非 共價相互作用的方式，如本發明的化合物和特異性結合所述化合物(例如抗體試劑)的試劑 之間的相互作用。
[0121] -種或多種試劑(例如，治療劑和/或診斷劑)可W間接地偶聯至本發明的化合物 (例如，通過具有直接共價或非共價相互作用的接頭的方式）。接頭可W是化學連接劑，如同 雙功能和異雙功能交聯劑，其可從許多商業來源獲得。用于交聯的區域可W在本發明的化 合物(例如，抗TM4SF1抗體）中找到。接頭可包括柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或15個碳原子。示例性接頭包括BS3([雙(橫基班巧酷亞胺）辛二酸鹽];BS3是祀向可 進入的伯胺的同雙功能N-徑基班巧酷亞胺醋），NHS/抓C(N-徑基班巧酷亞胺和N-乙基-(二 甲氨基丙基)碳二亞胺;NHS/抓C允許伯胺基團與簇基偶聯），橫基-EMCS([N-e-馬來酷亞胺 基己酸]酷阱;橫基-EMCS是對琉基和氨基具有反應性的異雙功能反應基團（馬來酷亞胺和 NHS-醋）），酷阱(大多數蛋白含有暴露的碳水化合物且酷阱是用于連接簇基至伯胺的有用 試劑），和SATA(N-班巧酷亞胺基-S-乙酷基硫代乙酸醋；SATA對胺有反應性并增加了受保護 的琉基基團）。
[0122] 為了形成共價鍵，可W使用多種活性簇基(例如醋）作為化學反應基團，其中徑基 部分在修飾膚所需要的水平是生理上可接受的。具體的試劑包括N-徑基班巧酷亞胺(NHS)、 N-徑基-硫代班巧酷亞胺(硫代-NHS)、馬來酷亞胺-苯甲酯基-班巧酷亞胺(MBS)、γ-馬來酷 亞胺-下酷氧基班巧酷亞胺醋(GMBS)、馬來酷亞胺基丙酸(MPA)、馬來酷亞胺己酸(MHA)和馬 來酷亞胺基^^一燒酸(MUA)。
[0123] 伯胺是NHS醋的主要祀標。可進入的α-氨基酸存在于蛋白質的N-末端上，且賴氨酸 的ε-胺與NHS醋反應。當Ν服醋與伯胺偶聯反應釋放Ν-徑基班巧酷亞胺時，形成酷胺鍵。含有 反應基團的運些班巧酷亞胺在本文中被稱為班巧酷亞胺基團。在本發明的某些實施方案 中，蛋白質上的官能團將是硫醇基，化學反應基團將是含馬來酷亞胺的基團，如Τ-馬來酷 亞胺-下酷胺(GMBA或ΜΡΑ)。運種含馬來酷亞胺的基團在本文中稱為馬來酷亞胺(maleido) 基團。
[0124] 當反應混合物的抑為6.5-7.4時，馬來酷亞胺基團對膚上的琉基基團最有選擇性。 在抑7.0時，具有琉基(例如，蛋白質（如血清白蛋白或IgG)上的硫醇基團）的馬來酷亞胺基 團的反應速率比胺快1000倍。因此，在馬來酷亞胺基和琉基之間可W形成穩定的硫酸鍵。
[0125] 在其它實施方案中，接頭包括至少一個氨基酸(例如至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、 25、40或50個氨基酸的膚）。在某些實施方案中，接頭是單個氨基酸(例如，任何天然存在的 氨基酸如切S)。在其它實施方案中，可W使用富含甘氨酸的膚，如在美國專利號7,271，149 所述的膚。在其它實施方案中，可W使用富含絲氨酸的膚接頭，如美國專利號5,525,491所 述。在一些情況下，接頭可W是單個氨基酸(例如，任何氨基酸，如Gly或Cys)。
[01%]適合的接頭的實例是班巧酸、Lys、Glu和Asp,或諸如Gly-Lys的二膚。當接頭是班 巧酸時，其的一個簇基可與氨基酸殘基的氨基形成酷胺鍵，而其另一個簇基可W例如與膚 或取代基的氨基形成酷胺鍵。當接頭是Lys、Glu或Asp時，其簇基可與氨基酸殘基的氨基形 成酷胺鍵，而其氨基可例如與取代基的簇基形成酷胺鍵。當將Lys用作接頭時，另一接頭可 W在Lys的ε-氨基和取代基之間插入另一個接頭。在一個具體的實施方案中，另一接頭是班 巧酸，其例如與Lys的ε-氨基和取代基中存在的氨基形成酷胺鍵。在一個實施方案中，另一 接頭是Glu或Asp(例如，其與Lys的ε-氨基形成酷胺鍵，與存在于取代基的簇基形成另一酷 胺鍵），即取代基是妒-酷化賴氨酸殘基。
[0127] IV.多核巧酸、載體、宿主細胞和重組方法 [012引i.多核巧酸
[0129] 本發明的特征在于編碼本發明的一種或多種(例如1、2、3或4種或更多種)化合物 (例如抗TM4SF1抗體，如8G4)或其片段或部分的多核巧酸。可使用標準的重組技術獲得編碼 本發明的一種或多種化合物的多核巧酸序列。例如，可W通過聚合酶鏈式反應(PCR)來制備 包括結合結構域的化合物的cDNA，該結合結構域在包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或其部分 的表位特異性結合多膚(例如8G4)且其包括一個或多個(例如1、2、3或4個或更多個)克隆位 點(例如EcoRV克隆位點）。
[0130] ii.載體
[0131] 本發明的特征在于包括本發明的一種或多種(例如1、2、3或4種或更多種)化合物 的載體。例如，可W分離本發明的多核巧酸并將其插入到用于進一步克隆(擴增DNA)或用于 表達編碼的多膚化合物的可復制的載體中。例如，在化合物是抗TM4SF1抗體的情況下，可W 將多核巧酸克隆到地luescript質粒中和將DNA亞克隆入化-編碼質粒如pFUSE-hIgGl-Fcl (InvivoGen)之前檢查的序列中。許多載體是可用的。載體的選擇部分取決于要使用的宿主 細胞。每個載體含有多種成分，運取決于其功能(擴增或表達異源多核巧酸，或二者兼之)及 其與它駐留的具體宿主細胞的相容性。載體成分通常包括但不限于:復制起點、選擇標記基 因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入和轉錄終止序列。
[0132] 在一般情況下，含有來自與宿主細胞相容的物種的復制子和控制序列的質粒載體 與運些宿主結合使用。載體通常攜帶復制位點，W及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標 記序列。例如，大腸桿菌通常使用來自大腸桿菌物種的質粒地R322轉化。地R322含有編碼抗 氨節青霉素(Amp)和四環素(Tet)的基因，由此提供用于識別轉化細胞的輕松手段。地R322、 其衍生物或其它微生物質粒或隧菌體還可包含或經修飾而包含可被微生物使用用于表達 內源蛋白的啟動子。用于表達特定抗體的PBR322衍生物的實例詳細描述于Cader等（美國 專利號5,648,237)。
[0133] 另外，含有復制子和與宿主微生物相容的控制序列的隧菌體載體可用作與運些宿 主有關的轉化載體。例如，隧菌體如AGEM-11?可用于制備重組載體，其可用于轉化易感宿主 細胞如大腸桿菌LE392。
[0134] 本發明的表達載體可包含兩個或更多個編碼每種多膚成分的啟動子-順反子對。 啟動子是非翻譯調控序列，其位于調節其表達的順反子的上游（5'）。原核啟動子通常分成 兩類，即誘導型的和組成型。誘導型啟動子是運樣的啟動子，即響應培養條件的變化在其控 制下啟動順反子轉錄水平的增加，培養條件的變化例如存在或不存在營養物或溫度變化。
[0135] 被多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子是眾所周知的。通過經由限制性酶切從源 DNA中除去啟動子并將分離的啟動子序列插入本發明的載體，選擇的啟動子可W可操作地 連接編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA。天然啟動子序列和許多異源啟動子均可用于指導祀基 因的擴增和/或表達。在一些實施方案中，利用異源啟動子，因為相比于天然祀多膚啟動子， 它們通常容許更大的轉錄和更高產量的被表達的祀基因。
[0136] 適用于原核宿主的啟動子包括陸oA啟動子、β-galactamase和乳糖啟動子系統、色 氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌中發揮功能的其它 啟動子(如其它已知的細菌或隧菌體啟動子)也是適合的。它們的核巧酸序列已經公開，由 此使得本領域技術人員使用接頭或者適配子將其連接到編碼祀輕鏈和重鏈的順反子 (Siebenlist等，Cell 20:269，1980)，W提供任何所需的限制性位點。
[0137] iii.宿主細胞
[0138] 本發明的特征在于包括本發明的一種或多種載體的宿主細胞，例如原核來源(例 如，大腸桿菌細胞)或真核來源(通常是哺乳動物(例如人廝靜脈ECXHUVEC))的宿主細胞，還 包括真菌（如酵母）、昆蟲（例如果蛹S2細胞）、植物W及來自其它多細胞生物體的有核細 胞）。在一些實施方案中，可W使用常規的篩選方法例如Zeocin篩選制備穩定的克隆。
[0139] a.原核宿主細胞
