專利名稱：微藻油脂提取方法
技術領域：
本發明涉及微藻的加工方法，具體而言，本發明涉及微藻油脂提取方法。
背景技術：
微藻是一類個體微小的光能自養和/或異養型單細胞生物，具有分布廣泛、種類繁多、光合效率高、生長速度快、適應性強等特點。微藻每年固定的CO2約占全球凈光合產量的40%，再加上其富含脂類、烴類、蛋白、可溶性多糖，以及蝦青素、β-胡蘿卜素等高價值天然色素，因此在環保、能源和健康等問題備受矚目的今天，微藻越來越受到人們的關注。微藻養殖完成后，要對進行收集、干燥、破壁與提取等處理以獲得微藻藻油。由于微藻具有纖維素性細胞壁,某些種類的微藻細胞壁厚、質地堅硬,在對微藻藻油進行提取前需進行破壁處理以提高藻油提取率。傳統的微藻破壁方法很多，如傳統上的機械粉碎、凍融、超聲波、膠體磨等物理方法和生物酶解方法等。近幾年先后提出了氣爆法、高壓均質和超高速氣體粉碎法等。但上述方法都存在明顯的缺點，或用時較長、或溫度較高、或粉碎效果不佳、或沒有有效保護生物活性成分。結果導致細胞壁破壁效率低下以及生物活性成分損失嚴重。專利2008 10047859公開了一種利用生物酶法破壁，生產二十二碳六烯酸油脂的方法，在該方法中將蛋白酶和非蛋白酶同時加入、同時參與酶解反應，由于非蛋白酶本身也是蛋白質，因此在實際使用中，各種蛋白酶也會分解破壞其他生物酶，導致破壁效率大幅降低。
發明內容
由于現有技術中的用于微 藻破壁的生物酶法具有破壁效率低的缺點，因此針對該缺點，本發明提出了一種新的微藻破壁方法，該方法主要分為兩個步驟，第一步先以酸為催化劑，向密閉反應容器通入蒸汽，微藻細胞壁和胞間質在較高溫度與壓力下充分活化；第二步加入纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等生物酶，在其最適溫度下將絕大部分多糖、蛋白質繼續水解為小分子單糖、氨基酸。微藻細胞壁結構被徹底破壞，胞內油脂與其他組分徹底分開，水解產物極易分層為油相、固相和水相，其中在第二步中，先加入非蛋白酶，反應一段時間，再加入蛋白酶反應一段時間，由于蛋白酶不干擾非蛋白酶的作用效果，因此相比于現有技術，本發明提供的方法破壁效率更高。蛋白酶，也稱為蛋白水解酶，是水解蛋白質肽鍵的一類酶的總稱。常見的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。本文中的蛋白酶是包括多種常見的蛋白酶的復合物。本文中的生物酶包括蛋白酶和非蛋白酶，其中非蛋白酶是指除蛋白酶之外的其他生物酶，包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、蝸牛酶等生物酶中的一種或多種。根據本發明的一個方面，提供了一種微藻破壁方法，包括調節微藻藻液的pH值，加熱加壓處理，隨后恢復到常壓狀態，加入生物酶混合，所述生物酶分兩步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。在上述方法中，將pH值調節為1.5 6.5，優選調節為1.5 3。在上述方法中，其中加熱溫度為100 150°C，優選加熱到120 150°C，加壓到
0.1 0.5MPa，優選加壓到0.1 0.3MPa，保持加熱加壓狀態I 120分鐘，優選保持加壓加熱狀態I 10分鐘。在上述方法中，其中在加入生物酶混合的步驟中，在30 50°C的反應溫度下，先加入非蛋白酶，混合4 48小時,優選為4 6小時,再加入蛋白酶,混合4 48小時,優選為4 6小時。根據一個優選的實施方式，在上述方法中，pH值為1.5 3,藻液加熱到120 150°C，加壓到0.1 0.3MPa，加壓加熱狀態保持I 10分鐘，非蛋白酶和蛋白酶的混合時間分別為4 10小時。在上述方法中，根據微藻種類的不同，各個溫度、壓力條件以及反應時間可以適當調整。根據本發明的一個具體實施方式
，其中調節pH值的步驟通過加入無機酸或有機酸或者通入含酸性氧化物的氣體實施，其中優選的無機酸為稀硫酸、鹽酸、或稀硝酸，優選的有機酸為醋酸。優選的酸性氧化物包括二氧化碳、硫氧化物、氮氧化物中的一種或者多種。其中優選的硫氧化物包括二氧化硫和/或三氧化硫。氮氧化物包括一氧化二氮(N2O)、一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)、三氧化二氮(N2O3)、四氧化二氮(N2O4)和五氧化二氮(N2O5)中的一種或者多種，優選的氮氧化物包括一氧化氮和/或二氧化氮。根據本發明的優選實施方式，在上述方法中，其中含酸性氧化物的氣體優選為電廠煙道氣，電廠煙道氣是燃煤或燃氣熱電廠由煙道排出的廢氣，成分為氮氣、二氧化碳、氧和水蒸氣和硫化物等，使用含酸性氧化物的氣體如電廠煙道氣降低藻液PH值，由于多余氣體可以從藻液中蒸出，因此不僅有利于前一階段微藻的養殖，而且基本無化學污染，減輕后一階段廢水處理的難度。根據本發明的一個具體實施方式
