Il-18結合蛋白的制作方法

專利名稱：Il-18結合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及白細胞介素18(IL_18)結合蛋白，特別涉及它們在急性和慢性炎癥疾 病的預防和/或治療中的用途。
背景技術：
最早在1989年白細胞介素-18(IL-18)被描述為干擾素誘導因子(IGIF)，并 且是促炎癥細胞因子，除了具有誘導Y-干擾素的能力外，還具有多方面功能。這些生物 學性能包括NF- κ b的激活，Fas配體表達，CC和CXC趨化因子的誘導，感受態人免疫缺陷 病毒的增加的產生。由于IL-18有誘導T細胞和巨噬細胞中Y-干擾素產生的功能，它在 Thl-型免疫應答中和參與先天和后天免疫性中起著重要作用。IL-18就其結構和功能來說 涉及IL-I家族。有關IL-18結構，功能和生物學活性，參見，例如Dinarellc)，C.等(1998) J. Leukoc. Biol. 63 :658_654 ；Dinarello, C. A. (1999)Methods 19 :121_132 ；禾口 Dinarello， C. Α. (1999)J. Allergy Clin. Immunol. 103 11-24 ； (Mclnnes, I. B.等(2000)Immunology Today 21:312_315 ；Nakanishi，K.等(2001)Ann. Rev. Immunol 19 :423474。細胞內IL-18-原在內毒素-刺激的細胞中經胱天蛋白酶1 (Ghayur，Τ.等， (1997) Nature 386 619-623 ；Gu, Y.等，(1997) Science 275 :206_209)，在 Fas-L 或細菌 DNA刺激細胞中經胱天蛋白酶4，5和6蛋白酶解加工成18kDa活性形式(Tsutsui，H.等， (1999) Immunity 11 359-67 ；Ghayur, T.，沒有出版的 Observations)。IL-18-原還被其 他蛋白酶解加工，例如嗜中性白細胞蛋白酶3(Sugawara，S.等，(2001) J. Immunol.，167， 6568-6575)，胱天蛋白酶 3(Akita，K.等，(1997) J. Biol. Chem. 272，26595-26603)，和絲 氨酸蛋白酶彈性蛋白酶和組織蛋白酶(Gracie J.A.，等，(2003)Journal of Leukocyte Biology 73,213-224)。人和鼠IL-18沒有常規的前導序列，并且細胞成熟IL-18釋放的原 理還不十分清楚。IL-18的生物活性通過IL-18與由兩個亞基構成的異二聚體IL-18受體(IL-18R) 結合而介導α-亞基(IL-1R家族中的一員，也稱作IL-IR-相關蛋白_1或IL-IRrpl)和 β-亞基(也稱作IL-18R輔助蛋白，IL-18AP或AcPL)。IL_18Ra亞基直接結合IL-18，但 是不能信號傳導。亞基本身不結合IL-18，但是與α-亞基聯合形成信號轉導必需的高 親和性受體(Kd= 0.3nM) (Sims, J. Ε.，(2002) Current Opinlmmunol. 14 117-122)。通過 IL-18 α β復合體的IL-18信號傳導類似于IL-IR和Toll樣受體(TLR)系統。IL-18R信號 傳導利用信號傳導分子，例如MyD88，IRAK,TRAF6,并且產生和IL-I產生的相似的響應(例 如，NIK, IkB激酶，NF-kB，JNK和p38MAP激酶的激活)。介導IL-18生物活性對IL-18R α和信號傳導分子的需要已經分別使用IL-18Ra -亞基(Hoshino K.，等(1999) J. Immunol. 162 5041-5044 ；)，MyD88(AdachiO.，等(1998)Immunity 9 143-150)或 IRAK(Kanakaraj P.， (1999) J.Exp. Med. 189 1129-1138)敲除證實了。結合IL-18的抗體是本領域公知的。EP O 974 600公開了能中和IL-18的小鼠抗 體。抗IL-18人抗體在PCT公開WO 0158956中公開，這里引作參考。本發明提供了能以高 親合力結合IL-18，結合并中和IL-18的結合蛋白質的新的家族，人抗體，及其片段。

發明內容
發明概述本發明提供IL-18結合蛋白，特別是人IL-18的抗體，以及制備和使用這樣的蛋白 質的方法。本發明的一個方面是提供使用IL-18調諧子調節基因表達的方法。本發明的一個方面是提供包括能結合人IL-18的抗原結合結構域的結合蛋白質。 在一個實施方案中，抗原結合結構域包括至少一個包括選自下面的氨基酸序列的⑶R CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:42)，其中X1 是 S，N，H，R，或 Y;父2是丫，6，1 ，5，或C;父3是1，6，丫，0，5，￥，或1;父4是1，!1，1，￥，1，1^，或0;X5 是6，Y，S，N，或 H;X6是W，或者不存在；和S，G，或者不存在；CDR-H2. XfX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 43), 其中；X1 是 F，Y，H，S，或 V;&是1，或 F;X3 是 Y，S，或 W;X4 是 P，Y，或 S;父5是6，5，札或0;X6 是 D，或 G;&是5，1\6，或1 ;X8是E，T，I，或 N;X9 是 T，Y，N，I，X，或 H;Xio是R，Y，或S ;
Xll是Y，N，或S ；
Xl2是 S，P，A，或 V ；
Xl3是P，S，或D ；
X14是T，L，或S;
Xl5是F，K，或V;
Xl6是Q，S，或K ；和
X17是G，或者不存在；CDR-H3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11-X12-X13-X14-X15-Xl6-X17-Xl8 (SEQ ID NO 44)，其中；父1是￥，0』，5，或C;X2 是6，R，D，S，K，L，Y，或 A ；&是5，6，￥，或1 ;X4 是 G，S，Y，N，T，或 D;&是1，S，A，G，Y，或 T ；X6 是 Y，G，S，F，W，或 N;X7 是 P，S，F，Y，V，G，W，或 V;父8是丫，卩，0，卩，厘，I，或N;父9是1\1，0^』，卩，卩，或6;Xltl 是 F，D，Y，H，V，Y，或者不存在;X11是0，Y，F，L，或者不存在；X12是I，D，Y，或者不存在；X13是Y，或者不存在；X14是Y，或者不存在；X15是G，或者不存在；X16是M,或者不存在；X17是D，或者不存在；禾口X18是V，或者不存；CDR-L1. XfX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 45), 其中；X1 是 R，或 K ；X2 是 A，G，或 S ；X3 是 S ；X4 是 E，R，Q，或 H;&是5，1，1\或 N;X6 是 I，V，L，或 F;X7 是 S，G，L，N，或 R;父8和S，G，Y，R，N，H，或 D ；X9 是 N，G，Y，R，或 S;Xltl 是 L，Y，S，或 D ；X11 是 A，L，N，V，G，或 D;父12是六^4，1(，6，或者不存在;X13是K，T，N，或者不存在；X14是N，Y，T，或者不存在；X15是Y，L，或者不存在；X16是L，C，Y，或者不存在；禾口
乂17是六，0，或者不存在；CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:46)，其中X1 是1\ G，S，W，或 E ；父2是六，V，T，I，或L;X3 是 S，或 F;X4 是 T，I，N，S，R，或 Y;X5 是 R，或 L ；X6 是 A，Q，E，或 F ；和X7 是 T，或 S;和X1 是 Q，或 M ；X2 是 Q，H，或 Y ；X3 是 Y，N，G，S，或 R ；父4是隊！^，0，6，￥，1^，或1;X5是N，G，I，Y，S，Q，F，或E;X6 是 W，S，T，L，I，或 F ；X7 是 P，L，T，D，或 I ；父8是5^，(，1，I，或F;X9是I，T，S，或者不存在；和Xltl是T，或者不存在。優選地，抗原結合結構域包括至少一個包括選自由下面的殘基構成的組的氨基酸 序列的 CDR:SEQ ID NO. :6 的殘基 31-35 ;SEQ ID NO. :6 的殘基 50-66 ;SEQ ID NO. :6 的殘 基 99-110 ；SEQ ID NO. 7 的殘基 24-34 ；SEQ ID NO. 7 的殘基 50-56 ；SEQ ID N0. 7 的殘 S 89-98 ；SEQ ID NO. :8 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. :8 的殘基 52-67 ;SEQ ID NO. :8 的殘 基 100-110 ;SEQ ID NO. :9 的殘基 24-35 ;SEQ ID NO. :9 的殘基 21-27 ;SEQ ID NO. :9 的殘 基 90-98 ；SEQ ID N0. 10 的殘基 31-35 ； SEQ ID N0. 10 的殘基 50-65 ；SEQ ID N0. 10 的 殘基 98-107 ;SEQ ID NO. 11 的殘基 24-34 ;SEQ ID NO. 11 的殘基 50-56 ;SEQ ED NO. 11 的殘基 89-97 ；SEQ ED N0. 12 的殘基 31-37 ； SEQ ID N0. 12 的殘基 52-67 ；SEQ ID N0. 12 的殘基 100-108 ； SEQ ID N0. 13 的殘基 24-35 ； SEQ ID N0. 13 的殘基 51-57 ； SEQ ED N0. 13 的殘基 90-98 ;SEQ ID NO. 14 的殘基 31-35 ;SEQ ID NO. 14 的殘基 50-66 ;SEQ ID NO. ID NO. : 15 的殘基 24-40 ;SEQ ID NO. : 15 的殘基 56-62 ;SEQ ID NO. :15 的殘基95-103 ;SEQ ID NO. :16 的殘基31-37 ;SEQ ID NO. : 16 的殘基52-67 ;SEQ ID NO. 16 的殘基 100-109 ； SEQ ID NO. 17 的殘基 24-35 ； SEQ ID NO. 17 的殘基 51-57 ； SEQ ID NO. 17 的殘基 90-98 ； SEQID NO. 18 的殘基 31-35 ； SEQ ID N0. 18 的殘基 20-36 ； SEQ ID N0. 18 的殘基 99-108 ;SEQ ID NO. 19 的殘基 24-34 ;SEQ ID NO. 19 的殘基 50-56; SEQ ID N0. 19 的殘基89-97 ;SEQ ID NO. :20 的殘基31-35 ;SEQ ID NO. :20 的殘基52-67; SEQ ID N0. 20 的殘基 100-108 ；SEQ ID N0. 21 的殘基 24-35 ；SEQ ID N0. 21 的殘基 51-57 ；SEQ ID N0. 21 的殘基 90-98 ；SEQ ID N0. 22 的殘基 31-35 ；SEQ ID N0. 22 的殘S 50-66 ；SEQ ID NO. :22 的殘基99-116 ;SEQ ID NO. :23 的殘基 24-39 ;SEQ ID NO. :23 的 殘基 55-61 ;SEQ ID NO. :23 的殘基 94-102 ;SEQ ID NO. :24 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. 24 的殘基52-67 ;SEQ ID NO. :24 的殘基 100-109 ;SEQ ID NO. :25 的殘基24-35 ;SEQ ID NO.
25的殘基51-57 ;SEQ ID NO. 25 的殘基90-98 ；SEQ ID NO. :26 的殘基31-37 ;SEQ ID NO.