[0140] 適用于表達本發明的化合物（例如抗TM4SF1抗體）的原核宿主細胞包括古細菌和 真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物。有用的細菌的實例包括：埃希氏菌屬 化scherichia)(例如大腸桿菌化.coli ))、芽抱桿菌屬（Bacilli )(例如，枯草桿菌 (B. subtilis))、腸桿菌巧nterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas species)(例如綠脈 桿菌（P . aeruginosa))、鼠傷寒沙 口氏菌（Salmonel la typhimurium)、沙雷氏菌屬 (Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬化lebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬 (化igella)、根瘤菌（lihizobia)、透明顫菌（Vitreoscilla)或副球菌屬（Paracoccus)。在一 個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，大腸桿菌細胞作為本發明的宿主 使用。大腸桿菌菌株的實例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology, 第2卷（Washington,D.C.:Ame;rican Society for Microbiology,1987),第1190-1219頁； ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 Δ扣uA( Δ tonA)ptr31ac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)de評41kanR的菌株33D3(美國專利號5,639,635)。其它菌株及其衍生 物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)，大腸桿菌B，大腸桿菌λ1776(ATCC 31，537)和大腸桿 菌RV308(ATCC 31,608)也是合適的。運些實例是說明性的而不是限制性的。用于構建具有 限定基因型的任何上述細菌的衍生物的方法在本領域中是已知的，并且描述于例如Bass 等，Proteins 8:309-314(1990)。一般需要考慮在細菌細胞中復制子的可復制性來選擇適 當的細菌。例如，當公知的質粒如地R322、pBR325、pACYC177或地M10用于提供復制子時，大 腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia)或沙口氏菌屬物種可適于作為宿主使用。通常，宿主細胞應 當分泌最小量的蛋白水解酶，可W期望地將額外的蛋白酶抑制劑滲入在細胞培養中。
[0141] b.真核宿主細胞
[0142] 載體成分通常包括但不限于一種或多種下列物質:信號序列、復制起點、一種或多 種標記物基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。
[0143] 用于真核宿主細胞中的本發明的載體可含有信號序列或在成熟蛋白或目的多膚 的N-末端具有特定切割位點的其它多膚。選擇的異源信號序列可W是被宿主細胞識別并加 工（即通過信號膚酶切除）的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列W及病 毒分泌前導序列例如單純瘤疹病毒曲信號是可用的。運種前體區的DNA在讀碼框中被連接 到編碼多膚的DNA。
[0144] 通常，哺乳動物表達載體不需要復制元件的起點。例如，通常可使用SV40起點，但 僅僅是因為它含有早期啟動子。
[0145] 表達和克隆載體可包含選擇基因，也被稱為可選擇的標記物。典型的選擇基因編 碼W下的蛋白：（a)賦予抗生素或其它毒素例如氨節青霉素、新霉素、甲氨蝶嶺或四環素 W 抗性，（b)相關的情況下，補足營養缺陷，或(C)提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養物。
[0146] 篩選方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉化的那 些細胞產生賦予藥物抗性的蛋白，因而幸免于篩選方案。此類顯性選擇的實例使用新霉素、 霉酪酸和潮霉素藥物。
[0147] 用于哺乳動物細胞的適合的選擇標記物的另一個例子是能夠鑒定有能力攝取編 碼本發明的化合物(例如抗TM4SF1抗體，如8G4)的核酸的那些，諸如DHFR、胸巧激酶、金屬硫 蛋白-I和-II，優選靈長類金屬硫蛋白基因、腺巧脫氨酶、鳥氨酸脫簇酶等。
[0148] 例如，用DHFR選擇基因轉化的細胞首先通過將所有轉化子在含有DHFR的競爭性括 抗劑即甲氨蝶嶺(Mtx)的培養基中培養來鑒定。采用野生型DHF則寸，適當的宿主細胞是缺乏 DHFR活性(例如，ATCC CRk9096)的中國倉鼠卵巢(C冊)細胞系。
[0149] 可選地，用編碼本發明化合物、野生型DHFR蛋白和另一可選擇的標記物如氨基糖 巧3'-憐酸轉移酶(ΑΡΗ)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生 型宿主)可通過在含有針對可選擇的標記物的選擇試劑的培養基中的細胞生長來選擇，可 選擇的標記物如氨基糖巧抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。參見例如美國專利號4， 965,199。
[0150] 編碼化合物(例如抗TM4SF1抗體，如8G4)的高等真核生物的DNA的轉錄可通過將增 強子序列插入載體來提高。現已知曉來自哺乳動物基因（例如，珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋 白、α-胎蛋白和膜島素基因）的許多增強子序列。此外，人們可W使用來自真核細胞病毒的 增強子。實例包括在復制起點最近側的SV40增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子 增強子、在復制起點的最近側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。可W將增強子在化合物的編 碼序列的位置5'或3'處接合到載體，只要實現增強，但通常位于從啟動子的位點5'。
[0151] 表達和克隆載體通常包含被宿主生物體識別并可操作地連接到編碼化合物(例如 抗TM4SF1抗體，如8G4)的核酸序列的啟動子。真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的 真核基因具有位于從轉錄起始位點的約25至30個堿基上游的富AT區域。發現從許多基因的 轉錄起始的70至80個堿基上游的另一個序列是CNCAAT區，其中N可W是任何核巧酸。大多數 真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是聚A尾添加到編碼序列的3'端的信號。所有運些序 列都適合插入真核表達載體中。
[0152] 編碼化合物（如抗TM4SF1抗體，如8G4)的載體在哺乳動物宿主細胞中的轉錄受到 例如從病毒基因組獲得的啟動子、來自異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球 蛋白啟動子、或來自熱激啟動子的控制，病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（如腺病毒 2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40 (SV40)，條件是此類啟動子與宿主細胞系統相容。
[0153] SV40病毒的早期和晚期啟動子作為還包含SV40病毒復制起點的SV40限制性片段 可方便地得到。人巨細胞病毒的極早期啟動子作為化ndlll邱良制性片段方便地獲得。在哺 乳動物宿主中使用牛乳頭瘤病毒作為載體表達DNA的系統在美國專利號4,419,446中公開。 在美國專利號4,601,978中描述了該系統的修改。可替代地，勞氏肉瘤病毒長末端重復序列 可被用作啟動子。
[0154] 在真核宿主細胞中使用的表達載體通常還含有對于終止轉錄和穩定mRNA所需的 序列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶爾的3'、非翻譯區獲得。運些區域 包含在編碼TSP-1多膚的mRNA非翻譯部分中轉錄為聚腺巧酸化片段的核巧酸區段。一種有 用的轉錄終止組件是牛生長激素聚腺巧酸化區（參見例如W0 94/11026和本文公開的表達 載體)。