，其中在加熱加壓步驟中，通過連續進料出料或者批次進料的方式將酸性藻液導入壓力反應罐中，然后向罐中通入水蒸氣實現加熱加壓，使用蒸汽加熱加壓，升溫快，成本低廉。根據本發明的一個具體實施方式
，其中通過同批加入或者分批加入的方式加入非
蛋白酶。根據本發明的一個具體實施方式
，其中混合步驟通過慢速攪拌或泵回流循環的方式實施。其中慢速攪拌的速度為30rpm 120rpm，在酶處理過程中，不需連續攪拌，只需不定時攪拌或不定時泵打回流即可，耗能少。根據本發明的一個具體實施方式
，在上述方法中，其中在加入生物酶的步驟之后還包括加入有機溶劑提取微藻油脂的步驟，其中優選的有機溶劑為正己烷。本文中的微藻可以為柵藻(Scenedesmus sp.)、綠球藻(Chlorococcum sp.)、綠
藻、輪藻、甲藻、金藻、或硅藻等。 根據本發明的一個具體實施方式
，本發明提供了一種以稀酸水解和酶水解為基礎，低成本、低能耗的濕藻快速破壁并直接獲取油脂的方法，該方法具體為將含油微藻采收后得到濃度為10g/L 400g/L的濕藻液，向藻液加入一定量無機酸或有機酸，或通入含酸性氧化物的氣體(如含有C02、SOx, NOx的氣體)，降低藻液pH值至1.5 6.5，將此酸性藻液導入耐酸耐高溫的壓力反應罐中，向反應罐通入蒸汽，使溫度達到100°C 150°C，壓力達到0.1MPa 0.5MPa，并維持I 120min。可以采用連續進料出料的方式，亦可批次進罐后加以充分攪拌。此時組成微藻細胞壁與細胞間物質在稀酸與高溫高壓的作用下充分軟化、疏松。常壓下，向反應罐內已軟化疏松的藻細胞加入生物酶，生物酶可包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、蛋白酶、蝸牛酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶等各種酶，除蛋白酶外其他所有酶可同批或分批加入，蛋白酶須在其他酶作用一段時間后再加入。反應溫度在30°C 50°C，使用慢速攪拌或泵回流循環的方式充分混合，將全部或部分藻細胞壁與胞間質分解為水溶性小分子。通入少量溶劑如正己烷，充分攪拌，即可分層為油-有機相、和水相，分離油-有機相得到微藻油脂；或不加溶劑，直接分離油相與水相得到微藻油脂。本發明提供的微藻破壁方法具有以下優點:I)使用生物酶處理濕藻時，蛋白酶在非蛋白酶作用一段時間后再加入，各種蛋白酶不會分解破壞其他生物酶，導致破壁效率大幅升高，與同時加入蛋白酶和其他非蛋白酶的方法相比，破壁效率明顯提高，從而導致油脂提取率和產率明顯提高。2)使用酸與酶做催化劑，因此破壞濕藻細胞壁所需時間少。3)只需要水解纖維素為短鏈多糖，而不需要熱解成烴類，因此對溫度和壓力要求不聞。4)處理工藝是水解過程，因此原料可以是濕藻，而不必耗費能量預先烘干，能耗極低。5)使用蒸汽加熱加壓，升溫快，成本低廉。6)酶處理時不用連續攪拌，只需不定時攪拌或不定時泵打回流即可，耗能少。
7)使用含酸性氧化物的氣體如電廠煙道氣降低藻液pH值，不僅有利于前一階段微藻的養殖，而且基本無化學污染，減輕后一階段廢水處理的難度。
圖1示出在使用生物酶處理微藻藻液時，蛋白酶與非蛋白酶的加入方式對藻油提取率的影響，其中A組表示同時加入蛋白酶與非蛋白酶的情況，B組表示先加入非蛋白酶反應一段時間之后再加入蛋白酶的情況。圖2示出酸化、加熱加壓以及酶解條件對藻油提取率的影響。
具體實施例方式下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。破壁后藻油提取率和產率的測試方法如下:取少量未處理藻泥置烘箱105°C下烘干，按氣相色譜法測定脂肪本底值( ，取提油后藻渣置烘箱105°C下烘干，按氣相色譜法測定脂肪含量Cs，按氣相色譜法測定提取毛油中的脂肪含量為提取用藻的干重質量(g)，ms為提取后藻渣的干重質量(g)，m_為提取得到的毛油的質量(g);根據公式提取率=(C藻Xm藻-C渣Xm渣)/C藻Xm藻計算提取率,根據公式產率=(C毛油Xm毛油)/C藻Xm藻計算產率。實施例1使用濕藻進行油脂提取，藻種為一種綠球藻。