一種可細胞原位包覆的多孔凍凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一類新型可細胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備方法：雙鍵功能化的高分子溶解到甘油或者二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液中，將細胞均勻分散到此溶液中，緩慢冷凍，然后交聯形成細胞原位包覆的多孔凍凝膠。本發明還公開了上述制備方法所制得的多孔凍凝膠。所制備的多孔凍凝膠，具有良好的生物相容性、高彈性和貫通孔結構，可以作為細胞載體和組織工程/修復支架材料等，在生物醫學材料領域有廣泛的用途。
【專利說明】
一種可細胞原位包覆的多孔凍凝膠及其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一類新型多孔凍凝膠細胞載體的制備，屬于生物醫學材料領域。
【背景技術】
[0002]近幾十年中，多孔高分子材料在疾病的診斷及治療、再生醫學以及組織器官的修復或替換等領域表現出廣泛的應用前景，其研究也越來越來受到人們的重視。聚合物凍凝膠由于具有良好的生物相容性、滲透性、貫通孔結構以及高彈性等特性，在細胞載體、醫用敷料、組織工程支架等生物醫用領域得到了廣泛的應用。
[0003]目前凍凝膠制備過程中通常采用純水或者磷酸緩沖溶液作為溶劑，冷凍過程不利于細胞的存活。現在報道的凍凝膠支架需要預先制備，然后再進行細胞的種植，但是這種細胞負載方式會造成凍凝膠內部細胞分布不均勻，進而導致組織再生不均勻，影響再生組織的形狀及功能。
[0004]細胞凍存是細胞保存的主要方法，可以實現細胞的長期存活。細胞凍存液中含有的甘油或二甲基亞砜能夠提高細胞膜對水的通透性，緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。將細胞凍存液用作大分子單體的溶劑，不僅可以降低凍凝膠制備中的冷凍過程對細胞的損傷，也可以實現細胞在凍凝膠中的均勻分布。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的問題在于提供一種可以完成細胞均勻包覆、同時具有良好的吸水性和高彈性以及貫通孔結構的生物相容性凍凝膠及其制備方法。
[0006]本發明多孔凍凝膠的制備方法的技術方案是:雙鍵功能化的高分子(例如:聚乙二醇，殼聚糖，透明質酸，硫酸軟骨素，明膠等)溶液在冷凍狀態下交聯，形成具有多孔結構的凍凝膠，具體為:
(1)雙鍵功能化的高分子(聚乙烯醇或者透明質酸或者殼聚糖或者明膠)的合成:高分子溶解在磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入N，N-二甲基甲酰胺，攪拌均勻，然后加入催化劑(三乙胺或者二甲氨基吡啶)，攪拌均勻后加入一定量的甲基丙烯酸縮水甘油酯，聚合物和三乙胺(或者二甲氨基吡啶)的摩爾比為1:5?100，三乙胺(或者二甲氨基吡啶)與甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1:1。3 7 ° C攪拌I?15天，透析，凍干，得到雙鍵功能化的高分子；
(2)雙鍵功能化的聚乙二醇(PE⑶A)合成:將聚乙二醇溶解在甲苯中，120?160攝氏度回流半小時以上，共沸除水，冷卻到室溫，然后加入催化劑碳酸鉀或碳酸鈉或三乙胺，再加入丙烯酰氯，聚乙二醇和丙烯酰氯的摩爾比為1:2?12，20?60攝氏度下反應5?24小時，抽濾，在過量乙醚中重沉淀，得到PEGDA ；
(3)細胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備:將細胞均勻分散到上述功能化高分子的細胞凍存液溶液中，然后與氧化還原聚合引發劑混合均勻，緩慢低溫冷凍，冷凍反應6?24小時；或者和光聚合引發劑，緩慢低溫冷凍，紫外光照5分鐘，得到多孔凍凝膠。
[0007]所述的氧化還原聚合引發劑為過硫酸胺/四甲基二乙胺。
[0008]所述的光引發劑為2-輕基-4’-(2-輕乙氧基)-2_甲基苯丙酮。
[0009]所述的細胞凍存液為甘油或二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液，其中甘油或二甲基亞砜的體積濃度為5%?15%，血清的體積濃度為10%?80%。
[0010]本發明還公開了上述合成方法所制得的多孔凍凝膠。
[0011]本發明同時還公開了上述合成方法所制得的多孔凍凝膠可以作為細胞載體和組織工程支架材料。
[0012]透明質酸和硫酸軟骨素是在體內很多組織存在的一種生物材料，在體內可生物降解;殼聚糖和明膠也是具有良好生物相容性的天然高分子材料。聚乙二醇(PEG)是Π)Α批準的可用于體內的具有生物惰性的生物材料，它在體內不會引起凝血反應，通過腎臟排出體內。細胞凍存是可以實現細胞長期存活保存方法。采用以上材料結合細胞凍存過程制備新型多孔凍凝膠，不僅具有具有良好的生物相容性，還實現了細胞在多孔凍凝膠支架中的均勻分布，它的貫通孔結構有利于細胞的生長、增殖、分化以及細胞外基質的沉積，其可以作為細胞載體和組織工程/修復支架材料等，具有有益的技術效果和廣泛應用前景。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1所得的雙鍵功能化的透明質酸的核磁共振氫譜；圖2為實施例2所得的雙鍵功能化的聚乙二醇的核磁共振氫譜；圖3為實施例1所得的多孔凍凝膠中的MSC的活-死細胞雙重染色；圖4為實施例5所得的多孔凍凝膠中的MSC的活-死細胞雙重染色。
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例對本發明做進一步說明。
[0016]實施例1:0.5 g透明質酸鈉(HA)完全溶解到100 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天，透析，凍干，得到雙鍵功能化透明質酸(HAGMA)j_1.0 mL二甲基亞砜和4.0 mL胎牛血清溶解到5.0 mL磷酸緩沖溶液中制得細胞凍存液。將0.04 g的HAGMA溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將小鼠骨髓間充值干細胞(MSC)均勻分散到混合溶液中，將MSC懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。體外培養24小時后對其進行活-死細胞雙重染色。