[0155] 在本文描述的在載體中克隆或表達DNA的適合的宿主細胞包括本文描述的高等真 核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養基(組織培養基）中的繁殖已經成為 常規流程。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCC C化 1651);人胚腎系（ 293或293細胞亞克隆用于在懸浮培養中生長，Graham等， J. Gen. Viro 1.36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC (XL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (C冊，Urlaub等，Proc.化tl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))，例女肪冊-K1 細胞；小鼠睪丸支 持細胞（TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞（CV1 ATCC (XL 70);非 洲綠猴腎細胞（VER0-76，ATCC C^-1587);人宮頸癌細胞化化A，ATCC (XL 2);犬腎細胞 (MDCK，ATCC (XL 34);水牛大鼠肝細胞（B化 3A，ATCC 邸L 1442);人肺細胞(W138，ATCC CCL 75);人肝細胞化ep G2,皿8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC C化51);TRI細胞 (Ma化er等，Annals N. Y.Acad. Sci . 383:44-68( 1982)) ;MRC 5細胞;FS4細胞；和人肝細胞瘤 系化巧G2)。
[0156] iv.重組方法
[0157] 本發明的特征還在于生產本發明的一種或多種化合物（例如抗TM4SF1抗體，如 8G4)的方法，由此可W在培養基中培養宿主細胞，W及可W從宿主細胞或培養基(例如使用 蛋白A瓊脂糖的無血清條件培養基）中回收（例如，純化)本發明的化合物(例如抗TM4SF1抗 體，如8G4)。
[0158] 用于生產本發明的化合物（例如抗TM4SF1抗體，如8G4)的宿主細胞可W在多種培 養基中培養。市售的培養基適于培養宿主細胞，諸如化m's FlO(Sigma)、最小必需培養基 ((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Du化ecco's改良Eagle's培養基（（DMEM)，Sigma)。此 夕hHam等，Meth.Enz. 58:44( 1979)、Barnes等，Anal.Biochem. 102:255( 1980)、美國專利號 4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5，122,469、胖0 90/03430、胖0 87/00195或 美國專利Re. 30,985中描述的任何培養基可W用作宿主細胞的培養基。任何運些培養基可 W根據需要補充有激素和/或其它生長因子(諸如膜島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽 (諸如氯化鋼、巧、儀和憐酸鹽）、緩沖劑(諸如肥PES)、核巧酸(諸如腺巧和胸巧）、抗生素(諸 如GENTAMYCIN?藥物）、微量元素(定義為通常W終濃度在微摩爾范圍存在的無機化合物)和 葡萄糖或等效能源。也可W包括本領域技術人員已知的適當濃度的任何其它必需補充。培 養條件如溫度、抑等是與預先選擇用于表達的宿主細胞一起使用的那些，運對普通技術人 員將是顯而易見的。
[0159] 可W采用本領域中已知的標準的蛋白質純化方法。W下程序是示例性的適合的純 化程序:免疫親和分饋或離子交換柱，乙醇沉淀，反相HPLC，硅膠或陽離子交換樹脂如DEAE 層析，聚焦層析，SDS-PAGE，疏水相互作用柱化1C)，硫酸錠沉淀，和使用例如葡聚糖G-75的 凝膠過濾。
[0160] 在一個實施方案中，當化合物是抗體時，蛋白A可固定在固相上并用于本發明的抗 體(例如8G4)的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Sta地ylococcus aureus)的 41-W)a細胞壁蛋白，它W高親和力結合抗體的化區化indmark等J. Immunol .Meth.62:1-13, 1983)。固定蛋白A的固相優選為含有玻璃或石英表面的柱，更優選可控孔玻璃柱或娃酸柱。 在一些應用中，柱已涂覆有試劑如甘油，W試圖防止污染物的非特異性粘附。
[0161] 作為純化的第一步，將源自上述的細胞培養物的制劑施加到固定蛋白A的固相，W 允許將目的抗TM4SF1抗體特異性結合至蛋白A。然后洗涂固相W除去非特異性結合于該固 相的污染物。通過洗脫可W將目的抗TM4SF1抗體從固相回收到含有離液劑或中性洗涂劑的 溶液中。示例性離液劑包括但不限于:脈、鹽酸脈、高氯酸裡、組氨酸和精氨酸。示例性溫和 洗涂劑包括但不限于:吐溫(例如吐溫20)、化iton(例如化iton X-100)、NP-40(壬基苯氧基 聚乙氧基乙醇）、諾乃洗涂劑P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）和十二烷基硫酸鋼（SDS)。從 柱(例如mAbSure柱)洗脫后將抗TM4SF1抗體稀釋為含有離液劑或中性洗涂劑的溶液維持抗 TM4SF1抗體洗脫后的穩定性。
[0162] 在其它實施方案中，本發明的經表達的多組氨酸標記化合物(例如抗TM4SF1抗體） 可W被純化，例如通過如下的Ni2+馨合親和層析。可W從Rupeパ等(Nature . 362:175-179, 1993)所述的重組病毒感染的S2細胞制備提取物。簡言之，將S2細胞洗涂，再懸浮在超聲處 理緩沖液（25血肥陽SpH值7.9;12.5mM氯化儀;0.1mMEDTA;10%甘油；0.1%NP-40;0.4M KC1)中，并在冰上超聲處理兩次，20秒。通過離屯、澄清超聲處理物，將上清液在加樣緩沖液 (50mM憐酸鹽;300mM化Cl; 10%甘油抑7.8)中稀釋50倍，并通過ο. 45皿的過濾器過濾。將 Ni2+-NTA瓊脂糖柱(可購自Qiagen)用5血的床體積制備，用25mL水洗涂，并用25血加樣緩沖 液平衡。將過濾的細胞提取物W每分鐘〇.5mL加載至柱上。用加樣緩沖液洗涂柱至基線A280， 在該點開始級分收集。接著，將柱用次級洗涂緩沖液(50mM憐酸鹽;300mM化C1; 10%甘油抑 6.0)洗涂，其洗脫非特異性結合的蛋白質。再次到達A280基線后，將柱用次級洗涂緩沖液中 的0-500mM咪挫梯度顯影。將一毫升級分(化e mL fractions川欠集并通過SDS-PAGE和銀染 色或用Ni2+-NTA-偶聯堿性憐酸酶(Qiagen)的Western印跡進行分析。將含有本發明的洗脫 的多組氨酸標記的化合物的級分匯集并針對加樣緩沖液進行透析。
[0163] 也可W用已知的層析技術包括例如蛋白A或蛋白G柱層析進行本發明的化合物(例 如抗TM4SF1抗體，如8G4)的純化。本發明的化合物(例如，抗TM4SF1抗體，例如8G4)可W通過 洗脫從該柱的固相回收到含有離液劑或中性洗涂劑的溶液。示例性離液劑和中性洗涂劑包 括但不限于:鹽酸脈、脈、高氯酸裡、精氨酸、組氨酸、SDS(十二烷基硫酸鋼）、吐溫、Triton和 NP-40,所有運些都是市售的。蛋白質印跡(例如，使用化合物的多克隆抗體或偶聯劑，例如 標簽)可用于確認產生了正確分子量的蛋白。
[0164] V.本發明的組合物
[0165] 本發明的任何化合物(例如抗TM4SF1抗體，如8G4)或編碼本發明的化合物的多核 巧酸，如上所述的那些，可W包含在組合物(例如藥物組合物）中。本發明的藥物組合物還可 W包括藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0166] 如本文所述，任何一種藥物組合物可被配制用于治療患有與病理性血管生成相關 的病癥(例如癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、胃癌和肺癌;肥胖癥;黃斑變 性;糖尿病性視網膜病;銀屑病;類風濕性關節炎;細胞免疫;和紅斑瘦瘡)的受試者(例如， 人)。
[0167] Vi.本發明的治療方法