設計A、B兩個實驗組，每組3個平行樣，每個樣品取30g濕藻，根據含水量調節濕藻的最終濃度至100g/L。向A、B兩組均加入稀硫酸直至pH值為2，均用封瓶膜封口，135°C，0.2MPa處理Imin ;再向A組加入酸性纖維素酶0.lg、酸性果膠酶0.02g、酸性蛋白酶0.05g，40°C、120rpm振蕩混旋12h ；B組加入酸性纖維素酶0.1g,酸性果膠酶0.02g, 40°C、120rpm振蕩混旋6h，再加入酸性蛋白酶0.05g,40°C、120rpm繼續振蕩混旋6h。將各藻樣置于500mL三角瓶中，按1: 10 (藻干重/溶劑，DWg/mL)加入正己烷，在50°C下水浴充分攪拌浸提20min，3000rpm離心3min，將上層液轉移出來；重復此步驟三次。合并上層液，經濾紙過濾后用旋轉蒸發儀蒸出溶劑，得到毛油。按照上述破壁后藻油提取率和產率的測試方法測試藻油提取率和產率，其中C薇、Cs、ms、ms、的具體數值見下表1，經計算，A組的藻油提取率和產率分別為49.48%和61.50%，B組的藻油提取率和產率分別為81.14%和96.32%, A組與B組的比較結果參見圖1，從圖1看出，從油脂提取率和產率看，B組的油脂提取率和產率大于A組。因此使用生物酶處理濕藻時，蛋白酶在其他酶作用一段時間后再加入，破壁效果明顯好于蛋白酶開始就與其他酶混合作用。表I`
權利要求
1.一種微藻油脂提取方法，包括調節微藻藻液的PH值，加熱加壓處理，隨后恢復到常壓狀態，加入生物酶混合，所述生物酶分兩步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其中將pH值調節為1.5 6.5，優選調節為1.5 3。
3.根據權利要求2所述的方法，其中調節pH值的步驟通過加入無機酸或有機酸或者通入含酸性氧化物的氣體實施。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述無機酸為稀硫酸、鹽酸、或稀硝酸，所述有機酸為醋酸，所述酸性氧化物包括二氧化碳、硫氧化物、電廠煙道氣、氮氧化物中的一種或者多種。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的方法，其中加熱溫度為100 150°C，優選加熱到120 150°C，加壓到0.1 0.5MPa，優選加壓到0.1 0.3MPa，保持加熱加壓狀態I 120分鐘，優選保持加壓加熱狀態I 10分鐘。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的方法，其中，在加入生物酶混合的步驟中，在30 50°C的反應溫度下，先加入非蛋白酶，混合4 48小時，優選為4 6小時，再加入蛋白酶，混合4 48小時，優選為4 6小時。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述非蛋白酶包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、蝸牛酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶中的一種或多種。
8.根據權利要求1所述的方法，其中通過同批加入或者分批加入的方式加入非蛋白酶。
9.根據權利要求1所述的方法 ，其中加入生物酶混合的步驟通過慢速攪拌或泵回流循環的方式實施，其中所述慢速攪拌的速度為30rpm 120rpm。
10.根據權利要求1所述的方法，其中在加入生物酶混合的步驟之后還包括加入有機溶劑提取微藻油脂的步驟。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述微藻為柵藻、綠球藻、綠藻、輪藻、甲藻、金藻、或硅藻。
全文摘要
本發明提供了一種微藻油脂提取方法，包括調節微藻藻液的pH值，加熱加壓處理，隨后恢復到常壓狀態，加入生物酶混合，所述生物酶分兩步加入，先加入非蛋白酶，再加入蛋白酶。根據本發明提供的方法，使用生物酶處理濕藻時，在非蛋白酶作用一段時間后再加入蛋白酶，非蛋白酶不會被蛋白酶分解破壞，導致破壁效率大幅升高，與同時加入蛋白酶和非蛋白酶的方法相比，破壁效率明顯提高，從而導致油脂提取率和產率明顯提高。
文檔編號C11B1/02GK103173273SQ20111043319
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者馬欣欣, 劉敏勝, 石蕾, 楊巧利, 杜彥山 申請人:新奧科技發展有限公司