26的殘基 52-67 ；SEQ ID N0. 26 的殘基 100-109 ；SEQ ID N0. 27 的殘基 24-35 ；SEQ ID NO. :27 的殘基 51-57 ;SEQ ID NO. :27 的殘基90-98 ;SEQ ID NO. :28 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. 28 的殘基 52-67 ；SEQ ID N0. 28 的殘基 100-108 ；SEQ ID N0. 29 的殘基 24-35 ；SEQ ID NO. :29 的殘基 51-57 ;SEQ BD NO. :29 的殘基 90-98 ;SEQ ID NO. :30 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. :30 的殘基52-67 ;SEQ ID NO. :30 的殘基99-109 ;SEQ ID NO. :31 的殘基24-35 ;SEQ ID NO. :31 的殘基 51-57 ;SEQ ID NO. :31 的殘基 90-98 ;SEQ ID NO. :32 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. 32 的殘基 52-67 ；SEQ ID N0. 32 的殘基 100-109 ；SEQ ID N0. 33 的殘基 24-35 ； SEQ ID NO. :33 的殘基51-57 ;SEQ ID NO. :33 的殘基90-98 ;SEQ ID NO. 34 的殘基31-37 ； SEQ ID N0. 34 的殘基 52-67 ；SEQ ID N0. 34 的殘基 100-108 ；SEQ ID N0. 35 的殘基 24-35 ；SEQ ID NO. :35 的殘基51-57 ;SEQ ID NO. :35 的殘基90-98 ;SEQ ID NO. :36 的殘基 31-35 ；SEQ ID NO. :36 的殘基 50-66 ;SEQ ID NO. :36 的殘基 99-116 ;SEQ ID NO. :37 的殘 S 24-39 ；SEQ ID NO. :37 的殘基 55-61 ；SEQ ID NO. :37 的殘基 94-102 ;SEQ ID NO. :38 的 殘基 31-35 ;SEQ ID NO. :38 的殘基 50-66 ;SEQID NO. :38 的殘基 99-108 ;SEQ ID NO. 39 的殘基 24-35 ;SEQ ID NO. :39 的殘基 51-57 ;SEQ ID NO. :39 的殘基 90-98 ;SEQID NO. 40 的殘基 31-37 ;SEQ ID NO. :40 的殘基 52-67 ;SEQ ID NO. :40 的殘基 97-109 ;SEQ ID NO. 41 的殘基 24-40 ;SEQ ID NO. :41 的殘基 56-62 ;SEQ ID NO. :41 的殘基 95-103。優選地， 結合蛋白包括至少3個⑶Rs。在另一個優選實施方案中，結合蛋白包括一個Vh結構域。優選地，Vh結構域包括選 自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQID NO 18 ；SEQ ID NO 20 ；SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ；SEQ ID NO 34 ；SEQ ID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；和SEQ ID NO :40。在另一個實施方案中，結合蛋白包括一個Vl結構域。優選地， Vl結構域包括選自下面的氨基酸序列=SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SET M NO 29 ；SEQID NO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQID NO 39 ；禾口 SEQID NO :41。在一個優選的實施方案中，結合蛋白包括一個Vh和一個\結構域。更優選地，結 合蛋白包括包括選自下面的氨基酸序列的Vh結構域SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQ ID NO 18 ；SEQ ID NO 20 ；SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ； SEQID NO 34 ；SEQ ID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；和SEQ ID NO :40和包括選自下面的氨基酸序 列的 \ 結構域SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ IDNO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQ ID NO :39 JPSEQ ID NO :41。最優選地，結合蛋白包括包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的Vl結構域和包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Vh結構域。在另一個實施方案中，結合蛋白進一步包括選自人IgM恒定區；人IgGl恒定區； 人IgG2恒定區；人IgG3恒定區；人IgG4恒定區；人IgE恒定區和人IgA恒定區的重鏈免 疫球蛋白恒定區。優選地，重鏈免疫球蛋白恒定區是人IgGl恒定區。優選地，重鏈恒定區 中至少一個氨基酸殘基被置換，使得抗體的效應子功能被改變。更優選地，人IgGl恒定區 包括選自SEQ ID NO. :2，和SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。在另一個實施方案中，結合蛋白進一步包括選自人IgK恒定區，和人IgX恒定區 的輕鏈免疫球蛋白恒定區。優選地，人IgK恒定區包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4，人化入 恒定區包括氨基酸序列SEQ ID NO. :5ο在另一個實施方案中，結合蛋白包括具有選自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的Ig重鏈恒定區；具有選自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG輕 鏈恒定區；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重鏈可變區；和具有SEQ ID NO 7的氨基 酸序列的Ig輕鏈可變區。在另一個實施方案中，結合蛋白包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重鏈恒 定區；具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG輕鏈恒定區；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列 的Ig重鏈可變區；和具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig輕鏈可變區。在另一個實施方案中，結合選自免疫球蛋白分子或者本領域公知的其功能變體， 所述變體保持結合蛋白的特征結合性質。具體免疫球蛋白實施方案的例子包括但不限于 scFv ；單克隆抗體；人抗體；嵌合抗體；人源化抗體；單結構域抗體；Fab片段；Fab'片段； F(ab' )2;Fv;二硫鍵連接的Fv，和雙特異性或雙重特異性抗體。最優選地，結合蛋白是人 抗體。本發明的另一方面提供了中和結合蛋白，其包括上文公開的結合蛋白的任一種， 其中中和結合蛋白能中和IL-18。優選地，中和結合蛋白能結合中和人IL-18原；成熟-人 IL-18或截短的-人IL-18中的任何一種。在另一個實施方案中，中和結合蛋白減小了 IL-18結合其受體的能力。優選地，中和結合蛋白減小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截 短的-人IL-18結合其受體的能力。在另一個實施方案中，中和結合蛋白能抑制選自下面的IL-18生物活性中的一 種或幾種Thl 調節；Th2 調節(Nakanishi K.，等(2001)Cytokine and Growth Factor Rev. 12 53-72) ；Nk調節；嗜中性白細胞調節；單核細胞-巨噬細胞系調節；嗜中性白細胞 調節；e嗜酸性細胞調節；B-細胞調節；細胞因子調節；趨化因子調節；粘著分子調節；和細 胞募集調節。在優選的實施方案中，中和結合蛋白具有選自下面的解離常數(Kd)最大大約 IO-7M ；最大大約ΙΟ-、；最大大約ΙΟ-、；最大大約10_10M ；最大大約IiT11M ；最大大約ICT12M ； 最大大約1(Γ13Μ。在另一個實施方案中，中和結合蛋白具有選自下面的生成速率至少大約 IO2IT1S-1 ；至少大約IO3IT1S-1 ；至少大約IO4MY1 ；至少大約IO5MY1 ；至少大約IO6MW在另一個實施方案中，中和結合蛋白具有選自下面的離解速率最大大約ΙΟ、—1 ； 最大大約ΙΟ、—1 ；最大大約ΙΟ、—1 ；最大大約KTfV1。本發明的另一方面提供包括上面公開的結合蛋白中任何一種的標記結合蛋白，其中所述結合蛋白與可檢測標記物結合。優選地，可檢測標記物選自放射性標記物，酶，熒光 標記物，發光標記物，生物發光標記物，磁性標記物和生物素。更優選地，放射性標記物是 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111In, 125I，131I，177Lu, 166Ho,或 153Sm。本發明的另一方面提供一種包括上面公開的結合蛋白中任何一種的結合蛋白，其 中所述結合蛋白與治療性或細胞毒性物質結合。優選地，所述治療性或細胞毒性物質選自 抗_代謝物；烷基化試劑；抗生素；生長因子；細胞因子；抗_血管生成藥物；抗_有絲分裂 物質；蒽環霉素A ；毒素；編程性細胞死亡劑。一個實施方案允許分離編碼上述公開的結合蛋白中的任何一種的核酸。另 一個實施方案提供包括分離的上面公開的核酸的載體，其中所述載體選自pcDNA; pTT (Durocher 等，Nucleic Acids Research 2002, Vol 30，No. 2) ；pTT3 (有另外多個克隆位 點的 pTT ;pEFBOS(Mizushima，S.禾口 Nagata，S. ， (1990) Nucleic acids Research Vol 18， No. 17) ；pBV ；pJV ；和 pBJ0在另一個實施方案中，用載體轉染宿主細胞。優選地，宿主細胞是原核細胞。更優 選地，宿主細胞是大腸桿菌。在相關實施方案中，宿主細胞是真核細胞。優選地，所述真核 細胞選自原生生物細胞，動物細胞，植物細胞和真菌細胞。更優選地，宿主細胞是哺乳動物 細胞，包括但不限于，CHO和COS ；或者真菌細胞，例如啤酒糖酵母；或昆蟲細胞，例如Sf9。本發明的另一方面提供結合人IL-18的結合蛋白的制備方法，包括在足以產生結 合人IL-18的結合蛋白的條件下在培養基中培養上面公開的宿主細胞中的任何一種。另一 個實施方案提供根據上面公開的方法制備的結合蛋白。本發明的另一方面提供包括上面公開的結合蛋白中的任何一種的結晶結合蛋白， 其中所述結合蛋白以晶體存在。優選地，所述晶體是沒有載體的藥學控制釋放晶體。在一 個實施方案中，作為晶體存在的結合蛋白具有比結合蛋白可溶性配對物更大的體內半存留 期。在另一個實施方案中，結合蛋白在結晶之后保留其生物活性。一個實施方案提供用于釋放結合蛋白的成分，其中所述成分包括含有上面公開的 結晶結合蛋白和成分；和至少一種聚合物載體的組合物。優選地，所述聚合物載體選自下面 的一種或幾種聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(縮肽)， 聚(酯)，聚(乳酸)，聚(乳酸_共-羥基乙酸)或PLGA，聚(b-羥基丁酸)，聚(γ-己 內酯)，聚(二氧六環酮) ’聚(乙二醇)，聚((羥丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有機)磷 腈]，聚(原酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，馬來酸酐_烷基乙烯基醚共聚物，多 聚醇，白蛋白，藻酸鹽，纖維素和纖維素衍生物，膠原，纖維蛋白，明膠，透明質酸，低聚糖， glycaminoglycans，硫酸多糖，它們的混合物和共聚物。優選地，所述成分選自白蛋白，蔗 糖，海藻糖，乳糖醇，明膠，羥丙基_ β _環糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一個實施方 案提供對哺乳動物治療的方法，包括對哺乳動物施用有效量的上述組合物的步驟。