[016引 在包含氨基酸序列NYTFASTEGQY1XDTSTW沈CTEPKHIVEWNVS(沈Q ID N0:1)的表位 處包括結合(例如特異性結合)多膚(例如TM4SF1)的結合域的本發明化合物(例如抗TM4SF1 抗體，如8G4)可用于治療性應用。因此，本發明的特征在于治療患有與病理性血管生成相關 的病癥(例如癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、胃癌和肺癌;肥胖癥;黃斑變 性;糖尿病性視網膜病;銀屑病;類風濕性關節炎;細胞免疫;和紅斑瘦瘡)的受試者的方法， 包括施用治療有效量的本發明化合物或其藥物組合物W治療所述受試者。化合物或藥物組 合物將W與優良醫學實踐一致的方式被配制、給藥和施用。根據本發明的治療可W單獨或 與另一治療聯合進行，并且可W在家里、醫生辦公室、診所、醫院的口診部或醫院提供。治療 任選在醫院開始，W便醫生可W密切觀察治療的效果并進行所需的任何調整，或者它可W 開始于口診基礎上。該療法的持續時間取決于所治療的疾病或病癥的類型、患者的年齡和 身體狀況、患者的疾病的階段和類型W及患者對治療的反應。此外，具有產生增殖或致病性 疾病的更大風險的人可接收治療，W抑制或延緩癥狀的發作。
[0169]在上述的方法中，本發明的化合物或其藥物組合物可W在結合包含氨基酸序列 NYTFASTEGQY1XDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(沈Q ID NO: 1)的表位之后，被內化（例如內吞）入 TM4SF1表達細胞(例如，腫瘤血管的內皮細胞或腫瘤細胞）。在一些實施方案中，化合物或其 藥物組合物可W被內化至TM4SF1表達細胞的細胞質中，并可能被內化至TM4SF1表達細胞的 細胞核中。因此，治療有效量的化合物或其藥物組合物可w導致病癥的癥狀的減輕、減少、 治療和/或停止，如在原發腫瘤尺寸的減小（例如，施用本發明的化合物或藥物組合物后受 試者的原發腫瘤大小相比對照處理減小了5 %、10 %、15 %、20%、25%、30 %、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%'89%'90%'91%'92%'93%'94%'95%'96%'97%'98%'99%'99.1%'99.2%、 99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或^上）；了]?45。1表達細胞(例如腫 瘤血管的內皮細胞或腫瘤細胞)的數目減少(例如，施用本發明的化合物或藥物組合物后受 試者中的TM4SF1表達細胞的數目相比對照處理減少了 5%、10%、15%、20 %、25 %、30 %、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、 99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或^上）；和/或了]?45尸1表 達細胞(例如腫瘤血管的內皮細胞或腫瘤細胞)的細胞調亡的增加(例如，施用本發明的化 合物或藥物組合物后受試者中TM4SF1表達細胞的細胞調亡相比對照處理誘導了5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%'98%'99%'99.1%'99.2%'99.3%'99.4%'99.5%'99.6%'99.7%'99.8%'99.9% 或W上）。運些癥狀和/或與病理性血管生成相關的病癥的其它癥狀和治療過程中它們的治 愈可通過例如物理檢查期間的醫師或本領域已知的其它測試和方法來測定。在一些實施方 案中，使用本發明的一種或多種化合物或藥物組合物的治療會導致受試者中病癥進展的缺 乏。在其它實施方案中，使用本發明一種或多種化合物或其藥物組合物的治療相對于常見 或常規療法(例如手術、放療、化療、免疫療法或激素治療)會導致受試者中病癥的進展減 緩。
[0170] i.施用方法
[0171] 根據本文所述的本發明的化合物和組合物(例如藥物組合物)可W配制為施用后 (例如，祀向遞送)立即釋放，或使用控釋或緩釋制劑施用后在任何預定的時間段釋放。W控 釋或緩釋制劑施用化合物或組合物是有利的，其中單獨或組合施用的化合物或組合物具有 W下優點：（i)窄的治療指數(例如，導致有害副作用或毒性反應的血漿濃度和導致治療效 果的血漿濃度之間的差異小;一般來說，治療指數TI被定義為中值致死劑量(LDso)與中值有 效劑量化Dso)之間的比例；（ii化釋放部位(例如胃腸道)的窄吸收窗;或（iii)短的生物半 衰期，因此需要在一天內頻繁給藥W維持治療水平。
[0172] 可W采取許多策略W獲得控釋或緩釋，其中釋放速率超過了藥物組合物的代謝速 率。例如，可W通過制劑參數和成分的適當選擇可W獲得控釋，包括例如適合的控釋組合物 和包衣。適合的制劑是本領域技術人員已知的。實例包括單個或多個單位片劑或膠囊組合 物、油溶液、混懸劑、乳劑、微囊劑、微球、納米顆粒、貼劑和脂質體。
[0173] 任選地，組合物可W配制為例如用于通過局部藥物遞送(例如，局部緩慢釋放或持 續釋放的藥物遞送系統)施用。緩釋制劑的適合例子包括含有本發明化合物的固體疏水性 聚合物的半透性基質，該基質是成形制品形式，例如薄膜或微膠囊。微膠囊可W例如通過凝 聚技術或通過界面聚合制備，例如分別在膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微 乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中的徑甲基纖維素或明膠微膠囊和聚（甲基丙締酸 甲醋)微膠囊。持續釋放基質的例子包括聚醋、水凝膠(例如，聚(2-?乙基-甲基丙締酸醋） 或聚（乙締醇））、聚交醋(美國專利號3,773,919)、1^-谷氨酸和丫-乙基寸-谷氨酸的共聚物、 不可降解的乙締-乙酸乙締醋、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT?(乳酸-乙醇 酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)和聚-0-(-)-3-?基下酸。雖然聚合物如乙 締-乙酸乙締醋和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠釋放分子超過100天，但是某些水凝膠釋放蛋 白質的時間較短。當包封的本發明的化合物(例如抗TM4SF1抗體）留在體內較長時間時，由 于暴露于37Γ的水分它們可能會變性或聚集，導致生物活性喪失和免疫原性可能的改變。 根據所設及的機制可W設計用于穩定的理性策略。例如，如果發現聚集機制是經由硫醇-二 硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾琉基殘基、由酸性溶液凍干、控制水分、采 用適當添加劑和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
[0174]任選地，該組合物可配制為例如用于通過病毒載體(例如腺病毒載體或痘病毒載 體)施用。重組腺病毒用作例如本發明的一種或多種化合物（例如抗TM4SF1抗體）的表達的 載體提供了幾個顯著優點。病毒可制備為高滴度，可W感染非復制細胞，在接觸祀細胞群之 后可W賦予來自體內的祀細胞的高效轉導。此外，腺病毒不把它們的DNA整合到宿主基因組 中。因此，它們作為表達載體使用具有降低誘導自發增殖性疾病的風險。在動物模型中，已 普遍發現腺病毒載體介導高水平表達大約一周。轉基因表達(本發明的核酸分子的表達)的 持續時間可W通過使用細胞或組織特異性啟動子來延長。腺病毒載體本身的分子工程學的 其它改進已產生更持久的轉基因表達和較少的炎癥。運可從在附加的早期腺病毒基因中含 有特定突變的所謂的"第二代"載體中和其中利用Cre-Lox策略刪除幾乎所有的病毒基因的 "裸"載體中看出化nge化ardt等，P;roc.化tl. Acad. Sci .USA 91:6196( 1994)and Kochanek 等，Proc. Natl. Acad. Sci . USA 93:5731 (1996)，均通過引用并入本文）。
[01巧]在國際專利申請公布WO 2006/040330和WO 2007/104792(均通過引用并入本文） 公開的腺病毒載體作為本發明的載體是特別有用的。運些腺病毒載體可W編碼和/或遞送 本發明的一種或多種化合物(例如抗TM4SF1抗體）W治療患有與血管生成相關的病理性病 癥(例如癌癥）的受試者。在一些實施方案中，一種或多種重組腺病毒載體可W施用給受試 者W表達多于一種類型的本發明化合物。除腺病毒載體外，可用于促進受試者(例如人）中 本發明的一種或多種化合物的遞送和/或表達的其它病毒載體和技術是本領域中已知的。 運些病毒包括痘病毒(例如，牛痘病毒和改良型痘苗病毒Ankara(MVA);參見例如美國專利 號4，603,112和5,762,938,每個均通過引用并入本文）、瘤疹病毒、披膜病毒(例如，委內瑞 拉馬腦炎病毒；參見例如美國專利號5,643,576，其通過引用并入本文）、小核糖核酸病毒 (例如脊髓灰質炎病毒;參見例如美國專利號5,639,649，其通過引用并入本文）、桿狀病毒， 和由Wattanapitayaku巧郵auer (Biomed. Pharmacother. 54:487 (2000)，其通過引用并入本 文)描述的其它病毒。