[0017]實施例2:2.0 g數均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應30分鐘后，于45攝氏度反應過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進一步抽濾、干燥，再溶解到20 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA。將0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和30%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入過硫酸胺/四甲基二乙胺，然后將小鼠骨髓間充值干細胞(MSC)均勻分散到混合溶液中，再將MSC懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍，反應過夜，然后將反應體系放置到37 °(:的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0018]實施例3:0.5 g硫酸軟骨素鈉(CS)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的硫酸軟骨素鈉(CSGMA)；將0.08 g的CSGMA溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0019]實施例4:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA);將0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和40%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入過硫酸胺/四甲基二乙胺，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，再將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍，反應24小時，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0020]實施例5:0.5 g透明質酸鈉(HA)溶解在100 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到HAGMA; 6 g明膠(GeIatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和20 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.03 g的HAGMA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。體外培養24小時后對其進行活-死細胞雙重染色。
[0021]實施例6:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA);將0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和30%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0022]實施例7:2.0 g數均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應30分鐘后，于45攝氏度反應過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進一步抽濾、干燥，再溶解到20 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA。將0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和50%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0023]實施例8:1.0 g數均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應30分鐘后，于45攝氏度反應過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進一步抽濾、干燥，再溶解到10 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA;5 g明膠(Gelatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.1 g的PEGDA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
[0024]實施例9:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA) ;5 g明膠(Gelatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.1 8的01^083-6嫩和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在I.0 mL細胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應體系放置到37 °C的培養基中，得到負載細胞的多孔凍凝膠。
【主權項】
1.一種可細胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備，其特征是:雙鍵功能化的高分子(例如:聚乙二醇，殼聚糖，透明質酸，硫酸軟骨素，明膠等)溶液在冷凍狀態下交聯，形成具有多孔結構的凍凝膠，具體為: 將細胞均勻分散到雙鍵功能化高分子的細胞凍存液溶液中，然后與氧化還原聚合引發劑混合均勻，緩慢低溫冷凍，冷凍反應2?24小時;或者和光聚合引發劑，緩慢低溫冷凍，紫外光照5分鐘，得到多孔凍凝膠。2.根據權利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:所述的自由基聚合引發劑為過硫酸胺/四甲基二乙胺;光聚合引發劑為2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮。3.根據權利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:所述的細胞凍存液為甘油或者二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液，其中甘油或二甲基亞砜的體積濃度為5%?15%，血清的體積濃度為10%~40%。4.根據權利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:雙鍵功能化的高分子溶液的濃度為2%?20% (g/mL)。5.權利要求1所述的制備方法制得的凍凝膠。6.權利要求5所述的凍凝膠在細胞載體以及組織工程支架材料上的應用。
【文檔編號】C08J3/075GK106075599SQ201610523925
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】范長江
【申請人】青島大學