本發明的另一方面提供一種感興趣的基因的基因表達的調節方法，包括下面的步 驟提供IL-18多肽或IL-18調節劑；和多肽或調節劑接觸細胞，其中感興趣的基因選自下 面 Genbank 鑒定號確定的基因ΝΜ_000389，ΝΜ_002198，ΝΜ_002163, ΝΜ_006144, ΝΜ_006515, ΝΜ_007185, ΝΜ_002288, ΝΜ_003661, ΝΜ_021958, ΝΜ_001335, Hs. 382006, ΝΜ_020125, ΝΜ_007210,ΝΜ_021798,ΝΜ_013324，Μ11313，D88152,ΝΜ_001103,U37519,ΝΜ000697,J03600, ΝΜ_014578, S66793, U47054, L19871, Μ81181, NM 001188， U15460, ΝΜ014417, Ζ23115,NM_001713, U45878, U37546, U72649, U49187, J03507, U50360, XM_071866, NM_005623, Z32765, Z11697, XM071866, U51096, M83667, D87469, L07765, U66468, X14830, L29217, X15880, NM_001851, M27691, M37435, X13589, X16866, X59131, Nu004393, U73328, L19267, U53445, X68277, U48807, NM001950, U87269, M57730, X52541, J04076, X63741, L07077, M62831, M60830, U53786, NM_001988, NM_000141, M23668, U60062, NM_000141, U49973, U89995，U27326，A28102，M25667，L34357,U19523,L01406,U03486,X68285,Z18859,D49958, D43772, AC000099, M57731, X53800, M91036, D16583, X64877, X58431, M16937, NMO14468, X92814, L19314, M26665, D10995, L41147, M24283, S81914, J03171, J00219, NM_000619, NM_000585, U31628, X04500, M27492, X01057, M26062, Y00081, Y00787, Z31695, X06256, X57206, U20734, NM014879, D31762, D42038, NM_005551, NM_014846, X06182, Nu005551, X07730, M13955, M57710, S83362, NM_002314, NM_005569, U49957, U89922, X14008, U59914, D14497, X59727, NM000429, U43944, X72755, NM021230, NM005951, X78710, X70991, M32011, S77763, M58603, S76638, M69043, U91616, D86425, L13740, U44848, U79251, M27288, AF000234, D50640, L20971, L10343, U77735,NM003579,U17034,AB000584,X63131,D11428, NM_032940, NM_005035, NM_003579, M18255, L01087, D38128, Y10375, D15049, M31166, U59877, NM_003579, U64675, S57153, NM_002903, NG_000013, X75042, M83221, NM_000537, U22314, S59049, U70426, U22377, U38480, L10338, M23178, M69203, NM_005409, D79206, NM_005065, NM_004186, J03764, NM_006802, D89077, NM_003037, M91463, D82326, L05568, U96094, X83301，D21267，L31529, M62800, NM_021014, Z35093, NM_005816, L25444, M95787, NM005421, L47345, M57732, NM_003205, M96956, U19878, M92357, M59465, X83490, U37518, NM_003294, U19261, U78798, S69790, U53476, L15309, U78722, X57809, U79249, AB000464, X77744,U79248，AI420129，HG2981-HT3127，HG3548-HT3749，HG870-HT870，HG4333-HT4603， HG3111-HT3287, HG4593-HT4998， HG961-HT961, HG1877-HT1917, HG3115-HT3291， HG4115-HT4385，和 HG3925-HT4195。優選地，調節劑是拮抗劑。更優選地，調節劑是結合蛋白或中和結合蛋白。本發明還提供含有上述結合蛋白或中和結合蛋白和藥學可接受載體的藥物組合 物。在另一個實施方案中，藥物組合物含有至少一種用于治療其中IL-18活性是有害的 疾病的另外的治療藥物。優選地，所述另外的藥物選自血管生成抑制劑(包括但不限于 抗-VEGF抗體或VEGF-誘捕劑)；激酶抑制劑(包括但不限于KDR和TIE-2抑制劑)；共 同-刺激分子阻斷劑(包括但不限于抗-B7. 1，抗-B7.2，CTLA4-Ig，抗-⑶20)；粘著分子阻 斷劑(包括但不限于抗-LFA-I Abs，抗-E/L選擇蛋白Abs，小分子抑制劑)；抗-細胞因子 抗體或者其功能片段(包括但不限于抗-IL-12，抗-TNF，抗-IL-6/細胞因子受體抗體)； 甲氨喋呤；皮質類固醇；環孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非甾類抗炎藥物。另一方面，本發明提供一種抑制人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接觸上述結 合蛋白，使得人IL-18活性被抑制。在相關方面，本發明提供對患有其中IL-18活性是有 害的疾病的人患者抑制人IL-18活性的方法，包括對人患者施用上述結合蛋白使得人患者 中的人IL-18活性被抑制，從而實現治療。優選地，所述疾病選自類風濕性關節炎，骨關 節炎，幼年型慢性關節炎，萊姆關節炎，銀屑病關節炎，反應性關節炎，和膿毒性關節炎，脊 椎關節病，全身紅斑狼瘡，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，腸炎，胰島素依賴性糖尿病，甲狀
16腺炎，哮喘，變態反應疾病，牛皮癬，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排異(包括但 不限于骨髓和實體器官排異)，急性或慢性的與器官移植相關的免疫疾病，肉狀瘤病，動脈 粥樣硬化，傳播性血管凝固，Kaw阿司匹林ki' s病，Grave' s病，腎病綜合征，慢性疲勞 綜合征，Wegener' s內芽腫病，Henoch-Schoenlein紫癜，腎微結節性脈管炎，慢性活性肝 炎，眼色素層炎，膿毒性休克，中毒休克綜合征，膿毒癥綜合征，惡病質，傳染病，由寄生蟲引 起的疾病，后天免疫缺陷綜合征，急性橫向骨髓炎，Huntington' s舞蹈病，帕金森病，早老 性癡呆，中風，原發肝功能障礙引起的肝硬化，溶血性貧血，惡性腫瘤，心臟衰竭，心肌梗塞， Addison' s病，散發性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt' s綜合征，成人(急性) 呼吸抑制綜合征，脫發，脫發斑，血清反應陰性關節病，關節病，Reiter' s病，牛皮癬關節 病，潰瘍性結腸關節病，腸滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙門氏菌相關關節病，脊椎關節病，動脈粥 樣化疾病/動脈硬化，特應性變態反應，自身免疫大皰病，尋常性天皰瘡，落葉性天皰瘡，類 天皰瘡，線性IgA病，自身免疫溶血性貧血，Coombs陽性溶血性貧血，后天性惡性貧血，少年 惡性貧血，肌痛性大腦炎/Royal Free病，慢性粘膜皮膚念珠菌病，巨細胞關節炎，原發硬 化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免疫缺陷病綜合征，后天性免疫缺陷相關疾病，乙 肝，丙肝，普通各式各樣的免疫缺陷(普通各式各樣的血丙種球蛋白減少)，膨脹心肌病，女 性不孕癥，卵巢衰竭，早產卵巢衰竭，纖維變性肺病，起因不明的纖維組織形成牙槽炎，炎后 間質肺病，間質局限性肺炎，與間質肺病相關的締結組織疾病，與肺病相關的混合締結組織 疾病，與間質肺病相關的全身硬化，與間質肺病相關的類風濕性關節炎，與肺病相關的全身 紅斑狼瘡，與肺病相關的皮膚肌炎/多肌炎，與肺病相關的Sjogren' s病，與肺病相關的 僵硬脊椎炎，結節性脈管炎彌散肺病，與肺病相關的含鐵血黃素沉著病，藥物引起的間質肺 病，輻射纖維化，閉塞性毛細支氣管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴細胞浸潤性肺病，傳染病后間 質肺病，痛風關節炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼瘡樣肝炎)， 2_型自身免疫肝炎(抗-LKM抗體肝炎)，自身免疫介導的低血糖，B型胰島素抗性微黑棘 皮癥，甲狀旁腺機能減退，與器官移植相關的急性免疫疾病，與器官移植相關的慢性免疫疾 病，骨關節炎，原發硬化膽管炎，1型牛皮癬，2型牛皮癬，自發性白細胞減少，自身免疫中性 白細胞減少，腎病N0S，腎小球腎炎，腎microscopic vasulitis,萊姆病，盤形紅斑狼瘡，特 發性男性不孕癥或N0S，精液自身免疫性，多發性硬化(所有亞型)，交感神經眼炎，締結組 織疾病繼發性高血壓，Goodpasture' s綜合征，結節性多動脈炎肺動，急性風濕性發燒，類 風濕性脊椎炎，Still' s病，全身硬化，Sjogren' s綜合征，Takayasu' s病/動脈炎，自 身免疫血小板減少，特發性血小板減少，自身免疫甲狀腺病，甲狀腺機能亢進，甲狀腺腫自 身免疫甲狀腺機能亢進(Hashimoto' s病)，萎縮性自身免疫甲狀腺機能亢進，原發性粘 液水腫，晶體抗原性葡萄膜炎，原發性結節性脈管炎，白癜風，急性肝病，慢性肝病，酒精性 肝硬化，酒精引起的肝損傷，choleosatatis,特應性肝病，藥物引起的肝炎，非酒精性脂肪 性肝炎，變應性變態反應和哮喘，B族鏈球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁癥和精神分裂 癥)，Th2型和Thl型介導的疾病，和癌癥，例如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，結腸癌，胰腺癌， 卵巢癌，前列腺癌和直腸癌，和造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)。
另一方面，本發明提供對患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者治療的方法， 包括在施用上述第二種藥物之前，同時，或之后對患者施用上述結合蛋白中的任何一種的 步驟。
本發明另一方面提供選自人抗體；嵌合抗體；人源化抗體和CDR接枝抗體的中和 結合蛋白，其中所述中和結合蛋白能結合成熟-人IL-18，但是不特異性結合人IL-18原。本發明另一方面提供選自人抗體；嵌合抗體；人源化抗體和CDR接枝抗體的中和 結合蛋白，其中所述中和結合蛋白能與125-2H抗體競爭結合人IL-18。本發明另一方面提供選自人抗體；嵌合抗體；人源化抗體和CDR接枝抗體的中和 結合蛋白，其中所述中和結合蛋白不能與125-2H抗體競爭結合人IL-18。本發明另一方面提供選自人抗體；嵌合抗體；人源化抗體和CDR接枝抗體的中和 結合蛋白，其中所述中和結合蛋白不能與選自2. 5(E)mgl抗體和IL-18BP的結合蛋白競爭 結合人IL-18。在優選的實施方案中，結合蛋白能結合成熟_人IL-18，但是不特異性結合人 IL-18原。在另一個實施方案中，結合蛋白能與125-2H抗體競爭結合人IL-18。在另一個 實施方案中，結合蛋白不能與125-2H抗體競爭結合人IL-18。在另一個實施方案中，結合蛋白不能與選自2. 5(E)mgl抗體和IL-18BP的結合蛋 白競爭結合人IL-18。在優選的實施方案中，結合蛋白包括包括SEQ ID NO :9的氨基酸序列的\，和包括 SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Vho在另一個實施方案中，結合蛋白包括具有選自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的Ig重鏈恒定區；具有選自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG輕 鏈恒定區；具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重鏈可變區；和具有SEQ ID NO 9的氨基 酸序列的Ig輕鏈可變區。在另一個實施方案中，結合蛋白包括具有選自SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重 鏈恒定區；具有選自SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG輕鏈恒定區；具有SEQ ID NO 8的氨 基酸序列的Ig重鏈可變區；和具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig輕鏈可變區。
具體實施例方式本發明的詳細描述本發明提供IL-18結合蛋白，特別是抗-11-18抗體，或者與其結合的其抗原-結 合部分。本發明的各方面涉及抗體和抗體片段，及其藥物組合物，以及制備這樣的抗體和片 段的核酸，重組表達載體和宿主細胞。本發明還包括使用本發明的抗體體外或體內檢測人IL-18，抑制人IL-18活性，和 調節基因表達的方法。本發明還提供截短的IL-18。在相關方面，本發明還提供用于制備截 短的IL-18的核酸，重組表達載體和宿主細胞。除非在這里另有定義，與本發明相關使用的科學和技術定義應該具有本領域技術 人員通常理解的定義。此外，除非上下文必需說明，單數應該包括復數，而復數應當包括單 數。在本說明書中，除非另有說明"或"的意思是"和/或"。此外，術語"包括"，以及 其他形式，例如，第三人稱的和過去式的"包括"的使用，是非限制性的。還有，除非另有說 明，術語，例如"元素"或"成分"包括包括一個成分的元素和成分以及包括一個以上子 單位的元素和成分。一般情況下，與這里描述的細胞和組織培養，分子生物學，免疫學，微生物學，遺傳學和蛋白質和核酸化學和雜交技術相關使用的術語是本領域公知的和通常使用的。本發 明的方法和技術一般根據本領域公知的常規方法和本說明書引述的和討論的各種概述性 的和更專業的參考文獻來進行，除非另有說明。根據廠商說明書進行酶促反應和純化技術， 如本領域常規實現的或者如這里描述的。與這里描述的實驗步驟，分析化學，合成有機化 學和藥物化學技術相關的術語是本領域公知的和通常使用的。化學合成，化學分析，藥物制 備，制劑和送藥和對患者的治療是標準技術。下面定義選擇的術語，可以更容易理解本發明。這里使用的術語"多肽"指任何氨基酸的聚合鏈。術語"肽"和"蛋白質"與術 語多肽互換使用，也指氨基酸的聚合鏈。術語"多肽"包括天然或人造蛋白質，蛋白質片段 和蛋白質序列的多肽類似物。多肽可以是單體的或聚合的。術語"分離的蛋白質"或"分離的多肽"是由于其來源或產生來源不與其天然 態下伴隨它的天然相關成分相關；基本上沒有來自相同物種的其他蛋白質；由不同物種的 細胞表達；或者在自然中不存在的蛋白質或多肽。因此，化學合成或在不同于其天然起源細 胞不同的細胞系中合成的多肽是與其天然相關成分"分離的"。利用本領域公知的蛋白質 純化技術，通過分離，可以使得蛋白質基本上沒有天然相關成分。這里使用的術語"回收"指，例如，利用本領域公知的蛋白質純化技術，通過分 離，使得化學物質例如多肽基本上沒有天然相關成分的方法。這里使用的術語〃 IL-18"，指也已知為干擾素-Y的細胞因子，包括因子 (IGIF)，那是一種促炎性細胞因子，除了誘導擾素-γ的能力外還具有各種功能。與術 語〃 hIL-18"互換使用的術語〃人IL-18"包括SEQ ID NO 1的多肽及其片段，包括但不 限于，人IL-18原，成熟人IL-18原，和保留這里描述的IL-18的生物活性的任何截短的人 IL-18。這里使用的術語〃人IL-18原〃指SEQ ID NO :1的多肽。這里使用的術語〃成熟人 IL-18"，指SEQ ID NO :1的殘基37-193，這里使用的術語"截短的人"，指SEQ ID N0:1的 殘基59-193。