[0176] 本文所述的方法中使用的化合物和/或組合物可被配制為例如用于W下方式的施 用:肌肉內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、煩內、關節內、前列腺內、胸腔內、 氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、局部、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、泡內、粘膜、屯、包 內、廝帶內、眼內、口服、外用、局部、通過吸入、通過注射、通過輸注、通過連續輸注、通過直 接局部灌注浸浴祀細胞、通過導管、通過灌洗或W霜劑或脂質組合物。
[0177] 優選的施用方法可根據各種因素(例如，被施用的組合物的組分和所治療的病癥 的嚴重程度，例如癌癥的具體階段）而變化。適合于口服或鼻給藥的制劑可w由液體溶液 (例如溶解在稀釋劑(例如，水、鹽水或PEG-400)中的有效量的組合物）、膠囊劑、小袋劑、片 劑或凝膠劑組成，各含有預定量的該組合物或編碼本發明的組合物的多核巧酸。該藥物組 合物還可W是用于吸入到例如支氣管通道的氣霧劑制劑。氣霧劑制劑可W與加壓的藥學上 可接受的推進劑(例如，二氯二氣甲燒、丙烷或氮)混合。特別是，通過吸入施用可W通過使 用例如含有山梨糖醇；油酸醋或油酸的氣霧劑，例如與；氯氣甲燒、二氯氣甲燒、二氯四氣 乙燒或任何其它生物相容的推進劑氣體一起完成。
[0178] 受試者已被診斷為患有與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥)后，可施用本發 明的組合物。該組合物可W施用于受試者，例如診斷后15-30分鐘，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、12、20、24、48或72小時，2、3、5或7天，2、4、6或8周，3、4、6或9個月，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15或20年或更長的時間。可^向受試者施用單劑量(或，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更 多個劑量)的組合物，或可W向受試者每天、每周、每月或每年施用至少一種劑量(例如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量）。可W定義給藥期間（例如，1-4周，1-12個月，1-20年），或 者可W是用于受試者的壽命期。
[0179] 當治療與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥)時，可在癥狀發生或確切診斷之 前或診斷后或癥狀變得明顯后將本發明的組合物施用給受試者。因此，例如可W在診斷或 臨床確認癥狀后立即或診斷或癥狀檢測后2、4、6、10、15或24小時，2、3、5、或7天，2、4、6或8 周，或甚至3、4或6個月后施用組合物。
[0180] 該組合物可通過常規的滅菌技術滅菌，或可W無菌過濾。所得的水溶液可按原樣 包裝使用或凍干，凍干的制劑可W粉末形式施用或在施用前與無菌水性載體聯合施用。制 劑的抑通常為3-11，更優選5-9或6-8，最優選在7-8，如7-7.5。固體形式的所得組合物可W 多個單劑量單位包裝，各含有固定量的化合物和/或編碼一種或多種化合物的一種或多種 核酸，如果需要的話，如在片劑或膠囊的密封包裝中，或在能夠施用一個或多個劑量的適合 的干粉吸入器(DPI)中。
[0181] ii.劑量
[0182] 施用的劑量取決于待治療的受試者(例如，被治療受試者的年齡、體重、免疫系統 的能力W及一般健康狀況）、施用形式(例如，作為固體或液體）、施用方式(例如，通過注射、 吸入、干粉推進劑似及潛在地祀向的TM4SF1表達細胞(例如TC或EC，如新生血管的那些）。 此外，有關具體患者的藥物基因組學(基因型對藥代動力學、藥效學或治療的效能的影響） 信息可能影響使用的劑量。該組合物優選W運樣的量施用，即提供足夠水平的化合物(例如 抗TM4SF1抗體，如8G4)W在受試者中產生治療效果，而沒有由治療引起的過度不良生理作 用。
[0183] 基于受試者中與病理性血管生成相關的病癥(例如癌癥)的嚴重程度、發生或進展 (例如，基于病癥的一種或多種癥狀的嚴重程度），本發明的組合物(例如，包括本發明的一 種或多種化合物的組合物)的劑量或使用本發明的組合物的治療次數可W增加或者降低。
[0184] 本發明的化合物或藥物組合物可W約0.0 lmg/kg至約lOmg/kg，如約0.1 mg/kg至約 lOmg/kg，如約3mg/kg至約lOmg/kg的劑量施用至受試者。在一個實例中，向受試者施用化合 物或藥物組合物的至少一個劑量(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個劑量）。化合 物或組合物可被施用例如每周一次至屯次(例如，每周1、2、3、4、5、6或7次）。優選地，當將高 劑量(例如，約lOmg/kg)的化合物或藥物組合物施用給受試者時，總共提供單個劑量(即，一 個劑量）。優選地，當將低劑量(例如，約3mg/kg)的化合物或藥物組合物施用給受試者時，總 共提供多于一個劑量(例如2、3、4或5或更多個劑量），如4個劑量。
[0185] 此外，可向受試者施用(診斷前或后)本發明的組合物單次或多次(例如，施用一次 或施用兩次或更多次）。例如，特別易患與病理性血管生成相關的病癥如癌癥或具有該病癥 家族史的受試者可能需要多次治療來建立和/或維持治療效果。對于患有與病理性血管生 成相關的病癥的受試者的治療，通過本文描述的藥物組合物提供的治療的功效可通過例如 監測和/或測量原發腫瘤的大小、TM4SF1表達細胞數目和/或TM4SF1表達細胞(例如，腫瘤血 管的內皮細胞或腫瘤細胞）的細胞調亡來監測，由此原發腫瘤的大小和/或TM4SF1表達細胞 數目的減小或降低和/或E0C細胞調亡的誘導或增加指示有效的治療。隨后根據需要調整或 重復劑量W觸發響應的期望水平。
[0186] 本發明的單劑量的一種或多種組合物可W實現預診斷的治療效果。此外，診斷后 單劑量施用可W發揮本發明的治療作用。
[0187] 本發明的單劑量的一種或多種組合物也可用來實現治療具有與病理性血管生成 相關的病癥(例如癌癥）的受試者的治療。必要時，也可將多劑量(例如2、3、4、5或更多種劑 量)施用于運些受試者。
[018引iii.載體、賦形劑、稀釋劑
[0189] 可使用本領域已知的標準方法通過將具有所需純度的活性成分與任選的生理學 上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合來制備本發明的組合物的治療制劑(R e m i η g 10 η ' S Pharmaceutical Sciences，第20片反），ed. A.Gennaro,2000,Lippincott,Wil1iamsfe Wilkins, Philadelphia, PA)。可接受的載體包括鹽水，或緩沖液如憐酸鹽、巧樣酸鹽和其它 有機酸;抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（少于約10個殘基）多膚；蛋白質，如血清白蛋 白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙締化咯燒酬，氨基酸如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬 酷胺、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精;馨合劑 如抓TA;糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇;成鹽的抗衡離子如鋼;和/或非離子表面活性劑，如 TWEEN?、化 UR0NICS? 或巧G。
[0190] 任選地，但優選地制劑含有藥學上可接受的鹽，優選氯化鋼，優選W約生理濃度。 任選地，本發明的制劑可W含有藥學上可接受的防腐劑。在一些實施方案中，防腐劑濃度范 圍在0.1-2.0%，通常單位為v/v。適合的防腐劑包括制藥領域公知的那些。節醇、苯酪、間甲 酪、對徑基苯甲酸甲醋和對徑基苯甲酸丙醋是優選的防腐劑。任選地，本發明的制劑可W包 括濃度為0.005-0.02 %的藥學上可接受的表面活性劑。
[0191] VII.試劑盒
[0192] 本發明提供了包括本發明的組合物(例如藥物組合物）（例如，包括本發明的化合 物，如抗TM4SF1抗體，如8G4的組合物)的試劑盒。該試劑盒包括說明書，W允許臨床醫生(例 如，醫生或護±)將其中包含的組合物施用于受試者W治療與病理性血管生成相關的病癥 (例如癌癥)的說明書。
[0193] 優選地，試劑盒包括含有有效量的本發明的多膚或多核巧酸的單劑量藥物組合物 的多個包裝。任選地，施用藥物組合物所需的工具或設備可W包括在試劑盒中。例如，本發 明的試劑盒可W提供一個或多個預填充注射器，其含有有效量的疫苗、載體、穩定的Ξ聚體 或本發明的優化的病毒多膚。此外，該試劑盒還可w包括附加的組件，例如關于對具有與病 理性血管生成相關的病癥(例如癌癥）的受試者使用含有本發明的化合物或多核巧酸的藥 物組合物的施用方案的說明書。
[0194] 在不背離本發明的精神或范圍的情況下，可W對本發明的組合物、方法和試劑盒 作出各種修改和變化，運對本領域技術人員將是顯而易見的。因此，預期本發明涵蓋本發明 的運些修改和變型，只要它們落在所附權利要求及其等同的范圍之內。 實施例
[0195] 提供W下實施例用于說明，但不限制本發明要求保護的范圍。
[0196] 實施例1.材料和方法
[0197] 抗TM4SF1的單克隆抗體的制備
[0198] 將人廝靜脈內皮細胞(HUVEC)在EGM2-MV完全培養基化onza，Wa化ersville，MD)中 培養并在3-6通道使用。轉導冊VECW在約400個mRNA拷貝/細胞的水平（即天然冊VEC的約4 倍）過表達（0E)人 TM4SFl(Shih 等 Cancer Res. 69 :3272-3277,2009; Zukauskas 等 Angiogenesis. 14:345-354,2011)。將ΙΟ7個TM4SF1 OE細胞周的間隔向雌性六周齡的 Ba化-C小鼠腹膜內注射5次。TM4SF1結構如圖1所述。如下和圖2示出雜交瘤細胞的篩選步驟 和表位作圖策略。得到十五個穩定克隆。運些中，基于它們與TM4SF1的突變體形式的反應 性，十Ξ個識別的表位在胞外環2化CL2)中，兩個表位在胞內結構域中（圖2B-2E)。針對人 E化2的克隆均未與小鼠 TM4SF1反應，可能是因為小鼠和人TM4SF1之間顯著的結構差異（圖 沈）。
[0199] 免疫染色
[0200] 先前描述了實驗程序（Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009;Zukauskas等 Angiogenesis. 14: 345-354,2011)。簡言之，用4%多聚甲醒在25°C將細胞和組織切片固定 20分鐘，在PBS中洗涂3次，并在用一級抗體（來自Santa Cruz Biotechnology,San1:a Cruz, CA的8G4或山羊抗人CD144)隨后用二級驢抗小鼠的Alexa Fluor-488或-594標記抗體和鬼 筆環膚化ife Technologies,Carlsbad,CA)進行免疫細胞化學之前，用PBS/2%FBS封阻。對 于免疫-納米金-透射電子顯微鏡（TEM)，山羊抗小鼠的Alexa Fluor-488/納米金化b片段 (化noprobes ,Yaphank,NY)用作二級抗體。皿P標記的山羊抗小鼠抗體（Cell Si即aling, Danvers, ΜΑ)用于免疫印跡。亞細胞分離試劑盒購自Thermo Scientific (Logan, UT)。
[0201] MTT 測定
[0202] 皂草素偶聯的非特異性山羊化b(對照ADC)和皂草素偶聯的山羊抗小鼠 IgG Fab (實驗ADC)來自高級定位系統（San Diego，CA)，并按照制造商的說明進行實驗。簡言之，在 25°C分別用在10μ1 EGM2-MV完全培養基化onza，Wa化ersville，MD)中的200ng對照或實驗 ADC預溫育200ng 8G4或對照小鼠 IgG(mlgG) 1小時。將該混合物加入到在96孔平板上（1 X 1〇3細胞/孔在20化1 EGM2-MV;每組4個孔）涂板4小時的冊VEC。第5天進行MTT測定化ife Technologies)。所有實驗至少重復3次。計算活細胞％如下：活細胞（％ ) = (0化7qADC- OD7加 ADC)/(0D日7日實驗對照-OD7日日實驗對照）X 100。
[0203] 實施例2.抗TM4SF1抗體8G4
[0204] 圖2描述了雜交瘤的篩選和表位作圖策略。在針對ECL2上的表位的抗體（圖1A和 IB)中，8G4由于其高親和力化d~InM)被選定用于詳細的研究。
[0205]通過其生產雜交瘤，雜交瘤小鼠細胞系8G4-5-13-13F的方式，將8G4抗體保藏在美 國典型培養物保藏中屯、（American Type Cul ture Collection⑩，郵政信箱1 549 , Manassas, VA, 20108, USA( ATCC? ))；
[02(?] 細胞系ATCC⑩登記號保存日期
[0207] 雜交瘤小鼠
[0208] 細胞系8G4-5-13-13F PTA-120523 2013年7月31 日
[0209] 保藏按照國際承認用于專利程序的微生物保存的布達佩斯條約的規定及其細則 進行。運確保從保藏之日起維持存活保藏30年。該細胞系將按照布達佩斯條約的條款由 ATCC提供，并且受貝斯W色列女執事醫療中屯、（Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc.)和ATCC之間的協議的約束，其保證一旦相關的美國專利授權或任何美國或外國專利 申請特公開于公眾后，即向公眾永久和無限制地提供細胞系，W先到者為準，并保證細胞系 對于按照35US巧122和與此相關的委員條例(包括37 CFR§1.14,特別提及886 0G 638)授權 此項事宜的美國專利和商標委員確定的公眾的可用性。
[0210] 本申請的受讓人已同意，如果適合的條件下培養的保藏的細胞系丟失或損壞，貝U 在收到通知后將及時更換為相同細胞系的樣品。保藏的細胞系的可用性不應被解釋為根據 其專利法許可實施違背任何政府權力下授予的權利的本發明的實踐。
[0211] 實施例3.8G4和HUVEC中TM4SF1的亞細胞分布
[0212]用8G4染色冊VEC中的TM4SF1 (圖3A-3C)和間歇的培養的其它內皮細胞化C)，質膜 和nanopodia上的TM4SF1富集結構域(TMED)，W及核周和核沉積物。免疫細胞化學證實， TM4SF1通過化iton-XlOO提取;膜相關染色比核周和核沉積物受到更大影響（圖3D)dTM4SF1 被認為是由具有用于起始蛋白翻譯的潛在可選位點的2個轉錄變體產生的，生成了 28-、25- 和22-kD的亞型（Z址auskas等Angiogenesis. 14:345-354，2011)。免疫印跡表明，所有Ξ個 帶主要是通過0.05%的Triton X-100提取而不是0.01%的Triton X-100(圖3E)。用0.1% 化iton的附加提取洗脫了殘留的28-kD帶。28-kD帶（黑色箭頭）在可溶性核級分中是主要 的，并且只出現在細胞骨架和核染色質級分中（圖3F) d8G4并不與缺乏TM4SF1表達的細胞相 互作用（圖2C和2D)。
[0213] 冊VEC的亞細胞分離（圖3F)表明所有；個主要TM4SF1帶幾乎等于在膜級分的量； 所有Ξ種亞型也存在于可溶性細胞核級分。在細胞骨架和核染色質級分中僅發現28-kD的 TM4SF1。在可溶性細胞質級分未檢測到TM4SF1。
[0214] 實施例4.人胃腺癌血管EC中TM4SF1的分布
[0215] 先前的免疫組化研究已表明TM4SF1通過內襯于數種不同的人癌癥血管的EC而高 度表達(化ang等Int J Cancer. 116:243-252,2005)。用8G4的免疫巧光染色證實了運些結 果，并將其擴展到另外的人癌癥，胃腺癌（圖4A和4B)。透射電子顯微鏡(TEM)與免疫-納米金 染色表明質膜上間歇的TM邸灶（圖4C-4F)。管腔染色始終強于腔外染色（圖4D和4E)。癌癥血 管EC還用TM抓染色模式將瘦長的nanopodia擴展進入血管管腔高達30微米的距離（圖4G)。 運些擴展中的一些比典型的nanopodia更厚，含有膠原基質，并形成將血管管腔分割成更小 溝道的橋（圖4H)。類似的nanopodia狀突起已描述于小鼠癌癥血管中（Nagy等，Cancer Res. 55:360-368，1995)和表達VEGF-AIm的腺病毒誘導的小鼠中的血管中（SMh等，Cancer Res. 69:3272-3277，2009)。據我們所知，運是在人類癌癥EC中對運種突起的首次描述并具 有重要意義，因為它們為抗血管祀向提供了顯著增加的表面積。運類突起并未在內襯于相 鄰正常血管的EC中發現，并且用8G4的標記在運種血管中也弱得多（圖41和4J)。