優選地，IL-18，及其片段是生物活性的。這里使用的術語〃重組人IL-18" 或〃 rhlL-18"指利用重組DNA技術體外制備的人IL-18。這里使用的〃 IL-18的生物活性〃指細胞因子IL-18的所有固有的生物學性質。 IL-18的生物學性質包括但不限于結合IL-18受體；促進Thl和Tcl細胞的成熟和激活； 通過幾種細胞型促進細胞因子例如TNF，IFN γ和IL-I β的產生；促進巨噬細胞釋放細 胞因子例如TNF和IFNy，產生NO ；促進FasL表達，細胞毒性和細胞因子從NK細胞釋放 (IFN γ )；促進細胞因子/趨化因子釋放，突發性呼吸，顆粒釋放，嗜中性白細胞中粘著分子 表達；促進內皮細胞遷移從而促血管生成；促進GAG釋放，軟骨細胞中MMP和NO產生；促進 某些細胞中C0X2表達；和在某些細胞中減少細胞增殖。關于抗體，蛋白質，或肽與第二化學物質相互作用的這里使用的術語"特異性結 合"或"特異地結合"，意思是相互作用取決于化學物質上特定結構(例如抗原決定簇或 表位)的存在；例如，抗體識別和結合特定蛋白質結構而不是一般的蛋白質。如果抗體對于 表位"Α"是特異性的，含有標記的"Α"和抗體的反應中，含有表位A(或者游離的，沒有 標記的Α)，的分子的存在，會減少與抗體結合的標記的A的量。這里使用的術"抗體"，廣義上指由四個多肽鏈構成的任何免疫球蛋白(Ig)分 子兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)，或者保留Ig分子的基本表位結合特征的其任何功能片段，突變體，變體，或衍生物。這樣的突變體，變體，或衍生物抗體形式是本領域公知的。下 面討論非限制性實施方案。在全長抗體中，每條重鏈由一個重鏈可變區(這里縮寫為HCVR或VH)和一個重鏈 恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域，CH1，CH2和CH3構成。每條輕鏈由一個輕鏈可變 區(這里縮寫為LCVR或VL)和一條輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域，CL構成。 VH和VL區能進一步分為高變區，稱作互補性決定區(CDR)，期間散布著更保守的稱作構架 區(FR)的區。每條VH和VL由三個CDRs和四個FRs構成，從氨基末端至羧基末端以下面 的順序排列FR1，CDRl，FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。這里使用的術語，抗體的"抗原-結合部分"(或者簡單地"抗體部分")，指保 留特異性結合抗原(例如，hIL-18)能力的抗體的一個或幾個片段。已經證明通過全長抗體 的片段能完成抗體的抗原_結合功能。這樣的抗體實施方案還可以是雙特異性的，雙重特 異性的，或多特異性的形式；特異性結合兩個或多個不同的抗原。術語抗體的"抗原-結 合部分"所包括的結合片段的實施例包括(i)Fab片段，由VL，VH, CL和CHl結構域構成 的一價片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在鉸鏈區通過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片 段；(iii)由VH和CHl結構域構成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域構成的 Fv 片段，(v)dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature 341 :544_546)，其包括一個可變區；和(vi) 分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域，VL和VH，由不同的基因編碼， 利用重組方法，通過使它們制備成其中VL和VH區對形成一價分子(已知是單鏈Fv(SCFV)； 參見，例如，Bird 等(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)的蛋白質單鏈的合成接頭，能將它們連接。這樣的單鏈抗體也包 括在術語，抗體的"抗原-結合部分"中。也包括其他形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙 抗體是二價，雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單鏈多肽上表達，但是使用太短不能在 相同鏈上兩個結構域之間配對的接頭，從而使結構域與另一個鏈的互補結構域配對，產生 兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger，P.，等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ；Poljak, R. J.，等(1994) Structure 2:1121-1123)。這樣的抗體結合部分是本 令頁域公知的(Kontermann 禾口 Dubel 編著，Antibody EnRineerinR (2001) SprinRer-VerlaR. New York. 790pp. (ISBN 3-540-41354-5)。此外，抗體或其抗原-結合部分可以是更大的免疫粘著分子，是通過抗體或抗體 部分與一個或幾個其他蛋白質或肽的共價或非共價結合形成的。這樣的免疫粘著分子 的；例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區形成四聚體scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.， 等(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)，標記肽和 C-末端多組氨酸 標簽形成二價的和生物素化 scFv 分子(Kipriyanov, S. Μ.，等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗體部分，例如Fab和F (ab' ) 2片段，能應用常規技術，例如分別對全抗體進 行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而從全抗體制備。此外，應用這里描述的標準重組DNAa技術 能獲得抗體，抗體部分和免疫粘著分子。這里使用的術語"分離的抗體"，意指基本上沒有具有不同抗原特異性的其他 抗體的抗體(例如，特異性結合hIL-18的分離的抗體基本上沒有特異性結合hIL-18以外 抗原的抗體)。然而，特異性結合hIL-18的分離的抗體具有與其他抗原例如來自其他物種 的IL-18分子的交叉反應性。此外，分離的抗體基本上沒有其他細胞材料和/或化學品。
這里使用的術語"人抗體"意指包括具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變和 恒定區的抗體。本發明的人抗體可以包括不是人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基 (例如體外隨機或定點誘變或通過體內體突變誘導的突變)，例如在CDRs中，特別是在CDR3 中。然而，這里使用的術語"人抗體"不包括其中CDR序列來自另一個哺乳動物種系例如 小鼠的種系的抗體接枝到人構架序列上。這里使用的術語"重組人抗體"意在包括通過重組方法制備，表達，產生或分 離的所有的人抗體，例如利用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體(在下面 Il C章節進一步描述)，從重組組合人抗體庫分離的抗體(Hoogenboom H. R.，(1997) TIB Tech. 15 :62_70 ；Azzazy H.，和 Highsmith W. E.，(2002)Clin. Biochem. 35 :425_445 ； Gavilondo J. V.，禾口 Larrick J. W. (2002)BioTechniques 29 128-145 ；HoogenboomH., 和Chames P. (2000) Immunology Today 21 :371_378)，從人免疫球蛋白基因轉基因的動 物(例如小鼠)分離的抗體(參見，例如，Taylor, L. D.，等(1992) Nucl. Acids Res. 20 6287-6295 ；Kellermann S-A·,禾口 Green L. L. (2002)Current Opinion in Biotechnology 13 593-597 ；Little Μ.等(2000) Immunology Today 21 :364_370)或者通過涉及人免疫球 蛋白基因序列與其他DNA序列剪接的任何其他方法制備，表達，產生或分離的抗體。這樣的 重組人抗體具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區。但是在一些實施方案中，對 這樣的重組人抗體體外誘變(或者，當體內體誘變使用人Ig序列的轉基因動物時)，從而 重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列是來自體內人抗體種系全部中天然并不存在的人種系 VH和VL序列或者與人種系VH和VL序列相關的序列。術語"嵌合抗體"指包括來自一個物種的重鏈和輕鏈可變區序列和來自另一個 物種的恒定區序列的抗體，例如具有與人恒定區連接的鼠重鏈和輕鏈可變區的抗體。術語"⑶R-接枝抗體“指包括來自一個物種的重鏈和輕鏈可變區，但是其中序 列中VH和/或VL中一個或幾個CDR區被另一個物種的CDR序列置換，例如具有其中一個 或幾個鼠⑶Rs (例如，⑶R3)被人⑶R序列置換的鼠重鏈和輕鏈可變區的抗體。術語"人源化抗體"指包含來自非人物種(例如小鼠)但是其中VH和/或VL序 列中至少一部分被變為更“人_樣”，即人種系可變序列更相似的重鏈和輕鏈可變區序列的 抗體。人源化抗體的一種類型是CDR-接枝抗體，其中人CDR序列導入非人VH和VL序列置 換相應的非人CDR序列。如這里使用的，術語〃 hIL-18中和結合蛋白〃指特異性結合hIL-18并且中和 hIL-18的生物活性的蛋白質。優選地，中和結合蛋白是其與hIL-18的結合導致hIL-18的 生物活性被抑制的中和抗體。優選地，中和結合蛋白結合hIL-18并且將hIL-18的生物活 性減小至少大約20%，40%，60%，80%，85%或更多。中和結合蛋白對hIL_18的生物活性 的這種抑制作用能通過測定hIL-18生物活性的一個或幾個指標來評定。hIL-18生物活性 的這些指標能通過本領域公知的體外或體內分析的幾種標準方法中的一種或幾種來評定。術語"表位"包括能特異性結合免疫球蛋白或T-細胞受體的任何多肽決定簇。 在一些實施方案中，表位決定簇包括象氨基酸，糖側鏈，磷酰基，或磺酰基這樣的分子的化 學活性表面基團，并且在一些實施方案中，可以具有特定的三維結構特征和/或特定電荷 特征。表位是抗體結合的抗原的區。在一些實施方案中，當抗體優先識別蛋白質和/或大 分子復合混合物中其靶物抗原時，抗體特異性結合抗原。
21Koff"，意指本領域公知的抗體從抗體/抗原復合體離解的 Kd"，意指本領域公知的特定抗體_抗原相互作用的離解常如這里使用的術語"表面等離振子共振"指一種光學現象，它使得通過檢測生物 傳感器基體中蛋白質濃度的改變來分析實時生物特異性相互作用，例如利用BIAcore系統 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)。為了進一步描述，參 見 Jonsson，U.，等(1993)Ann. Biol. Clin. 51 19-26 ;Jonsson，U.，等(1991)Biotechniques 11 620-627 Johns son, B.，等(1995) J. Mol. Recognit. 8 125-131 ；和 Johnnson, B.，等 (1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。如這里使用的術語〃 K。n"，意指本領域公知的抗體與抗原締合生成抗體/抗原復 合體的生成速率常數。如這里使用的術語' 離解速率常數。如這里使用的術語" 數。如這里使用的術語"標記的結合蛋白"，指帶有插入的標記物提供結合蛋白鑒定 的蛋白質。優選地，標記物是可檢測標記，例如插入放射性標記的氨基酸或連接標記的抗生 物素蛋白能檢測的生物素基部分的多肽(例如，包含熒光標記物或者光學或比色方法能檢 測的酶活性的鏈霉抗生物素蛋白)。多肽的標記物的例子包括但不限于下面的放射性同 位素或放射性核素(例如，3H，14C，35S，9°Y，99TC，mIn，125I，131I，177LU，166H0，或 153Sm)；熒光標 記物(例如，FITC，羅丹明，鑭系磷光劑)，酶學標記(例如，辣根過氧化物酶，熒光素酶，堿 性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基團；預先確定的第二報告基團識別的多肽表位(例 如，亮氨酸拉鏈對序列，二次抗體的結合位點，金屬結合結構域，表位標簽)；和有吸引力的 試劑，例如釓螯合劑。術語"綴合結合蛋白"指與第二化學部分，例如治療性藥物或細胞毒性試劑， 化學連接的結合蛋白。術語"試劑"在這里用來指化合物，化合物的混合物，生物大分 子，或者從生物材料制備的提取物。優選地，治療性藥物或細胞毒性試劑包括但不限于， 百日咳毒素，紫杉酚，細胞松弛素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，吐根堿，絲裂霉素，依托泊苷， tenoposide,長春新堿，長春堿，秋水仙堿，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，二羥蒽 二酮，光輝霉素，放線菌素D，l_脫氫睪酮，糖皮質激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘 洛爾，和嘌呤霉素，和它們的類似物或同系物。這里使用的術語"結晶結合蛋白"指以晶體形式存在的多肽。晶體是一種固態形 式，它與其他形式例如無定形固態或液晶態截然不同。晶體由原子，離子，分子(例如蛋白 質，象抗體)，或分子集合體(例如抗原/抗體復合體)有序的重復的三維排列組成。這些三 維排列根據本領域公知的特殊數學關系排列。晶體中重復的基礎單元，或者構件，稱作不對 稱單元。證實給出確定的結晶學對稱性的排列中重復的不對稱單元提供晶體的"晶胞"。 所有三個方向規則轉換的晶胞的重復得到晶體。參見Giege，R.和Ducruix，A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)“。這里稱作"多核苷酸"的術語在這里指兩個或多個核苷酸，核糖核酸或脫氧核糖 核酸或任何類型核苷酸的修飾形式的聚合形式。該術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA，但是優 選雙鏈DNA。
這里使用的術語"分離的多核苷酸"意思是多核苷酸(例如基因組的，cDNA，或 者合成來源，或者它們的組合)，其由于其來源，“分離的多核苷酸"與自然界發現"分離 的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分不相締合；與自然界不連接的多核苷酸操作連接； 或者在自然界不作為更大序列的部分而存在。這里使用的術語"載體"意指能將它所連接的另一個核酸轉運的核酸分子。載體 的一種類型是"質粒"，它指其中可以連接另外的DNA片段的環狀雙鏈DNA環。載體的另 一種類型是病毒載體，其中另外的DNA片段連接到病毒基因組中。一些載體能在導入它們 的宿主細胞中自主復制(例如，有細菌復制起點的細菌載體和游離基因哺乳動物載體)。其 他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在導入宿主細胞中時能被整合到宿主細胞的基因 組中，從而與宿主基因組一起復制。此外，一些載體能指導它們操作連接的基因的表達。這 樣的載體在這里稱作"重組表達載體"(或者簡單地，"表達載體")。一般情況下，重 組DNA技術中使用的表達載體經常是質粒形式。本說明書中，“質粒"和"載體"可以互 換使用，因為質粒是最常使用的載體形式。然而，本發明意在包括這樣的表達載體的其他形 式，例如病毒載體(例如，復制缺陷逆轉錄病毒，腺病毒和腺-相關病毒，它們起著同等的功 能。術語"操作連接"指其中將描述的成分相關聯使得它們以期望的方式發揮功能 的連接。與編碼序列"操作連接"的調控序列以這樣的方式連接使得在與調控序列相匹配 的條件下實現編碼序列的表達。“操作連接"序列包括與感興趣的基因鄰接的表達調控序 列和以反式起作用或者與感興趣的調控基因有距離的表達調控序列。這里使用的"表達調控序列"指進行表達和加工它們連接的編碼序列所必需的 多核苷酸序列。表達調控序列包括合適的轉錄起始序列，中止序列，啟動子和增強子序列； 有效RNA加工信號，例如剪接和多腺苷酸酸化信號；穩定胞質mRNA的序列；提高翻譯效率 的序列(劑，Kozak共有序列)；提高蛋白質穩定性的序列；如果期望，增強蛋白質分泌的序 列。這樣的調控序列的性質根據宿主生物而不同；在原核生物中，這樣的調控序列一般包括 啟動子，核糖體結合位點，和轉錄終止序列；在真核生物中，一般情況下，這樣的調控序列包 括啟動子和轉錄終止序列。術語"調控序列"意在包括其存在對于表達和加工是必須的成 分，并且還包括其存在是有利的附加成分，例如前導序列和融合配對物序列。這里定義的"轉化"指外源DNA進入宿主細胞的任何過程。利用本領域公知的各 種各樣的方法在天然或人為條件下可以發生轉化。轉化可以依賴公知的方法將外來核酸 序列插入原核或真核宿主細胞。根據轉化的宿主細胞選擇方法并且包括但不限于，病毒感 染，電穿孔，脂質轉染，和粒子轟擊。這樣的"轉化"細胞包括穩定轉化的細胞，其中插入的 DNA能作為自身復制質粒或者作為宿主染色體的部分復制。它們還可以包括瞬時表達插入 的DNA或RNA有限時間的細胞。這里使用的"重組宿主細胞"(或者簡單地"宿主細胞")意指其中已經導入外 源DNA的細胞。應該理解這樣的術語意在不僅指特定受體細胞，而且還有這樣的細胞的后 代。因為由于突變或環境影響，在后代中可能發生一些改變，這樣的后代事實上可能與母本 細胞不同，但是它仍然包括在這里使用的術語"宿主細胞"的范圍內。優選地，宿主細胞包 括選自生命界任何原核和真核細胞。優選的真核細胞包括原生生物，真菌，植物和動物細 胞。最優選地，宿主細胞包括但不限于原核細胞系大腸桿菌；哺乳動物細胞系CHO和COS ；
23昆蟲細胞系Sf9 ；和真菌細胞啤酒糖酵母。標準技術可以用于重組DNA，寡核苷酸合成，和組織培養和轉化(例如，電穿孔， 脂質轉染)。酶促反應和純化技術可以根據廠商說明書進行或者以本領域常規做法或者 根據這里的描述進行。上述技術和方法一般根據本領域公知的常規方法和各種概述和更 具體說明的參考文獻的描述進行，這些參考文獻在本說明書中引述并討論。參見，例如， Sambrook 等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二版，冷泉港出版社，冷泉港， 紐約(1989))，這里為了所有的目的引作參考。正如本領域公知的和這里使用的，“轉基因生物"，指有包含轉基因的細胞的生 物，其中導入生物體中的轉基因(生物體的祖先)表達在生物體中天然并不表達的多肽。“ 轉基因"是DNA構建體，其穩定操作整合導產生轉基因生物體的細胞的基因組中，在轉基 因生物的一種或幾種細胞類型或組織中指導編碼基因產物的表達。術語"調控"和"調節"互換使用，如這里使用的，指感興趣的分子活性(例如， hIL-18的生物活性)的變化或改變。調控可以是感興趣的分子的某些活性或功能大小的增 加或減小。舉例的分子的活性和功能包括但不限于，結合特征，酶活性，細胞受體激活，和信 號轉導。相應地，這里使用的術語"調節劑"是能改變或變化感興趣的分子的活性或功能 (例如，hIL-18的生物活性)的化合物。例如，調節劑可以引起分子的某些活性或功能的大 小與不存在調節劑所發現的活性或功能的大小相比有所增大或降低。在一些實施方案中， 調節劑是抑制劑，其降低分子的至少一種活性或功能大小。舉例的抑制劑包括但不限于蛋 白質，肽，抗體，，P印tibodies，碳水化合物或小有機分子。P印tibodies描述于，例如，WO 01/83525。這里使用的術語"激動劑"指一種調節劑，其當與感興趣的分子接觸時，引起分 子的某些活性或功能的大小與不存在激動劑所發現的活性或功能的大小相比有所增大。特 別感興趣的激動劑包括但不限于，IL-18多肽，核酸，碳水化合物，或結合hIL-18的任何其 他分子。這里使用的術語"拮抗劑"或"抑制劑"指一種調節劑，其當與感興趣的分子接 觸時，引起分子的某些活性或功能的大小與不存在拮抗劑所發現的活性或功能的大小相比 有所增大。特別感興趣的拮抗劑包括阻斷或調節hIL-18的生物學或免疫學活性的那些。 hIL-18的拮抗劑和抑制劑包括但不限于，蛋白質，核酸，碳水化合物，或結合hIL-18的任何 其他分子。這里使用的術語"樣品"以其廣義使用。這里使用的"生物樣品"包括但不限 于，來自活體或活體前的一定量物質。這樣的活體包括但不限于，人，小鼠，大鼠，猴，狗，兔 和其他動物。這樣的物質包括但不限于，血液，血清，尿液，滑液，細胞，器官，組織，骨髓，淋 巴結和脾。這里使用的，一般公知的，本領域技術人員使用的，術語"競爭"，指一種蛋白質 與第二種結合蛋白結合這兩種結合蛋白共同的配體(例如，IL-18)的相互干擾或者阻礙的 能力。用于測定結合蛋白的競爭特征的試驗是本領域公知的。這里描述優選的競爭試驗。I.結合人IL-18的人抗體本發明的一個方面提供以高親合力，低解離速率和高中和能力，結合IL-18分離的人抗體，其抗原結合部分。優選地，抗體，或者其部分是分離的抗體。優選地，本發明的人 抗體是中和人抗-IL-18抗體。A.抗IL-18抗體的制備方法通過本領域公知的多種技術可以制備本發明的抗體。制備本發明的抗-IL-18抗 體的特別優選的方法包括使用XEN0M0USE轉基因小鼠，并且使用本領域公知的用于制備抗 體的雜交瘤和SLAM細胞操作技術(Abgenix，Inc.，Fremont, CA)，并且使用包括實施例3. 2 描述的IL-18肽的抗原，即，包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列和其片段的人IL-18。在本發明的一個實施方案中，通過用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座全 部或部分的非人動物制備人抗體。在優選的實施方案中，非人動物是XEN0M0USE轉基因小 鼠，包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗體產生中缺乏的基因工程小鼠品系。 參見，例如，Green 等 Nature Genetics 7 :13_21(1994)和美國專利 5，916，771，5，939，598， 5，985，615,5, 998，209,6, 075，181,6, 091，001,6, 114，598 和 6，130，364。還參見 1991 年 7 月25日公開的WO 91/10741，1994年2月3日公開的WO 94/02602，1996年10月31日公 開的 W 96/34096 和 W 96/33735，1998 年 4 月 23 日公開的 W098/16654，1998 年 6 月 11 日公開的WO 98/24893，1998年11月12日公開的WO 98/50433，1999年9月10日公開的 W099/45031，1999 年 10 月 21 日公開的 WO 99/53049，2000 年 2 月 24 日公開的 WO 0009560, 和2000年6月29日公開的WO 00/037504。XEN0M0USE轉基因小鼠產生全人抗體的成 人_樣人抗體庫，并且產生抗原_特異性人Mabs. XEN0M0USE轉基因小鼠通過導入兆堿基大 小的，人重鏈基因座和χ輕鏈基因座的種系構型YA片段而包含大約80%人抗體庫。參見 Mendez 等，Nature Genetics 15 146—156 (1997)，Green 禾口 Jakobovits J. Exp. Med. 188 483-495(1998)，其公開內容引作參考。本發明還提供了通過免疫包括人免疫球蛋白基因座的非人轉基因動物從非人非 小鼠動物制備抗-IL-18抗體的方法。人們可以利用上面剛描述的方法制備這樣的動物。這 些專利文獻中公開的方法可以根據美國專利5，994，619的描述改進。在優選實施方案中， 非人動物可以是大鼠，綿羊，豬，山羊，牛或馬。在另一個實施方案中，包括人免疫球蛋白基因座的非人動物是人免疫球蛋白“小 基因座”的動物。在小基因座研究中，通過從Ig基因座包含各個基因來模擬外源Ig基因座。 這樣，一個或幾個Vh基因，一個或幾個Dh基因，一個或幾個Jh基因，一個μ恒定區，和一個 第二恒定區(優選Y恒定區)形成用于插入動物中的構建體。這項研究具體描述于美國 專利 No. 5，545，807，5，545，806，5，625，825，5，625，126，5，633，425，5，661，016，5，770，429， 5，789，650,5, 814，318,5, 591，669,5, 612，205,5, 721，367,5, 789，215，和 5，643，763，這里 引作參考。小基因座研究的好處是快捷，能產生包括Ig基因座的部分的構建體并且導入動 物中。然而，小基因座研究的潛在的缺點是可能沒有足夠的免疫球蛋白多樣性來支持全 B-細胞發育，使得抗體產生較少。為了制備人抗-IL-18抗體，用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座的一些或 全部的非人動物，并且從動物分離抗體或產生抗體的細胞。IL-18抗原可以是分離的和/或 純化的IL-18，并且優選是人IL-18。在另一個實施方案中，IL-18抗原是IL-18的片段，優 選成熟IL-18。在另一個實施方案中，IL-18抗原是包括至少一個IL-18的表位的片段。
對動物的免疫可以通過本領域公知的任何方法來進行。參見，例如，Harlow和 Lane, Antibodies =A Laboratory Manual，紐約冷泉港出版社，1990。對非人動物例如小 鼠，大鼠，綿羊，山羊，豬，牛和馬進行免疫的方法是本領域公知的。參見，例如，Harlow和 Lane，美國專利5，994，619。在優選的實施方案中，IL-18抗原與輔助劑一起施用刺激免疫 應答。這樣的輔助劑包括完全或不完全福氏佐劑，RIBI (胞壁酰二膚)或ISCOM(免疫刺激 復合體)。這樣的輔助劑通過局部沉積分離它而可以保護多肽不快速散播，或者它們可以 含有刺激宿主分泌對巨噬細胞和免疫系統的其他成分有趨化性的物質。優選地，如果施用 多肽，免疫程序包括施用兩次或多次多肽，延續幾周。實施例2. 2. A提供用磷酸鹽緩沖鹽水中人IL-18免疫XEN0M0USE轉基因小鼠的方案。B.抗體和產生抗體的細胞系的產生用IL-18抗原免疫動物之后，可以從動物獲得抗體和/或產生抗體的細胞。通過 從動物取血或殺死動物而從動物獲得含有抗-IL-18抗體的血清。可以使用從動物獲得的 血清，從血清獲得的免疫球蛋白級分，或者從血清純化的抗-IL-18抗體。以這種方式獲得 的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此帶有一系列異源性質。在另一個實施方案中，可以從受免疫動物制備產生抗體的無限繁殖雜交瘤。免疫 之后殺死動物，并且根結本領域公知的，將B脾細胞與無限繁殖骨髓瘤細胞融合。參見，例 如，Harlow和Lane，上文。在優選實施方案中，骨髓瘤細胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分 泌細胞系)。融合抗生素選擇之后，使用IL-18，或者其部分，或表達IL-18的細胞篩選雜交 瘤。在優選實施方案中，利用酶聯免疫分析(ELISA)或者放射免疫分析(RIA)進行最初的 篩選，優選ELISA。WO 00/37504中提供了 ELISA篩選的實施例，這里引作參考。選擇產生抗-IL-18抗體的雜交瘤，克隆，并且進一步篩選期望的特征，包括強健 雜交瘤生長，高抗體產生和期望的抗體特征，下面進一步討論。培養雜交瘤并且在同源動物 體內，在沒有免疫系統的動物，例如，裸鼠，中展開，或者在培養基中體外培養。篩選，克隆和 擴展雜交瘤的方法是本領域技術人員公知的。優選地，免疫動物是表達人免疫球蛋白基因并且B脾細胞與來自和非人動物相同 物種的骨髓瘤融合的非人動物。更優選地，免疫動物是XEN0M0USE轉基因小鼠，骨髓瘤細胞 系是非-分泌小鼠骨髓瘤，例如骨髓瘤細胞系是P3X63Ag8.653(參見，例如，實施例2. 2. B)。一方面，本發明提供產生人抗-IL-18抗體的雜交瘤。在優選的實施方案中，雜交 瘤是小鼠雜交瘤，如上所述。在另一個優選的實施方案中，雜交瘤是在非人非小鼠物種中產 生的，例如大鼠，綿羊，豬，山羊，牛或馬。在另一個實施方案中，雜交瘤是人雜交瘤，其中人 非分泌骨髓瘤與表達抗-IL-18抗體的人細胞融合。在本發明的另一個方面，利用本領域稱作篩選淋巴細胞抗體方法(SLAM)的 方法從單一的分離的淋巴細胞制備重組抗體，如美國專利No. 5，627，052，PCT公開WO 92/02551，和 Babcock，J. S.等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7843_7848 所述。在該 方法中，應用抗原特異性溶血血小板測試來篩選I(A)章節中描述的任何一種免疫動物得 到的分泌感興趣的抗體的單一細胞，例如淋巴細胞，在抗原特異性溶血血小板測試中，抗原 IL-18，或者其片段，利用接頭，例如生物素，與綿羊紅細胞偶聯，并且用來鑒定分泌對IL-18 有特異性的抗體的單一細胞。鑒定感興趣的分泌抗體的細胞之后，通過逆轉錄酶-PCR從細胞獲得重鏈和輕鏈可變區cDNAs，然后在哺乳動物細胞例如COS或CHO細胞中，在合適的免 疫球蛋白恒定區(例如，人恒定區)的上下游表達這些可變區。用來自體內篩選的淋巴細 胞的擴增的免疫球蛋白序列轉染宿主細胞，然后進一步分析并體外篩選，例如通過使轉染 細胞分離表達抗IL-18抗體的細胞。