[0216] 實施例5.HUVEC中8G4的內化
[0217] 為了確定8G4是否內化入表達TM4SF1的細胞中，在培養物中隨時間追蹤用8G4預標 記的冊VEC。流動細胞術顯示細胞表面信號的漸進性喪失：在2、4和24小時分別為20.8%、 52.2 %和95 % (圖5A)，運表明8G4被逐步內吞進入冊VEC。雖然一些運種喪失可W反映從細 胞表面的脫落，共焦-3D Z-堆疊顯微鏡證實8G4信號實質和漸進攝取到細胞質隔室（圖5B) 和細胞核（圖5C，帖6，白箭頭）。免疫印跡表明至4小時的核提取物中的8G4重鏈和輕鏈，運些 在24小時持續處于較低的水平（圖5D)。免疫-納米金-EM提供了 8G4內吞作用的進一步證據， 即鑒定核周細胞質、核孔和核本身內的納米金簇(圖5E和5F)d8G4內化在W非常低的水平表 達TM4SF1的細胞(例如成纖維細胞)中是檢測不到的。
[0218] 負責8G4抗體內化的路徑仍不清楚，但網格蛋白介導的機制是不可能的。TMED內化 的動力學比報道的網格蛋白依賴的內吞作用慢;從HUVEC表面損失50 %的TM4SF1需要至少4 小時（圖5A和5B)，而網格蛋白依賴的內吞作用通常只需要幾分鐘(McNiven. Trends Cel 1 81〇1.16:487-492,2006)。此外，網格蛋白抑制劑如？115如口不阻斷了]?45。1的攝取，了]\145。1胞 內結構域不包含網格蛋白基序化elly and Owen.Curr Opin Cell Biol.23:404-412， 2011)。最后，內化的8G4沉積物(直徑100-3(K)nm)過大，W至于不能被網格蛋白依賴的囊泡 (約80nm直徑)容納，并且在任何情況下，它們不與膜結合。運些最近的觀察還排除小窩攝取 8G4d8G4進入冊VEC核（圖5A-5F)是預料之外的。TM4SF1沒有傳統的核定位序列(Wright等 Protein Sci . 9:1594-1600，2000)。因此，很可能TM4SF-1相互作用蛋白如肌動蛋白和肌球 蛋白（Shih等化ncer Res. 69:3272-3277,2009; Z址auskas等Angiogenesis. 14: :345-354, 2011)可從負責（Spencer.Communicative&Integrative Biology.4:511-512,2011 ;Dzijak 等化oS 0肥.7: e30529，2012; Weber等NaUire. 431:325-329，2004)。
[0219] 實施例6.用抗體-藥物偶聯物(ADC)祀向TM4SF1
[0220] 因為推測與TM4SF1絡合的8G4被HUVEC有效地攝取，我們測試抗體-藥物偶聯物 (ADC)途徑是否會誘發EC殺傷。最近的研究表明ADC作為癌癥治療的方法的效用化uroda等 Prostate. 70:1286-1294，2010)。成功所需要的是祀分子在細胞表面上高度表達和該抗體 連接的毒素被有效內吞。TM4SF1和本發明的化合物如8G4抗TM4SF1抗體滿足運些標準。首 先，TM4SF1不僅在許多癌細胞表面上高度表達，而且在腫瘤血管EC的質膜上高度表達，預期 腫瘤血管EC的殺傷會中斷血流和分解血管屏障，從而提高ADC到腫瘤細胞的進入。其次，針 對TM4SF1的8G4抗體被EC和表達大量TM4SF1的其它細胞容易地內吞，為連接的毒素進入細 胞質和細胞核提供所得的細胞殺傷。總之，運些發現表明TM4SF1可W是用于ADC癌癥療法的 適合的血管和腫瘤細胞祀標，如使用本發明化合物的ADC癌癥治療，該化合物特異性結合包 含氨基酸序列NYTFASTEGQY化DTSTWSECTEPKHIVEWNVS(沈Q ID NO: 1)的表位，并且優選能夠 W與觀察到的8G4抗體相似或相同的方式被內化入細胞中。
[0221] 為了檢驗運一假設，皂草素，阻止蛋白質合成的單體RNA N-糖巧酶(Polito等Int J Biochem Cell Biol.41:1055-1061,2009)用作產生8G4 ADC的毒素。HUVEC攝取8G4/Exp- ADC(皂草素偶聯的山羊抗小鼠化b)，至第3天生長明顯的應力纖維（圖6B)，至第5天大量的 細胞被殺傷（圖6C)。僅暴露于8G4或小鼠 IgG的皿VEC或暴露于對照-ADC(皂草素偶聯的山羊 Fab)(圖6A)的冊VEC并沒有表現出可檢測的細胞毒性（圖6C)。類似的結果用高水平表達 TM4SF1的PC3前列腺癌細胞獲得，而不表達可檢測的TM4SF1的皿K293對8G4-皂草素絡合物 有抗性(圖7)。
[0222] 其它實施方案
[0223] 雖然已經結合其具體實施方案描述了本發明，但應理解能夠進行進一步修改，并 且本申請旨在覆蓋遵循本發明的一般原理的本發明的任何變化、使用或改編，包括與本發 明的運種背離，即其落入本發明所屬領域的已知或常規實踐中并且可W應用于上文所述的 基本特征。
[0224] 所有出版物、專利和專利申請都通過引用W其每一單獨的出版物、專利或專利申 請特別或單獨地通過引用全文并入本文的相同程度全部并入本文。運些專利申請特別包括 本申請要求受益的于2013年10月10日提交的美國臨時專利申請第61/88934號。
【主權項】
1. 一種化合物，其包含與多肽的表位特異性結合的結合結構域，其中所述表位包含氨 基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID N0:1)。2. 根據權利要求1所述的化合物，其中所述多肽是跨膜-4L6家族成員-I (TM4SF1)。3. 根據權利要求2所述的化合物，其中所述TM4SF1是人TM4SF1。4. 根據權利要求3所述的化合物，其中所述人TM4SF1是糖基化的人TM4SF1。5. 根據權利要求4所述的化合物，其中所述糖基化的人TM4SF1在殘基N129或殘基N159 處被糖基化。6. 根據權利要求5所述的化合物，其中所述糖基化的人TM4SF1在殘基N129和殘基N159 處被糖基化。7. 根據權利要求6所述的化合物，其中所述化合物能夠以IOnM或更小的Kd值特異性結 合所述糖基化的人TM4SF1。8. 根據權利要求7所述的化合物，其中所述Kd值為2nM或更小。9. 根據權利要求8所述的化合物，其中所述Kd值為500pM或更小。10. 根據權利要求1-9中任一項所述的化合物，其中所述結合結構域包含選自下組的氨 基酸序列：GFTFSSFAMS(SEQ ID NO:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID NO:3)、 RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID N0:4)、RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:5)、KVSNRFS(SEQ ID NO: 6)、和SQSTHVYT(SEQ ID N0:7)。11. 根據權利要求10所述的化合物，其中所述結合結構域包含選自以下的至少一個、至 少兩個或所有三個氨基酸序列：GFTFSSFAMS(SEQ ID N0:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)、和RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID N0:4)。12. 根據權利要求10所述的化合物，其中所述結合結構域包含選自以下的至少一個、至 少兩個或所有三個氨基酸序列：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID N0:5)、KVSNRFS(SEQ ID NO: 6)，和SQSTHVYT(序列ID N0:7)。13. 根據權利要求10所述的化合物，其中所述結合結構域包含以下六個氨基酸序列： GFTFSSFAMS(SEQ ID N0:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG(SEQ ID N0:3)、RGIYYGYDGYAMDY(SEQ ID N0:4)、RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID N0:5)、KVSNRFS(SEQ ID N0:6)、和SQSTHVYT(SEQ ID N0：7)〇14. 根據權利要求1-13中任一項所述的化合物，其中所述化合物是抗體。15. 根據權利要求14所述的化合物，其中所述抗體由雜交瘤小鼠細胞系8G4-5-13-13F (PTA-120523)產生。16. 根據權利要求1 4或1 5所述的化合物，其中所述抗體的重鏈包括與 EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKN TVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID N0:8)具有至少80%序列同 一性的氨基酸序列。