進一步體外操作擴增的免疫球蛋白序列，例如通過體 外親和性成熟方法，例如PCT公開WO 97/29131和PCT公開WO 00/56772中描述的那些。也可以利用體外方法來制備本發明的抗體，其中篩選抗體庫來鑒定具有期望的結 合特異性的抗體。這樣篩選重組抗體庫的方法是本領域公知的并且包括例如下面文獻中 描述的方法=Ladner 等，美國專利 No. 5，223，409 ；Kang 等，PCT 公開 No. W092/18619 ；Dower 等，PCT 公開 No. WO 91/17271 ；Winter 等，PCT 公開 No. WO 92/20791 ；Markland 等，PCT 公 開 No. WO 92/15679 ；Breitling 等，PCT 公開 No. WO 93/01288 ；McCafferty 等，PCT 公開 No. WO 92/01047 ;Garrard 等，PCT 公開 No. WO 92/09690 ；Fuchs 等(1991) Biol Technology 9 1370-1372 ;Hay 等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3 :81_85 ;Huse 等(1989)Science 246 1275-1281 ；McCafferty 等，Nature(1990) 348 :552_554 ；Griffiths 等，(1993)EMBO J 12 725-734 ；Hawkins 等(1992) J Mol Biol 226 :889_896 ；Clackson 等(1991)Nature 352 :624-628 ;Gram 等(1992) PNAS 89 :3576_3580 ;Garrad 等(1991) Bio/Technology 9 1373-1377 ;Hoogenboom等(1991) Nucl Acid Res 19 :4133_4137 JPBarbas 等(1991) PNAS 88 :7978-7982，美國專利申請公開20030186374，和PCT公開No. WO 97/29131，這些文獻的 內容在此引作參考。重組抗體庫可以來自用IL-18，或IL-18的部分免疫的受試者。或者，重組抗體庫 可以來自裸受試者，即，沒有用IL-18免疫的受試者，例如從沒有用人IL-18免疫的人受試 者獲得的人抗體庫。通過用包括人IL-18的肽(例如，相應于hIL-18的部分的肽)篩選重 組抗體庫來篩選本發明的抗體，從而篩選識別IL-18的那些抗體。實施這樣的篩選和選擇 的方法是本領域公知的，例如上一段中的參考文獻中描述的的。為了篩選對hIL-18具有特 定的結合親和性的本發明的抗體，例如以特定解離速率常數從人IL-18離解的那些，能利 用本領域公知的表面等離振子共振的方法來篩選具有期望的解離速率常數的抗體。為了篩 選對hIL-18具有特定中和活性的本發明的抗體，例如具有特殊IC5tl的那些，可以利用本領 域公知的評價hIL-18活性的抑制作用的本領域公知的標準方法。一方面，本發明提供分離的抗體，或者結合人IL-18的其抗原結合部分。優選地， 抗體是中和抗體。優選地，抗體是人抗體。在很多實施方案中，抗體是重組抗體或單克隆 抗體。本發明最優選的中和抗體在這里稱作2. 5(E)，并且具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列 的VL和SEQ ID NO 6的氨基酸序列的VH。最優選地，2. 5 (E)抗體結合人IL-18，Kd小于 5xl01QM (參見實施例2. 2. F)。優選地，本發明的抗-IL-18抗體，例如2. 5(E)抗體和相關抗體，具有減小或中和 IL-18活性的能力，例如，根據本領域公知的幾種體外和體內測試所測定的(例如，參見實 施例3. 2. F)。例如，這些抗體中和KG-I細胞中人Y干擾素的IL-18-誘導的產生，IC50值 的范圍至少大約10_8M，大約10_9M，或者大約ΙΟ,Μ。此外，這些抗體還中和全血細胞中人Y 干擾素的IL-18-誘導的產生，IC5tl值的范圍至少大約10_8Μ，大約10_9Μ，或者大約10_1QM。在特別優選的實施方案中，抗-IL-18抗體2. 5 (E)結合各種形式的人IL-18，包 括IL-18原，成熟IL-18和截短的IL-18。抗體2. 5 (E)不特異性結合其他細胞因子，例如IL-2, IL-3, IL-4, IL-5，IL-6，, IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16， 11^-17，11^-21，1咿，1^(淋巴毒素)，1^0 13 2，和1^0 2旦1。但是，抗體2. 5 (E)與來自其 他物種的IL-18沒有交叉反應性。例如，抗體中和來自cynomolgus猴的IL-18的活性(IC5tl for cyno IL-18 = 9. EX 1(Γ"；參見實施例 2. 2. Jl)。一方面，本發明提供2. 5(E)抗體和功能抗體部分，2. 5 (E)-相關抗體和功能抗體 部分，與2. 5(E)等同性質的其他人抗體和功能抗體部分，例如以低離解動力學和高中和能 力結合IL-18的高親和性。在優選的實施方案中，分離的抗體，或者其抗原_結合部分，結合 人IL-18，根據表面等離振子共振所測定的，其中抗體，或者其抗原-結合部分，其中抗體， 或者其抗原_結合部分，以大約0. Is"1或更小的K。ff速率常數從人IL-18離解，或者其以大 約IxlO-6M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根據表面等離振子共振所測定的，抗體， 或者其抗原_結合部分，可以以大約IxlO-2S-1或更小的K。ff速率常數從人IL-18離解，或者 其以大約IxlO-7M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根據表面等離振子共振所測定 的，抗體，或者其抗原_結合部分，可以以大約IxlO-3S-1或更小的K。ff速率常數從人IL-18 離解，或者其以大約IxlO-8M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根據表面等離振子共 振所測定的，抗體，或者其抗原_結合部分，可以以大約IxlO-4S-1或更小的K。ff速率常數從 人IL-18離解，或者其以大約IxlO-9M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根據表面等 離振子共振所測定的，抗體，或者其抗原_結合部分，可以以大約IxlO-5S-1或更小的K。ff速 率常數從人IL-18離解，或者其以大約ΙχΙΟ,Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根 據表面等離振子共振所測定的，抗體，或者其抗原-結合部分，可以以大約IxlO-5S-1或更小 的K。ff速率常數從人IL-18離解，或者其以大約1X10_"M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。在另一個實施方案中，本發明提供分離的人抗體，或其抗原結合部分，具有包括 SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ； SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ ID NO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQ ID NO 39 ；或 SEQ ID NO :41的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)，和包括SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQ BD NO 18 ；SEQID NO 20 ； SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ； SEQ ID NO 34 ；SEQID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；或 SEQID NO 40 的氨基酸序列的重鏈可變區 (VH)。在一些實施方案中，抗體包括重鏈恒定區，例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定區。優選地，重鏈恒定區是IgGl重鏈恒定區或IgG4重鏈恒定區。此外，抗 體包括輕鏈恒定區，κ輕鏈恒定區或λ輕鏈恒定區。優選地，抗體包括κ輕鏈恒定區。或 者，抗體部分可以是，例如，Fab片段或單鏈Fv片段。Fc部分中氨基酸殘基的置換改變抗體效應子功能是本領域公知的(Winter，等， 美國專利No. 5，648，260 ；5624821)。抗體的Fc部分介導幾種重要效應子功能，例如細胞因 子誘導，ADCC，吞噬作用，補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體和抗原_抗體復合體的半衰期 /清除率。在一些情況下；對于治療性抗體，這些效應子功能是所期望的，但是在另一些情 況下可能是不需要的甚至是有害的，取決于治療目標。一些人IgG同位型，特別是IgGl和 IgG3,分別通過與Fc y Rs和補體Clq結合而介導ADCC和CDC。新生Fc受體(FcRn)是決定抗體的循環半衰期的關鍵成分。在另一個實施方案中，抗體的恒定區例如抗體的Fc區中至 少一個氨基酸殘基被置換，使得抗體的效應子功能被改變。一個實施方案提供了標記的結合蛋白，其中本發明的抗體或抗體部分被衍生化或 者連接另一個功能分子(例如，另一個肽或蛋白質)。例如，通過將本發明的抗體或抗體部 分(通過化學偶聯，基因融合，非共價結合或者其他)與一個或幾個其他分子部分功能連 接，能衍生本發明的標記的結合蛋白，所述其他分子部分例如另一種抗體(例如，雙特異性 抗體或二聯抗體)，可檢測試劑，細胞毒性試劑，藥物物質，和/或能介導抗體或抗體部分與 另一種分子(例如鏈霉抗生物素蛋白核心區或多組氨酸標簽)結合的蛋白質或肽。本發明的抗體或抗體部分可以被衍生化的有用可檢測試劑包括熒光化合物。舉例 的熒光可檢測試劑包括熒光素，熒光素異硫氰酸酯，羅丹明，5- 二甲基胺-1-萘磺酰基氯， 藻紅蛋白等等。還可以用可檢測酶將抗體衍生化，例如用堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，葡 萄糖氧化酶等等能夠。當用可檢測酶將抗體衍生化時，通過加入另外的試劑檢測它，酶用 來產生可檢測反應產物。例如，當存在可檢測試劑辣根過氧化物酶時，加入過氧化氫和二氨 基聯苯胺產生有色反應產物，其是可檢測的。也可以用生物素將抗體衍生物化，并且通過間 接測定抗生物素蛋白或鏈酶抗生物素蛋白結合來測定。本發明的另一個實施方案提供結晶結合蛋白。優選地，本發明涉及這里公開的全 抗-IL-18抗體及其片段的結晶，含有這樣的結晶的制劑和組合物。在一個實施方案中，結 晶的結合蛋白具有比結合蛋白的可溶配對物更長的體內半存留期。在另一個實施方案中， 結合蛋白在結晶之后保留了生物活性。根據本領域公知的方法和根據中公開的，可以制備本發明的結晶結合蛋白，WO 02072636在此引作參考(也參見例如2. 2. M)。本發明另一個實施方案提供糖基化結合蛋白，其中抗體或抗原-結合部分包括一 個或幾個糖殘基。最初的體內蛋白質的產生可以進一步加工，這是翻譯后修飾。特別地，糖 (乙二醇)殘基可以酶促加上，這個過程是糖基化作用。得到的帶有共價連接的寡糖側鏈的 蛋白質已知是糖基化蛋白質或糖蛋白。蛋白質糖基化作用取決于感興趣的蛋白質的氨基酸 序列，以及其中表達蛋白質的宿主細胞。不同的生物體可以產生不同的糖基化作用酶(例 如，糖基轉移酶和糖苷酶)，并且具有不同的底物(核苷酸糖類)。由于這樣的因素，蛋白質 糖基化模式，糖基殘基的成分可以根據其中表達特定蛋白質的宿主系統而不同。本發明中 使用的糖基殘基可以包括但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，巖藻糖，η-乙酰氨基葡萄糖和 唾液酸。優選地，糖基化結合蛋白包括糖基化殘基，使得糖基化模式是人的。本領域技術人員公知不同的蛋白質糖基化作用可以產生不同的蛋白質特征。例 如，與哺乳動物例如CHO細胞系中表達的相同蛋白質相比，微生物宿主例如使用酵母內源 途徑的酵母中產生的糖基化的治療性蛋白質的功效可能被減小。這樣的糖蛋白在人體中也 可以是免疫原性的并且具有給藥后減小的體內半存留期。人和其他動物中的特異受體可以 識別特異糖基殘基并且促進蛋白質在血液中的快速清除。其他副作用包括蛋白質折疊，可 溶性，對蛋白酶的靈敏性，運輸，轉運，區室化，分泌，被其他蛋白質或因子識別，抗原性，或 變應原性的改變。因此，醫師可能優選具有特定糖基化作用成分和模式的治療性蛋白質， 例如與人細胞中或關注的受試者動物的物種-特異性細胞中產生的相同或至少相似的糖 基化成分和模式。
29
通過基因修飾宿主細胞來表達異源糖基化酶，可以實現與宿主細胞不同的糖基化 蛋白質的表達。應用本領域公知的技術，醫師可以獲得具有人蛋白質糖基化作用的抗體或 其抗原_結合部分。例如，對酵母菌株進行基因修飾來表達非天然存在的糖基化酶，使得這 些酵母菌株中產生的糖基化蛋白質(糖蛋白)具有與動物細胞特別是人細胞產生的相同的 蛋白質糖基化作用(美國專利申請20040018590和20020137134)。此外，本領域技術人員明白，使用經基因工程處理的表達各種糖基化酶的宿主細 胞庫，可以表達感興趣的蛋白質，使得庫中成員宿主細胞產生具有不同糖基化作用模式的 感興趣的蛋白質。醫師可以選擇并分離具有特定糖基化作用模式的感興趣的蛋白質。優選 地，具有特定的選擇的新的糖基化作用模式的蛋白質具有改善的或改變的生物性質。C.重組IL-18抗體的產生通過本領域公知的各種技術可以制備本發明的抗體。例如，從宿主細胞表達，其中 編碼重鏈和輕鏈的表達載體通過標準技術被轉染導宿主細胞中。各種形式的術語"轉染" 意在包括通常用于將外源DNA導入原核或真核細胞中的各種技術，例如，電穿孔，磷酸鈣沉 淀，DEAE-葡聚糖轉染等。雖然有可能在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但是在 真核細胞中表達是優選的，最優選在哺乳動物宿主細胞中表達抗體，因為這樣的真核細胞 (特別是哺乳動物細胞)比原核細胞更有可能裝配和分泌適當地折疊并具有免疫活性的抗 體。用于表達本發明的重組抗體的優選的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢 細胞(CH0 細胞)(包括 dhfr-CHO 細胞，描述于 Urlaub 和 Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220，與 DHFR 選擇標記物一起使用，例如，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 601-621)所述，NSO 骨髓瘤細胞，COS 細胞和 SP2 細胞。當 將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養足以使 抗體在宿主細胞中表達的時間來制備抗體，或者，更優選地，抗體分泌到宿主細胞在其中生 長的培養基中。利用標準蛋白質純化技術從培養基中回收抗體。宿主細胞還可以用來制備功能抗 體片段，例如Fab片段或scFv分子。理解上述方法中的變化在本發明的范圍內。例如，可 以預期用編碼本發明的抗體的輕鏈和/或重鏈的功能片段的來轉染宿主細胞。還可以利用 重組DNA技術來去除對于與感興趣的抗原結合不是必需的編碼輕鏈和重鏈之一的DNA的一 些或部分。這樣截短的DNA分子表達的分子也包括在本發明的抗體內。另外，可以制備雙 功能抗體，其中一個重鏈和一個輕鏈是本發明的抗體，而另一個重鏈和輕鏈對于感興趣的 抗原之外的抗原是特異性的，通過標準化學交聯方法使本發明的抗體與第二抗體交聯。在本發明抗體或抗原_結合部分的重組表達的優選系統中，通過磷酸鈣介導的轉 染，將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體導入dhfr-CHO細胞。在重組表達載體中， 抗體重鏈和輕鏈基因各自操作連接于CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件，驅動高水平基因 轉錄。重組表達載體還帶有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤篩選/擴增用載體轉染的CHO 細胞的篩選。培養選擇的轉化子宿主細胞讓它表達抗體重鏈和輕鏈，并且從培養基回收完 整抗體。利用標準分子生物技術來制備重組表達載體，轉染宿主細胞，選擇轉化子，培養宿 主細胞，并且從培養基回收抗體。本發明還提供通過在合適的培養基中培養本發明的宿主 細胞直到合成本發明的重組抗體來合成本發明的重組抗體的方法。該方法進一步包括從培養基分離重組抗體。表1是本發明優選的抗-hIL-18抗體的VH和VL區的氨基酸序列的表。在VH區 中，氨基末端(n-末端)的位置1中天然存在的氨基酸是谷氨酸(e)或谷氨酰(q)。但是， 為了在包括vh區的蛋白質的大規模生產中產生帶有同源n-末端的重組蛋白質，n-末端的 位置1優選谷氨酸(e)。表1 VH和VL區的氨基酸序列列表
權利要求
一種能結合人IL 18的分離的抗體或者其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分包含Ig重鏈恒定區，其包含選自SEQ ID NO2、和SEQ ID NO3的氨基酸序列；Ig輕鏈恒定區，其包含選自SEQ ID NO4、和SEQ ID NO5的氨基酸序列；Ig重鏈可變區，其包含SEQ ID NO6的氨基酸序列；和Ig輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO7的氨基酸序列。
2.一種能結合人IL-18的分離的抗體或者其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部 分包含Ig重鏈恒定區，其包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列； Ig輕鏈恒定區，其包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列； Ig重鏈可變區，其包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；和 Ig輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
3.一種能結合人IL-18的分離的抗體或者其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部 分包含Ig重鏈可變區，其包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；和 Ig輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
4.一種分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原結合部分包含 根據權利要求1、2或3的結合蛋白，和其中所述抗體或其抗原結合部分能中和人IL-18。
5.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述IL-18選自人 IL-18原；成熟-人IL-18 ；和截短的-人IL-18。
6.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原 結合部分減小了人IL-18結合其受體的能力。
7.根據權利要求6的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原 結合部分減小了人IL-18原；成熟-人IL-18 ；或截短的-人IL-18結合其受體的能力。
8.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原 結合部分能減小選自下面的人IL-18生物活性中的一種或多種Thl調節；Th2調節；NK調 節；嗜中性白細胞調節；單核細胞_巨噬細胞系調節；嗜中性白細胞調節；嗜酸性細胞調 節；B-細胞調節；細胞因子調節；趨化因子調節；粘著分子調節；和細胞募集調節。
9.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原 結合部分具有選自下面的解離常數(Kd) IO-7M ； 10、； IO-9M ； IO-10M ； IO-12M ；和IO-13M0
10.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分具有選自下面的生成速率=IO2M-1S ―1 ；IO3M-V ； IOW1 ； IO5M-1S-1 ；和lOVs-1。
11.根據權利要求4的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分白具有選自下面的離解速率10_3s 1 ；IO-4S-1 ；IO-5S-1 ；和IO-6S-10
12.—種標記抗體或其抗原結合部分，其包含根據權利要求1、2或3的抗體或其抗原結 合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與可檢測標記物偶聯。
13.根據權利要求12的標記抗體或其抗原結合部分，其中所述可檢測標記物選自放射 性標記物，酶，熒光標記物，發光標記物，生物發光標記物，磁性標記物和生物素。
14.根據權利要求13的標記抗體或其抗原結合部分，其中所述標記物是選自3H,14C,35S，9°Y，99TC，mIn，125I，mI，177LU，166H0，和 153Sm 的放射性標記物。
15.包含根據權利要求1、2或3的抗體或其抗原結合部分的偶聯抗體或其抗原結合部 分，其中所述抗體或其抗原結合部分與治療性或細胞毒性物質偶聯。
16.根據權利要求15的偶聯抗體或其抗原結合部分，其中所述治療性或細胞毒性物質 選自抗_代謝物；烷基化試劑；抗生素；生長因子；細胞因子；抗_血管生成藥物；抗_有絲 分裂物質；蒽環霉素A ；毒素；和編程性細胞死亡劑。
17.編碼權利要求1、2或3的抗體或其抗原結合部分氨基酸序列的分離的核酸。
18.包含權利要求17的分離的核酸的載體。
19.根據權利要求18的載體，其中所述載體選自pcDNA；pTT ； ρΤΤ3 ；pEFBOS ；pBV ； PJV ；和 pBJ0
20.包含權利要求18的載體的分離的宿主細胞。
21.根據權利要求20的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核細胞。
22.根據權利要求21的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
23.根據權利要求20的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真核細胞。
24.根據權利要求23的分離的宿主細胞，其中所述真核細胞選自動物細胞，植物細胞 和真菌細胞。
25.根據權利要求24的分離的宿主細胞，其中所述真核細胞是選自哺乳動物細胞，鳥 類細胞，和昆蟲細胞的動物細胞。
26.根據權利要求25的分離的宿主細胞，其中所述動物細胞是CHO細胞。
27.根據權利要求25的分離的宿主細胞，其中所述宿主細胞是COS。
28.根據權利要求24的分離的宿主細胞，其中所述真核細胞是啤酒糖酵母。
29.根據權利要求25的分離的宿主細胞，其中所述動物細胞是昆蟲Sf9細胞。
30.一種制備結合人IL-18的抗體或其抗原結合部分的方法，該方法包含在足以產生 結合人IL-18的抗體或其抗原結合部分的條件下在培養基中培養權利要求20的宿主細胞 的步驟。
31.一種藥物組合物，其含有權利要求1、2或3的抗體或其抗原結合部分，和藥學可接 受載體。
32.根據權利要求31的藥物組合物，其進一步含有至少一種用于治療其中IL-18活性 是有害的疾病的另外的治療藥物。
33.根據權利要求32的藥物組合物，其中所述另外的藥物選自血管生成抑制劑；激酶 抑制劑；共同-刺激分子阻斷劑；粘著分子阻斷劑；抗-細胞因子抗體或者其功能片段；甲 氨喋呤；皮質類固醇；環孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留類抗炎藥物。
34.一種包含能結合人IL-18的抗原結合結構域的分離的抗體或其抗原結合部分， 其中所述的抗原結合結構域包含具有SEQ ID NO. 6的殘基31-35的⑶R-Hl ；具有SEQ ID NO. 6 的殘基 50-66 的 CDR-H2 ；具有 SEQ ID NO. 6 的殘基 99-110 的 CDR-H3 ；具有 SEQ ID N0. 7 的殘基 24-34 的 CDR-Ll ；具有 SEQ ID NO. :7 的殘基 50-56 的 CDR-L2 ；和具有 SEQ ID N0. 7 的殘基 89-98 的 CDR-L3。
35.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合結構域包括 一個I
36.根據權利要求35的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述Vh包括SEQID NO 6 的氨基酸序列。
37.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合結構域包括一個 VL。
38.根據權利要求37的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述\包括SEQID NO 7的氨基酸序列。
39.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗原結合結構域包括 一個Vh和一個\。
40.根據權利要求39的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述\包括SEQID NO 7 的氨基酸序列，和所述Vh包括SEQ ID NO :6的氨基酸序列。
41.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其進一步包括選自人IgM恒定 區；人IgGl恒定區；人IgG2恒定區；人IgG3恒定；人IgG4恒定區；人IgE恒定區和人IgA 恒定區的重鏈免疫球蛋白恒定區。
42.根據權利要求41的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述重鏈免疫球蛋白恒定 區是人IgGl恒定區。
43.根據權利要求42的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述人IgGl恒定區包括選 自SEQ IDN0. :2，禾口 SEQ IDN0. 3的氨基酸序列。
44.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其進一步包括選自人IgK恒定 區，和人IgX恒定區的輕鏈免疫球蛋白恒定區。
45.根據權利要求44的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述輕鏈免疫球蛋白恒定 區是人IgK恒定區，其包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4。
46.根據權利要求44的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述輕鏈免疫球蛋白恒定 區是包括氨基酸序列SEQ ID NO. 5的人IgX恒定區。
47.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體選自免疫球蛋白 分子，scFv;單克隆抗體；人抗體；嵌合抗體；人源化抗體；Fab片段；Fab'片段；F(ab' )2 ； Fv ； 二硫鍵連接的Fv。
48.根據權利要求47的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述結合蛋白是人抗體。
49.一種分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗原結合部分包 含根據權利要求34-48中任一項的抗體或其抗原結合部分，并且能中和人IL-18。
50.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述IL-18選自人 IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18。
51.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分減小了人IL-18結合其受體的能力。
52.根據權利要求51的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分減小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18結合其受體的能力。
53.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分能減小選自下面的人IL-18生物活性中的一種或多種Thl調節；Th2調節；Nk 調節；嗜中性白細胞調節；單核細胞-巨噬細胞系調節；嗜中性白細胞調節；嗜酸性細胞調 節；B-細胞調節；細胞因子調節；趨化因子調節；粘著分子調節；和細胞募集調節。
54.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其 抗原結合部分具有選自下面的解離常數(Kd) :10_7M ；10、JO-、；10_10M ；IiT11M ；IO-12M ；和 1(Γ13Μ。
55.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分具有選自下面的生成速率=IO2M-1S ―1 ；IO3M-V ； IOW1 ； IO5M-1S-1 ；和lOVs-1。