17. 根據權利要求1 4或1 5所述的化合物，其中所述抗體的輕鏈包括與 AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK( SEQ ID NO: 9)具有至少80 % 序列同一性的氨基 酸序列。18. 根據權利要求1 4或1 5所述的化合物，其中所述抗體的重鏈包括與 EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGSIYIYYTDGVKGRFTISRDNAKN TVHLQMSSLRSEDTAMYYCARRGIYYGYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID N0:8)具有至少80%序列同 一性的氨基酸序列，且 所述抗體的輕鏈包括與 AVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYMQKPGQSPKVLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGIYFCSQSTHIPLAFGAGTKLELK(SEQ ID NO: 9)具有 至少80%序列同一性的氨基酸序列。19. 根據權利要求14-18中任一項所述的化合物，其中所述抗體是單克隆的、人源化的、 嵌合的或合成的。20. 根據權利要求14-19中任一項所述的化合物，其中所述抗體是抗體片段。21. 根據權利要求1-20中任一項所述的化合物，其中所述化合物還包含試劑。22. 根據權利要求21所述的化合物，其中所述試劑是治療劑或診斷劑。23. 根據權利要求22所述的化合物，其中所述治療劑是生物活性部分。24. 根據權利要求22所述的化合物，其中所述診斷劑是標記物。25. 根據權利要求23所述的化合物，其中所述生物活性部分選自：細胞毒素劑、化療劑、 蛋白質、肽、抗體、生長抑制劑和抗激素劑。26. 根據權利要求25所述的化合物，其中所述細胞毒素劑選自：核糖體失活蛋白、組蛋 白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、微管蛋白抑制劑、烷化劑、抗生素、抗腫瘤劑、抗增殖劑、抗代謝 物、拓撲異構酶I或II抑制劑、激素激動劑或拮抗劑、免疫調節劑、DNA小溝結合劑、和放射性 試劑。27. 根據權利要求26所述的化合物，其中所述核糖體失活蛋白是皂草素。28. 根據權利要求24所述的化合物，其中所述標記物是熒光標記物、生色標記物或放射 性標記物。29. 根據權利要求21-28中任一項所述的化合物，其中所述試劑直接偶聯至所述化合 物。30. 根據權利要求21-28中任一項所述的化合物，其中所述試劑通過接頭間接偶聯至所 述化合物。31. -種藥物組合物，其包含權利要求1-30中任一項所述的化合物。32. 根據權利要求31所述的藥物組合物，其還包含藥學上可接受的載體、賦形劑和/或 稀釋劑。33. 根據權利要求31或32所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物被配制為用于治療 受試者中與病理性血管生成相關的病癥。34. -種多核苷酸，其編碼權利要求1-30中任一項所述的化合物。35. -種載體，其包含權利要求34所述的多核苷酸。36. -種宿主細胞，其包含權利要求35所述的載體。37. 根據權利要求36所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。38. 根據權利要求36所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核細胞。39. -種生產權利要求1 -30中任一項所述的化合物的方法，所述方法包括在培養基中 培養權利要求36所述的宿主細胞。40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述方法還包括從所述宿主細胞或所述培養基 回收所述化合物。41. 一種治療患有與病理性血管生成相關的病癥的受試者的方法，其包括施用治療有 效量的權利要求1-23、25-27、29和30中任一項所述的化合物或其藥物組合物，從而治療所 述受試者。42. 根據權利要求41所述的方法，其中施用至所述受試者的所述化合物的劑量為約 0 · Olmg/kg/至約 10mg/kg。43. 根據權利要求42所述的方法，其中施用至所述受試者的所述化合物的劑量為約 0 · lmg/kg/至約 10mg/kg。44. 根據權利要求43所述的方法，其中施用至所述受試者的所述化合物的劑量為約 3mg/kg/至約 10mg/kg。45. 根據權利要求41-44中任一項所述的方法，其中所述與病理性血管生成相關的病癥 是癌癥。46. 根據權利要求45所述的方法，其中所述癌癥選自：乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結腸直腸 癌、肝癌、胃癌、皮膚癌、食道癌、腎癌、腦癌、甲狀腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌，睪丸癌、小 腸癌、唾液腺癌、和腎上腺癌。47. 根據權利要求41或42所述的方法，其中所述與病理性血管生成相關的病癥為肥胖 癥、黃斑變性、糖尿病性視網膜病、銀肩病、類風濕性關節炎、細胞免疫、動脈粥樣硬化或紅 斑痤瘡。48. 根據權利要求41-47中任一項所述的方法，其中所述化合物在結合包含氨基酸序列 NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID NO: 1)的所述表位之后能夠被內化至 TM4SF1表達細胞內。49. 根據權利要求48所述的方法，其中所述化合物被內化至所述TM4SF1表達細胞的細 胞質中。50. 根據權利要求48所述的方法，其中所述化合物被內化至所述TM4SF1表達細胞的細 胞核中。51. 根據權利要求48所述的方法，其中所述TM4SF1表達細胞是腫瘤血管內皮細胞或腫 瘤細胞。52. 根據權利要求41-51中任一項所述的方法，其中所述化合物或所述藥物組合物通過 肌肉內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸腔內、氣管 內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、外部、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、泡內、粘膜、心包內、臍 帶內、眼內、口服、外用、局部、通過吸入、通過注射、通過輸注、通過連續輸注、通過直接局部 灌注浸浴靶細胞、通過導管、通過灌洗、在霜劑或脂質組合物中施用。53. 根據權利要求52所述的方法，其中向所述受試者施用至少一個劑量的所述化合物 或所述藥物組合物。54. 根據權利要求53所述的方法，其中向所述受試者施用至少兩個劑量的所述化合物 或所述組合物。55. 根據權利要求53所述的方法，其中每周向所述受試者施用所述化合物或所述組合 物一次至七次。56. 根據權利要求55所述的方法，其中每四天向所述受試者施用所述化合物或所述組 合物一次。57. 根據權利要求41-55中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。58. -種檢測生物樣品中包含氨基酸序列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS(SEQ ID N0:1)的多肽的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供所述生物樣品和對照樣品； (b) 將所述生物樣品和所述對照樣品與權利要求1-22、24、或28-30中任一項所述的化 合物或其藥物組合物接觸;和 (c) 測定所述生物樣品中和所述對照樣品中存在的所述化合物與所述多肽的絡合物的 量。59. 根據權利要求58所述的方法，其中從疑似患有與病理性血管生成相關的病癥的受 試者獲得所述生物樣品。60. -種試劑盒，其包括： (a) 權利要求31-33中任一項所述的藥物組合物;和 (b) 用于將所述藥物組合物施用至受試者以治療與病理性血管生成相關的病癥的說明 書。
【文檔編號】C07K16/00GK105934252SQ201480060319
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年10月8日
【發明人】S-C·賈米內特, H·F·德沃拉克
【申請人】貝思以色列女會吏醫學中心公司