56.根據權利要求49的分離的中和抗體或其抗原結合部分，其中所述中和抗體或其抗 原結合部分白具有選自下面的離解速率10_3s 1 ；IO-4S-1 ；IO-5S-1 ；和IO-6S-10
57.一種標記抗體或其抗原結合部分，其包含根據權利要求34-48中任一項的抗體或 其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與可檢測標記物偶聯。
58.根據權利要求57的標記抗體或其抗原結合部分，其中所述可檢測標記物選自放射 性標記物，酶，熒光標記物，發光標記物，生物發光標記物，磁性標記物和生物素。
59.根據權利要求58的標記抗體或其抗原結合部分，其中所述標記物是選自3H,14C, 35S，9°Y，99TC，mIn，125I，mI，177LU，166H0jn 153Sm 的放射性標記物。
60.包含根據權利要求34-48中任一項的抗體或其抗原結合部分的偶聯抗體或其抗原 結合部分，其中所述結合蛋白與治療性或細胞毒性物質偶聯。
61.根據權利要求60的偶聯抗體或其抗原結合部分，其中所述治療性或細胞毒性物質 選自抗_代謝物；烷基化試劑；抗生素；生長因子；細胞因子；抗_血管生成藥物；抗_有絲 分裂物質；蒽環霉素A ；毒素；和編程性細胞死亡劑。
62.一種藥物組合物，其含有權利要求34-48中任一項的抗體或其抗原結合部分，和藥 學可接受載體。
63.根據權利要求62的藥物組合物，其進一步含有至少一種用于治療其中IL-18活性 是有害的疾病的另外的治療藥物。
64.根據權利要求63的藥物組合物，其進一步包含至少一種用于治療疾病的另外的 治療藥物，其中所述疾病選自類風濕性關節炎，骨關節炎，幼年型慢性關節炎，萊姆關節 炎，銀屑病關節炎，反應性關節炎，和膿毒性關節炎，脊椎關節病，全身紅斑狼瘡，局限性回 腸炎，潰瘍性結腸炎，腸炎，胰島素依賴性糖尿病，甲狀腺炎，哮喘，變態反應疾病，牛皮癬， 皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排異，急性或慢性的與器官移植相關的免疫疾病， 肉狀瘤病，動脈粥樣硬化，傳播性血管凝固，川崎病，格雷夫斯病，腎病綜合征，慢性疲勞綜 合征，韋格納肉芽腫病，亨諾赫_舍恩萊因紫癜，腎微結節性脈管炎，慢性活性肝炎，眼色素 層炎，膿毒性休克，中毒休克綜合征，膿毒癥綜合征，惡病質，傳染病，由寄生蟲引起的疾病， 后天免疫缺陷綜合征，急性橫向骨髓炎，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，早老性癡呆，中風，原發 肝功能障礙引起的肝硬化，溶血性貧血，惡性腫瘤，心臟衰竭，心肌梗塞，艾迪生病，散發性， I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，施密特綜合征，成人呼吸抑制綜合征，脫發，脫發斑，血清 反應陰性關節病，關節病，賴特病，牛皮癬關節病，潰瘍性結腸關節病，腸滑膜炎，衣菌，鼠疫 和沙門氏菌相關關節病，脊椎關節病，動脈粥樣化疾病/動脈硬化，特應性變態反應，自身 免疫大皰病，尋常性天皰瘡，落葉性天皰瘡，類天皰瘡，線性IgA病，自身免疫溶血性貧血， 庫姆斯陽性溶血性貧血，后天性惡性貧血，少年惡性貧血，肌痛性大腦炎/Royal Free病， 慢性粘膜皮膚念珠菌病，巨細胞關節炎，原發硬化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免 疫缺陷病綜合征，后天性免疫缺陷相關疾病，乙肝，丙肝，普通各式各樣的免疫缺陷，膨脹心肌病，女性不孕癥，卵巢衰竭，早產卵巢衰竭，纖維變性肺病，起因不明的纖維組織形成牙槽炎，炎后間質肺病，間質局限性肺炎，與間質肺病相關的締結組織疾病，與肺病相關的混 合締結組織疾病，與間質肺病相關的全身硬化，與間質肺病相關的類風濕性關節炎，與肺病 相關的全身紅斑狼瘡，與肺病相關的皮膚肌炎/多肌炎，與肺病相關的斯耶格倫病，與肺病 相關的僵硬脊椎炎，結節性脈管炎彌散肺病，與肺病相關的含鐵血黃素沉著病，藥物引起 的間質肺病，輻射纖維化，閉塞性毛細支氣管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴細胞浸潤性肺病， 傳染病后間質肺病，痛風關節炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎，2-型自身免疫肝炎， 自身免疫介導的低血糖，B型胰島素抗性微黑棘皮癥，甲狀旁腺機能減退，與器官移植相關 的急性免疫疾病，與器官移植相關的慢性免疫疾病，骨關節炎，原發硬化膽管炎，1型牛皮 癬，2型牛皮癬，自發性白細胞減少，自身免疫中性白細胞減少，腎病NOS，腎小球腎炎，腎 microscopic vasulitis,萊姆病，盤形紅斑狼瘡，特發性男性不孕癥或N0S，精液自身免疫 性，多發性硬化，交感神經眼炎，締結組織疾病繼發性肺高血壓，古德帕斯徹綜合征，結節性 多動脈炎肺動，急性風濕性發燒，類風濕性脊椎炎，斯蒂爾病，全身硬化，斯耶格倫綜合征， Takayasu' s病/動脈炎，自身免疫血小板減少，特發性血小板減少，自身免疫甲狀腺病，甲 狀腺機能亢進，甲狀腺腫自身免疫甲狀腺機能亢進，萎縮性自身免疫甲狀腺機能亢進，原發 性粘液水腫，晶體抗原性葡萄膜炎，原發性結節性脈管炎，白癜風，急性肝病，慢性肝病，酒 精性肝硬化，酒精引起的肝損傷，choleosatatis，特應性肝病，藥物引起的肝炎，非酒精性 脂肪性肝炎，變應性變態反應和哮喘，B族鏈球菌感染，精神病，Th2型和Thl型介導的疾病， 急性和慢性疼痛，和癌癥。
65.權利要求63的藥物組合物，其中所述另外的藥物選自血管生成抑制劑；激酶抑制 齊U ；共同-刺激分子阻斷劑；粘著分子阻斷劑；抗_細胞因子抗體或者其功能片段；甲氨喋 呤；皮質類固醇；環孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留類抗炎藥物。
66.根據權利要求34的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部 分結合人IL-18，但是不能與125-2Η和IL-18BP競爭結合人IL-18。
67.包括根據權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分的結晶抗體或 其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分以晶體存在。
68.根據權利要求67的結晶抗體或其抗原結合部分，其中所述晶體是沒有載體的藥學 控制釋放晶體。
69.根據權利要求67的結晶抗體或其抗原結合部分，其中所述結晶抗體或其抗原結合 部分具有比所述結合蛋白可溶性配對物更大的體內半存留期。
70.根據權利要求67的結晶抗體或其抗原結合部分，其中所述結晶抗體或其抗原結合 部分保留其生物活性。
71.一種用于釋放抗體或其抗原結合部分的組合物，所述組合物含有(a)一種制劑，其中所述制劑含有根據權利要求67-70中任一項的結晶抗體或其抗原 結合部分，和一種成分；和(b)至少一種聚合物載體。
72.根據權利要求71的組合物，其中所述聚合物載體是選自下面的一種或多種的聚合 物聚丙烯酸，聚氰基丙烯酸酯，聚氨基酸，聚酸酐，聚縮肽，聚酯，聚乳酸，聚乳酸-共-羥基 乙酸或PLGA，聚b-羥基丁酸，聚γ-己內酯，聚二氧六環酮；聚乙二醇，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚有機磷腈，聚原酯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，馬來酸酐-烷基乙烯基醚共聚物， 多聚醇，白蛋白，藻酸鹽，纖維素和纖維素衍生物，膠原，纖維蛋白，明膠，透明質酸，低聚糖， glycaminoglycans，硫酸多糖，它們的混合物和它們的共聚物。
73.根據權利要求71的組合物，其中所述成分選自白蛋白，蔗糖，海藻糖，乳糖醇，明 膠，羥丙基_環糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
74.權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分在制備用于減小人 IL-18活性的藥物中的用途。
75.權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分在制備用于對患有其中 IL-18活性是有害的疾病的人患者減小人IL-18活性的藥物中的用途。
76.權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分在制備用于對患有其中 IL-18活性是有害的疾病或病癥的受治療者進行治療的藥物中的用途。
77.根據權利要求76的用途，其中所述疾病選自類風濕性關節炎，骨關節炎，幼年型 慢性關節炎，萊姆關節炎，銀屑病關節炎，反應性關節炎，和膿毒性關節炎，脊椎關節病，全 身紅斑狼瘡，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，腸炎，胰島素依賴性糖尿病，甲狀腺炎，哮喘，變 態反應疾病，牛皮癬，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移植排異，急性或慢性的與器官移 植相關的免疫疾病，肉狀瘤病，動脈粥樣硬化，傳播性血管凝固，川崎病，格雷夫斯病，腎病 綜合征，慢性疲勞綜合征，韋格納肉芽腫病，亨諾赫-舍恩萊因紫癜，腎微結節性脈管炎，慢 性活性肝炎，眼色素層炎，膿毒性休克，中毒休克綜合征，膿毒癥綜合征，惡病質，傳染病，由 寄生蟲引起的疾病，后天免疫缺陷綜合征，急性橫向骨髓炎，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，早老 性癡呆，中風，原發肝功能障礙引起的肝硬化，溶血性貧血，惡性腫瘤，心臟衰竭，心肌梗塞， 艾迪生病，散發性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，施密特綜合征，成人呼吸抑制綜合征，脫 發，脫發斑，血清反應陰性關節病，關節病，賴特病，牛皮癬關節病，潰瘍性結腸關節病，腸滑 膜炎，衣菌，鼠疫和沙門氏菌相關關節病，脊椎關節病，動脈粥樣化疾病/動脈硬化，特應性 變態反應，自身免疫大皰病，尋常性天皰瘡，落葉性天皰瘡，類天皰瘡，線性IgA病，自身免 疫溶血性貧血，庫姆斯陽性溶血性貧血，后天性惡性貧血，少年惡性貧血，肌痛性大腦炎/ Royal Free病，慢性粘膜皮膚念珠菌病，巨細胞關節炎，原發硬化肝炎，起因不明自身免疫 肝炎，后天性免疫缺陷病綜合征，后天性免疫缺陷相關疾病，乙肝，丙肝，普通各式各樣的免 疫缺陷，膨脹心肌病，女性不孕癥，卵巢衰竭，早產卵巢衰竭，纖維變性肺病，起因不明的纖 維組織形成牙槽炎，炎后間質肺病，間質局限性肺炎，與間質肺病相關的締結組織疾病，與 肺病相關的混合締結組織疾病，與間質肺病相關的全身硬化，與間質肺病相關的類風濕性 關節炎，與肺病相關的全身紅斑狼瘡，與肺病相關的皮膚肌炎/多肌炎，與肺病相關的斯耶 格倫病，與肺病相關的僵硬脊椎炎，結節性脈管炎彌散肺病，與肺病相關的含鐵血黃素沉著 病，藥物引起的間質肺病，輻射纖維化，閉塞性毛細支氣管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴細胞浸 潤性肺病，傳染病后間質肺病，痛風關節炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎，2-型自身 免疫肝炎，自身免疫介導的低血糖，B型胰島素抗性微黑棘皮癥，甲狀旁腺機能減退，與器官 移植相關的急性免疫疾病，與器官移植相關的慢性免疫疾病，骨關節炎，原發硬化膽管炎， 1型牛皮癬，2型牛皮癬，自發性白細胞減少，自身免疫中性白細胞減少，腎病N0S，腎小球腎 炎，腎microscopic vasulitis,萊姆病，盤形紅斑狼瘡，特發性男性不孕癥或N0S，精液自 身免疫性，多發性硬化，交感神經眼炎，締結組織疾病繼發性肺高血壓，古德帕斯徹綜合征，結節性多動脈炎肺動，急性風濕性發燒，類風濕性脊椎炎，斯蒂爾病，全身硬化，斯耶格倫綜 合征，Takayasu' s病/動脈炎，自身免疫血小板減少，特發性血小板減少，自身免疫甲狀 腺病，甲狀腺機能亢進，甲狀腺腫自身免疫甲狀腺機能亢進，萎縮性自身免疫甲狀腺機能亢 進，原發性粘液水腫，晶體抗原性葡萄膜炎，原發性結節性脈管炎，白癜風，急性肝病，慢性 肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的肝損傷，choleosatatis，特應性肝病，藥物引起的肝炎，非 酒精性脂肪性肝炎，變應性變態反應和哮喘，B族鏈球菌感染，精神病，Th2型和Thl型介導 的疾病，急性和慢性疼痛，和癌癥。
78.根據權利要求77的用途，其中所述成人呼吸抑制綜合征是成人急性呼吸抑制綜合征。
79.根據權利要求77的用途，其中所述普通各式各樣的免疫缺陷是普通各式各樣的血 丙種球蛋白減少。
80.根據權利要求77的用途，其中所述1-型自身免疫肝炎是典型自身免疫或狼瘡樣肝炎。
81.根據權利要求77的用途，其中所述2-型自身免疫肝炎是抗-LKM抗體肝炎。
82.根據權利要求77的用途，其中所述甲狀腺腫自身免疫甲狀腺機能亢進是橋本病。
83.根據權利要求77的用途，其中所述精神病選自抑郁癥或精神分裂癥。
84.權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分和第二種藥物在制備用 于對患有其中IL-18是有害的疾病的患者進行治療的藥物中的用途，其中包括在施用第二 種藥物之前，同時，或之后對患者施用權利要求1-11和34-56中任一項的抗體或其抗原結 合部分的步驟，其中所述第二種藥物選自能結合人IL-12的抗體，或其片段；甲氨喋呤；能 結合人TNF的抗體，或其片段；皮質類固醇；環孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留類抗炎藥 物。
85.一種用于在體外減小人IL-18的方法，該方法包含將人IL-18與權利要求1_11和 34-56中任一項的抗體或其抗原結合部分接觸的步驟，以便減小人IL-18活性。
全文摘要
本發明涉及IL-18結合蛋白，特別是結合人白介素-18(hIL-18)的抗體。具體地說，本發明涉及全人抗體的抗體。優選地，抗體具有體外和體內對于hIL-18的高親和性和/或中和hIL-18的性質。本發明的抗體可以是全長抗體或者其抗原結合部分。還提供了本發明抗體的制備方法和使用方法。本發明的抗體或抗體部分用于對例如患有其中hIL-18活性是有害的疾病的人受治療者檢測hIL-18和用于抑制hIL-18活性。
文檔編號G01N33/68GK101948539SQ20101027398
公開日2011年1月19日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月12日
發明者B·拉布科夫斯基, B·赫德伯格, J·S·康, J·W·沃斯, J·巴布庫克, J·韋勒, L·格林, T·加于爾, X·-C·賈 申請人:雅培制藥有限公司